肖聚慧，劉小軍

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院,河南 鄭州 450014)

中風(fēng)是一組以腦部缺血及出血性損傷癥狀為主要臨床表現(xiàn)的疾病，具有極高的病死率和致殘率，中風(fēng)的病死率有隨年齡增長(zhǎng)而上升的趨勢(shì)。中風(fēng)分為兩種類(lèi)型：一種是由血管阻塞所造成的缺血性腦中風(fēng),一種是由出血所造成的出血性腦中風(fēng)[1]。不論是缺血性或是出血性腦中風(fēng)都會(huì)造成腦功能異常。除了直接的缺血、缺氧，再灌注損傷在疾病進(jìn)展中也起著關(guān)鍵作用，其中涉及到過(guò)度的炎癥反應(yīng)，自由基損傷，Ca2+超載，自噬和細(xì)胞凋亡等多種病理和生理學(xué)過(guò)程。由于一直缺乏有效的治療措施，目前認(rèn)為預(yù)防是最好的措施，臨床上迫切需要提出一種有效的腦缺血再灌注損傷醫(yī)學(xué)策略并揭示其潛在機(jī)制。

研究證實(shí)，很多天然植物提取物具有治療腦缺血性疾病的巨大潛力[2]。香葉木素(Dio)主要提取自檸檬，活性成分為黃酮類(lèi)化合物，具有抗氧化、抗感染、抗休克等多種作用[3-4]，且多篇文獻(xiàn)報(bào)道香葉木素具有抑制腫瘤的作用[5-7]。迄今為止，對(duì)香葉木素與腦缺血再灌注損傷的研究還很少，揭示香葉木素對(duì)腦I/R損傷、細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡之間潛在的藥理學(xué)聯(lián)系，實(shí)現(xiàn)其藥用價(jià)值。

在本研究中，筆者旨在探索香葉木素是否可以增加腦缺血再灌注對(duì)大鼠腦血流量，減少缺血梗死體積，并評(píng)估香葉木素對(duì)動(dòng)物保護(hù)神經(jīng)組織和神經(jīng)行為功能的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

48只10周齡(體質(zhì)量250～280 g)雄性Wistar大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0006]，動(dòng)物飼養(yǎng)于恒溫、恒濕的 SPF 級(jí)動(dòng)物房，維持12 h/12 h的光/暗循環(huán)條件。本項(xiàng)目的研究過(guò)程得到動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，承諾盡量減少動(dòng)物的使用數(shù)量并減輕動(dòng)物的痛苦，動(dòng)物處置方法均符合動(dòng)物倫理學(xué)規(guī)范。

1.2 分組及處理

將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組(Sham組，n=16)、腦缺血/再灌注組(I/R組，n=16)、香葉木素治療組(I/R + Dio組，n=16)。使用滅菌生理鹽水稀釋Dio，造模14 d前開(kāi)始給藥(20 mg/kg)，連續(xù)灌胃14 d，Sham組和I/R組使用滅菌的生理鹽水灌胃。14 d治療后，對(duì)大鼠進(jìn)行短暫局灶性腦缺血模型造模。

1.3 短暫局灶性腦缺血模型

參照文獻(xiàn)[8]，通過(guò)大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)建立短暫局灶性腦缺血的嚙齒動(dòng)物模型。通過(guò)腹膜內(nèi)注射10%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉大鼠。在整個(gè)手術(shù)過(guò)程中，使用加熱墊將大鼠體溫維持在(37±0.5)℃。沿腹部中線(xiàn)切開(kāi)頸部皮膚2 cm，分離左側(cè)的頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈并結(jié)扎。將規(guī)格為3-0的單絲尼龍線(xiàn)插入大腦中動(dòng)脈，從頸內(nèi)動(dòng)脈與頸外動(dòng)脈分叉處開(kāi)始約15 mm。持續(xù)缺血1.5 h后抽出單絲尼龍線(xiàn)，再灌注24 h。假手術(shù)的對(duì)照組大鼠不進(jìn)行MCAO，其余操作一致。激光多普勒系統(tǒng)(PeriFlux System 5010，Perimed，斯德哥爾摩，瑞典)用于監(jiān)測(cè)局部腦血流量(rCBF)。

1.4 神經(jīng)功能評(píng)分

使用改良的五分量表評(píng)分系統(tǒng)評(píng)估大鼠的神經(jīng)功能，得分越高表明神經(jīng)功能損害越嚴(yán)重。再灌注后24 h后評(píng)分包括0分：神經(jīng)系統(tǒng)功能未見(jiàn)喪失，活動(dòng)正常；1分：不能伸展左前爪；2分：爬行時(shí)向左轉(zhuǎn)；3分：走路時(shí)向左側(cè)傾倒；4分：無(wú)法自發(fā)地行走與意識(shí)障礙。

1.5 TTC染色

再灌注24 h后在麻醉下處死大鼠進(jìn)行TTC染色。將鼠腦放入-20 ℃冰箱中速凍10 min，使用振動(dòