向 海 鐘榮珍

(1.中國科學院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，吉林省草地畜牧重點實驗室，長春130102； 2.中國科學院大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學學院，北京100049)

反芻家畜，主要包括牛、綿羊和山羊，對全球的糧食與經(jīng)濟作出了重大貢獻，特別是對中低收入的國家而言[1]。胃腸道線蟲(gastrointestinal nematode，GIN)感染是導致反芻家畜生產(chǎn)力下降的重要因素[2]。Charlier等[3]調(diào)查了18個歐洲國家的反芻家畜每年因寄生蟲感染而付出的經(jīng)濟代價，其中法國因寄生蟲感染造成的年經(jīng)濟損失高達4.4億歐元。中國目前尚無此類數(shù)據(jù)統(tǒng)計。反芻動物(牛、綿羊和山羊)中常見的GIN見表1[4]，其中毛圓科血矛屬捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchuscontortus)是感染反芻動物的最主要的GIN之一，它主要寄生在反芻動物皺胃和小腸，以皺胃為主[5]。Haemonchuscontortus生活周期包括體外自由生活和體內(nèi)寄生生活2個階段，其蟲卵經(jīng)過5次蛻皮成為成蟲，綿羊通過攝取具有感染性的L3期幼蟲而被感染，L3期幼蟲被宿主動物攝食，在宿主皺胃中發(fā)育成L4期幼蟲后成為成蟲，然后形成吸血習性，導致宿主嚴重貧血并伴隨采食量下降、生產(chǎn)力下降、營養(yǎng)物質(zhì)代謝改變，甚至死亡[6]。

表1 反芻動物(牛、綿羊和山羊)中常見的胃腸道線蟲

在GIN感染期間觀察到的動物生產(chǎn)力下降的主要原因是，機體組織內(nèi)的營養(yǎng)利用和分配發(fā)生了明顯變化：寄生宿主采食量明顯減少，同時機體用于宿主自身生產(chǎn)組織(如骨骼肌)的蛋白質(zhì)(氨基酸)數(shù)量減少，而用于修復受損組織和啟動免疫反應所需的蛋白質(zhì)(氨基酸)數(shù)量明顯增加，進而導致宿主全身的蛋白質(zhì)(氨基酸)代謝發(fā)生相應變化[7]。

1 GIN感染改變宿主羊采食行為

GIN感染對宿主的首要影響是造成宿主采食量下降，出現(xiàn)厭食的現(xiàn)象。厭食癥已經(jīng)在許多寄生宿主上被發(fā)現(xiàn)，如小鼠[8]、馴鹿[9]以及綿羊[10-11]，其中綿羊的采食量下降30%～60%[12]。厭食癥也許可以被理解為一種宿主對寄生線蟲的適應性行為：當宿主感染GIN時，宿主會適當增加含有抵抗GIN的活性成分的物質(zhì)的攝入，并減少對GIN生長有利的物質(zhì)的攝入[13]。另外，當宿主可以在不同營養(yǎng)水平的食物中進行選擇時，它們會選擇質(zhì)量更好的食物來彌補因GIN定植發(fā)育而損失的營養(yǎng)，如高蛋白質(zhì)飼糧[14]。同時，宿主也傾向于采食更有利于驅(qū)除寄生蟲而提高自身對寄生蟲抗性的飼糧[15-16]。

這種由GIN導致宿主的厭食癥可能是通過改變胃腸激素水平進行調(diào)節(jié)的，其中血清胃泌素水平升高和自愿采食量減少之間有很強的聯(lián)系[17]。Fox等[18]的研究初步證實了血清胃泌素水平升高與采食量降低之間的關(guān)系，當使用胃酸分泌抑制劑奧美拉唑(omeprazole)間接提高內(nèi)源性血清胃泌素水平時，未感染的動物的食欲下降了40%，其值與感染動物相當。GIN感染時，宿主往往伴有明顯的高胃泌素血癥，因此這種胃黏膜破損而導致反芻動物血清胃泌素水平升高的現(xiàn)象，可作為GIN感染亞臨床疾病的診斷工具[19]。

與胃泌素相互作用并調(diào)節(jié)宿主厭食癥的潛在神經(jīng)內(nèi)分泌遞質(zhì)包括胃促生長素和瘦素。胃促生長素的分泌受到胃泌素的抑制，胃促生長素可以穿過血腦屏障并與大腦中的受體結(jié)合，導致下丘腦中的神經(jīng)元細胞分泌的一種強有力的飼料攝取刺激物神經(jīng)肽Y；另外，血清胃泌素水平的升高可能通過上調(diào)瘦素的合成，導致血清瘦素水平增加，從而降低神經(jīng)肽Y的合成[20]。宿主對外來的GIN作出相應的抵御行為促進胃泌素增加后，GIN為保證自身生活環(huán)境更加適宜，會產(chǎn)生相應的GIN的排泄/分泌(excretory-secretory，ES)產(chǎn)物去抑制宿主胃泌素的產(chǎn)生，進而提高宿主胃內(nèi)pH，保證自生生活環(huán)境有利于生存和繁殖[21]。

2 GIN感染導致宿主羊營養(yǎng)分配改變

2.1 用于宿主羊維持生長性能的營養(yǎng)減少

在GIN感染期間，由于采食量的減少，宿主羊必然不能通過增加對飼糧中蛋白質(zhì)攝取來滿足機體營養(yǎng)需求，這表明宿主羊機體內(nèi)的蛋白質(zhì)在GIN感染期間被重新調(diào)動與分配。目前研究已確定GIN可以損害宿主羊活重增加、軟組織沉積、骨骼生長、乳制品和羊毛生產(chǎn)，以滿足機體其他組織的蛋白質(zhì)需求[22]。Yu等[23]指出，感染蛇形毛圓線蟲(Trichostrongyluscolubriformis)的羔羊增加了胃腸道內(nèi)氨基酸氧化和蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)，并導致生產(chǎn)組織中(骨骼肌)氨基酸減少。宿主不僅存在骨骼肌蛋白質(zhì)合成的減少，往往也伴隨著骨骼肌蛋白質(zhì)降解的增加，更多的氨基酸從骨骼肌中釋放出來[24]，以滿足宿主組織修復以及免疫反應的蛋白質(zhì)需求，減少了肌肉和皮膚等生產(chǎn)組織的蛋白質(zhì)需求[24-26]，最終結(jié)果為宿主全身蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝發(fā)生改變。

2.2 用于宿主羊胃腸道物理屏障修復的營養(yǎng)增加

宿主胃腸道代謝率較高，這主要是由于小腸內(nèi)蛋白質(zhì)合成率高，能量消耗高，這些代謝活動占宿主全身蛋白質(zhì)代謝和能量消耗的20%～50%[27]。因此，改變胃腸道形態(tài)和功能的因素，如GIN感染，可能對宿主組織的營養(yǎng)(蛋白質(zhì))利用率產(chǎn)生巨大影響。

宿主感染GIN后胃腸道黏膜受損主要表現(xiàn)在以下2個方面：一方面，宿主胃腸道組織形態(tài)學改變。胃腸道組織受損的實質(zhì)是線蟲能利用其發(fā)達的口囊牢固地吸附在宿主的消化道腸壁上，并分泌消化酶于宿主的胃腸絨毛組織上，使組織變性溶解為營養(yǎng)液供自身定植發(fā)育，從而導致定植部位局部組織病變[28]。胃腸道組織受損的后果可能是繼發(fā)感染、敗血癥和細菌易位，這可能導致宿主的全身炎癥。在感染Trichostrongyluscolubriformis的綿羊中，主要寄生部位以外的腸道位點也出現(xiàn)了黏膜增厚、黏膜上皮增生、黏膜肌層以及腦膜下層大量嗜酸性粒細胞浸潤的現(xiàn)象[29]。另外，在寄生蟲的易感部位通?？梢杂^察到隱窩細胞增殖速率增加的現(xiàn)象，但這種反應似乎不足以彌補由于寄生蟲的存在而導致的絨毛細胞死亡率的增加。另一方面，宿主胃腸道生化環(huán)境發(fā)生改變。GIN感染直接導致宿主胃腸道黏膜嚴重受損，特別是皺胃。宿主皺胃的產(chǎn)酸壁細胞被L4期線蟲嚴重破壞，鹽酸分泌量減少，導致皺胃內(nèi)pH升高。同時，GIN為避免胃酸或胃蛋白酶對其表皮的作用而釋放大量胺類物質(zhì)，使得宿主皺胃內(nèi)pH升高，阻止了宿主胃腸道中胃蛋白酶原向胃蛋白酶的轉(zhuǎn)化，蛋白質(zhì)消化受到抑制，氨基酸和小肽吸收受阻，炎癥現(xiàn)象產(chǎn)生，導致宿主消化不良，出現(xiàn)消瘦、體腔內(nèi)水腫以及局部淋巴結(jié)肥大等臨床癥狀[30]。

隨著胃腸道組織受損，GIN吸血能力加強。Haemonchuscontortus是綿羊和山羊的一種高致病性吸血性線蟲，Haemonchuscontortus成蟲吸血可導致宿主嚴重貧血、生產(chǎn)性能下降，甚至死亡。在亞臨床感染中，貧血主要是由L4期幼蟲和成蟲導致，1條Haemonchuscontortus成蟲每天可以吸取宿主0.05 mL的血液，如果1只綿羊感染5 000條Haemonchuscontortus，每天可能會失去約250 mL血液，約占綿羊全身血液的5%[28]。GIN以宿主血紅蛋白作為氨基酸的主要來源[31]，感染羊與未感染羊的血液血紅蛋白含量存在顯著差異[32]。GIN釋放的ES產(chǎn)物，含有多種蛋白酶，能促進自身入侵宿主組織，消化宿主血液和組織，其作用機制為宿主血紅蛋白首先被天冬氨酸蛋白酶攻擊，然后被半胱氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶降解為更小的小肽，最后，GIN外肽酶進一步對這些小肽進行消化[31]。

由GIN感染導致胃腸道發(fā)生上述變化對宿主蛋白質(zhì)和氨基酸代謝的影響可能是由于感染導致的宿主黏膜受損使得宿主部分飼糧蛋白質(zhì)被機體用以修復受損的黏膜。Bermingham等[33]報道，感染Trichostrongyluscolubriformis羊的十二指腸、回腸平滑肌和腸系膜淋巴結(jié)的蛋白質(zhì)分數(shù)合成率(fractional synthesis rate，F(xiàn)SR，即通過將同位素直接摻入組織蛋白質(zhì)中測量，表示單位時間內(nèi)某種標記氨基酸摻入蛋白質(zhì)的比率)[25]增加，表明每天有更多的組織蛋白質(zhì)在胃腸道和淋巴結(jié)被重新合成，十二指腸組織完整性的重建可能是十二指腸平滑肌FSR增加的原因，而一般免疫反應的啟動可能是回腸平滑肌和淋巴結(jié)FSR增加的原因。這些被重新分配到胃腸道的氨基酸可能主要參與了受損黏膜的修復，而非用于宿主機體蛋白質(zhì)的合成[34]。

2.3 用于宿主羊胃腸道化學屏障建立的營養(yǎng)增加

GIN感染引起的胃腸道菌群改變是宿主免疫反應的一部分，這可能是一種適應性機制，免疫系統(tǒng)需要大量的特定營養(yǎng)物質(zhì)，特別是在感染期間，許多調(diào)控因子被激活來調(diào)節(jié)這一生物學過程。大量試驗證據(jù)表明，GIN感染主要誘導宿主Th2型細胞介導的免疫反應，但其誘導機制尚不明確[35]。胃腸道上皮細胞(intestinal epithelial cells，IECs)不僅僅是宿主營養(yǎng)吸收的細胞，而且在宿主的免疫反應中也發(fā)揮重要作用。IECs通過釋放典型的細胞因子，如胸腺基質(zhì)淋巴生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)、白細胞介素(interleukin，IL)-33和IL-25，在啟動寄生蟲誘導的Th2型免疫中發(fā)揮重要作用。TSLP信號在對寄生蟲的排斥反應中起關(guān)鍵作用；IL-33作為一種警報蛋白，能誘導Th2型細胞、嗜堿性細胞、肥大細胞、巨噬細胞和2型先天淋巴細胞(group 2 innate lymphoid cells，ILC2s)分泌2型細胞因子驅(qū)除寄生蟲；IL-25通過激活I(lǐng)LC2s在誘導保護性Th2型免疫反應中發(fā)揮關(guān)鍵作用[36]。Th2型淋巴細胞協(xié)調(diào)分泌主要細胞因子IL-4、IL-5、IL-9和IL-13的體液免疫反應，導致B細胞產(chǎn)生不同亞型的免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)——IgA、IgE和IgG，IgA和IgE水平增加是蠕蟲感染的局部黏膜最顯著的特征，而IgG主要在感染動物的血清中檢測到[37]。另外，還存在嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、巨噬細胞、肥大細胞的擴張和活化以及杯狀細胞增生的現(xiàn)象[38]。與GIN相關(guān)的免疫細胞因子的作用如圖1所示。

IECs:胃腸道上皮細胞 intestinal epithelial cells;ILC2s:2型先天淋巴細胞 group 2 innate lymphoid cells;TSLP:胸腺基質(zhì)淋巴生成素 thymic stromal lymphopoietin;ES:排泄/分泌excretory/secretory;IL:白細胞介素 interleukin;Ig:免疫球蛋白 immunoglobulin；TNF-γ:腫瘤壞死因子-γ tumor necrosis factor-γ。

越來越多的研究表明Th2型免疫在宿主-寄生蟲-微生物群相互作用中發(fā)揮了重要作用。近期研究表明，寄生蟲誘導的Th2型免疫應答在蠕蟲相關(guān)的腸道菌群的定性和定量修飾中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因為這種修飾在Th2型細胞因子缺失小鼠中沒有觀察到，給未感染的小鼠注射Th2型細胞因子會導致與蠕蟲感染小鼠相似的微生物表型，從而說明Th2型免疫在宿主-寄生蟲-微生物群相互作用中發(fā)揮了重要作用[39-40]。由簇狀細胞分泌的IL-25在抗寄生蟲免疫和維持腸道內(nèi)免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它可能是宿主-寄生蟲-微生物區(qū)系相互作用的關(guān)鍵中介[41]。胃腸道微生物群可能提供了這些信號使胃腸道的IL-25表達增加[42]，味覺化學感覺通路將微生物信號傳導到細胞，特別是胃腸道中的簇狀細胞[43]。

3 GIN感染導致宿主羊蛋白質(zhì)代謝改變

3.1 宿主羊胃腸道微生物蛋白質(zhì)代謝改變

胃腸道微生物代謝在宿主營養(yǎng)和代謝中起著至關(guān)重要的作用。關(guān)于GIN感染和宿主微生物群落變化之間的因果關(guān)系，有3個主要的假說：1)宿主對線蟲感染產(chǎn)生免疫反應導致宿主微生物菌群變化；2)由宿主驅(qū)動，試圖為線蟲創(chuàng)造一個敵對的環(huán)境而導致宿主微生物菌群的變化；3)微生物與線蟲ES產(chǎn)物直接相互作用而導致宿主微生物菌群變化[44]，這些過程直接改變了胃腸道菌群各群落的生態(tài)位。雖然山羊感染寄生蟲似乎沒有影響皺胃感染部位的微生物多樣性，但它確實導致皺胃微生物組成發(fā)生重大改變，所有物種水平19%的操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)的豐度發(fā)生改變[45]。同時，在感染了Ostertagiacircumcincta的綿羊中也觀察到厭氧細菌密度的變化[46]。這些變化可能與微生物棲息地的pH升高有關(guān)，隨著管腔pH的升高宿主皺胃中活菌總數(shù)增加了2～3個級次[47]。升高的pH促使耐酸菌種增殖，如牛鏈球菌(Streptococcusbovis)，它已被證明能產(chǎn)生一種抑制綿羊細胞分泌胃泌素的抑制劑[17]。另外，微生物菌群的變化也可能是由于GIN分泌具有抗菌活性的ES產(chǎn)物[48]或是宿主免疫反應所介導的改變[39-40,49]，但其中的機制尚不清楚。

被感染的宿主羊蛋白質(zhì)代謝明顯改變，這可能是由于胃腸道微生物結(jié)構(gòu)與組成發(fā)生改變，但微生物群代謝變化和宿主代謝的變化是由微生物群與線蟲的直接相互作用引起的，還是間接由對線蟲感染的黏膜免疫變化引起的仍有待確定。其中，普雷沃氏菌屬(Prevotella)在感染線蟲的山羊皺胃中變化顯著，平均豐度由16.65%增加到25.35%[45]。反芻動物胃腸道是蛋白酶(肽酶)最豐富的來源，蛋白質(zhì)的降解受微生物控制，且受到腸道內(nèi)pH的強烈影響。Prevotella是反芻動物瘤胃和后腸中最豐富的菌屬之一，在瘤胃蛋白質(zhì)降解過程中起著至關(guān)重要的作用，特別是在寡肽分解過程中，因為其具有限速型四肽酶活性，主要作用于蛋白質(zhì)和碳水化合物的分解[50]。宿主皺胃中Prevotella豐度的增加可能代表一種代償機制，以抵消線蟲感染導致的宿主蛋白質(zhì)損失[51]。

除了Prevotella以外，其他菌屬豐富度也有所改變。例如，在感染了Haemonchuscontortus的山羊皺胃中具有抗炎功能的毛螺旋菌屬(Lachnospiraceae)和丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)的數(shù)量減少[45]。感染Strongyloidesvenezuelensis的宿主山羊胃腸道中具有免疫調(diào)節(jié)作用的擬桿菌屬(Bacteroides)和CandidatusArthromitus的數(shù)量增加，Bacteroides影響宿主的免疫系統(tǒng)并控制其他(競爭的)病原體繁殖，CandidatusArthromitus是誘導免疫細胞分化的特異性誘導物[52]；在Teladorsagiacircumcincta感染的羔羊中發(fā)現(xiàn)卟啉單胞菌(Porphyromonas)擴增[45]。如果將宿主GIN驅(qū)除后，宿主胃腸道微生物群可以恢復到感染前的狀態(tài)，這表明GIN帶來的這些菌群代謝變化是可逆的[52]。

3.2 宿主羊特定氨基酸代謝改變

目前關(guān)于GIN影響宿主氨基酸代謝的研究較少，且不多的研究主要集中在對酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、半胱氨酸以及甲硫氨酸代謝的研究上[53]。通常使用氨基酸的不可逆損失率(irreversible loss rate，ILR)進行宿主氨基酸代謝的定量研究，當感染和未感染的動物的營養(yǎng)攝入量控制在相同水平，ILR表示從胃腸道吸收和機體蛋白質(zhì)分解中吸收的氨基酸，即該氨基酸的利用率[54]。感染Trichostrongyluscolubriformis的綿羊小腸中酪氨酸[24]、纈氨酸[55]以及苯丙氨酸[56]的ILR與未感染的綿羊相比無明顯變化，但是蛋氨酸[55]和半胱氨酸[7]的ILR下降了13%～15%。另外，Yu等[23]通過同位素示蹤法發(fā)現(xiàn)，綿羊感染Trichostrongyluscolubriformis后第5、7、11、13周，整個腸道的亮氨酸吸收增加24%，但在感染后18～20周，整個腸道的亮氨酸吸收增加消失，這可能是由于免疫反應在感染的不同時期有所不同，說明GIN對宿主氨基酸代謝的影響會隨感染時期的變化而改變。Bermingham等[57]的研究也證明GIN感染對宿主氨基酸代謝的影響隨感染時期的變化而有所不同。GIN在感染的不同階段的確存在不同的基因轉(zhuǎn)錄和表達模式，對各自階段的能量、氨基酸、氮、脂肪酸代謝產(chǎn)生顯著影響。例如，幼蟲的有氧代謝依賴于有效的三羧酸循環(huán)，而成蟲的無氧代謝主要依賴糖酵解[58]以及L4期幼蟲向成蟲的轉(zhuǎn)變伴隨著氨基酸代謝的增加[59]等。

已有研究表明在與免疫相關(guān)的反應中半胱氨酸的需求很高，這可能是因為半胱氨酸是黏蛋白的主要成分之一(占4%～9%)，比整個機體組織蛋白質(zhì)的半胱氨酸含量高2～4倍(羊毛除外)。半胱氨酸通常用于合成急性反應蛋白、白蛋白以及谷胱甘肽，并且半胱氨酸和谷胱甘肽是一些細胞因子的合成底物[25]。每天向被GIN感染的綿羊飼糧中添加2 g半胱氨酸，可增加嗜酸性粒細胞以及皺胃球狀白細胞的數(shù)量，表明額外添加半胱氨酸可以提高宿主羊的免疫能力并達到驅(qū)蟲作用[60]。綿羊感染GIN后，空腸、肝臟和皮膚的亞精胺和精胺含量增加[61]，表明甲硫氨酸需求增加，甲硫氨酸的需求增加歸因于甲硫氨酸向半胱氨酸的轉(zhuǎn)化增加，支持了感染期間宿主的高半胱氨酸需求[25]。另外，參與免疫反應的其他氨基酸，如精氨酸(通過精氨酸酶和一氧化氮2條途徑參加免疫反應)、色氨酸(參與蛋白質(zhì)及核酸合成，維持動物體內(nèi)細胞活化和增殖)、甘氨酸(一種神經(jīng)遞質(zhì))以及谷氨酰胺(機體內(nèi)重要運載工具)等氨基酸也值得關(guān)注。

GIN在每一個發(fā)育階段都會產(chǎn)生一個新的角質(zhì)層(鞘)，在發(fā)育過程中，需要前一階段的鞘脫落，并在蛻皮過程中被新的鞘取代，整個線蟲的生命周期中，共需脫鞘5次。膠原蛋白和類膠原蛋白占線蟲表皮總蛋白質(zhì)的80%，構(gòu)成表皮結(jié)構(gòu)成分的絕大部分，膠原蛋白由Gly-X-Y基序(其中Gly為甘氨酸，X和Y通常分別為脯氨酸和羥脯氨酸)組成[62]，因此脯氨酸在GIN感染期間的需求增加。另外，氨基酸可能參與了寄生蟲細胞內(nèi)滲透壓的調(diào)節(jié)，將寄生蟲從宿主體內(nèi)移走并在體外培養(yǎng)時，其滲透平衡被破壞，很可能導致氨基酸泄漏，特別是脯氨酸[63]。寄生蟲向體外排泄氨基酸可能起到信號傳導作用，例如，曼氏血吸蟲釋放精氨酸主要是刺激附著反應的發(fā)生[63]，植物線蟲通過排泄蛋白質(zhì)與宿主相互作用[64]。除此之外，Chi等[65]的研究顯示，在片形吸蟲感染期間，宿主的脯氨酸分解代謝受損。因此，在研究GIN參與宿主綿羊的氨基酸代謝的過程中宿主脯氨酸代謝值得關(guān)注。

4 小 結(jié)

綜上所述，GIN對宿主蛋白質(zhì)和氨基酸代謝產(chǎn)生了很大的影響。一方面，GIN感染導致宿主羊采食行為改變，進而導致宿主利用的外源氨基酸含量減少；另一方面，GIN通過改變用于宿主羊生產(chǎn)性能、胃腸道黏膜修復、免疫反應的蛋白質(zhì)分配，最終導致宿主羊胃腸道微生物蛋白質(zhì)代謝乃至宿主羊全身蛋白質(zhì)代謝改變。但目前GIN改變宿主氨基酸代謝的確切機制尚不清楚，有必要應用多技術(shù)手段，聯(lián)合分析感染GIN情況下，宿主蛋白質(zhì)和氨基酸代謝變化與微生物組、代謝組和轉(zhuǎn)錄組的變化及其信號通路與調(diào)控因子的變化的關(guān)聯(lián)機制。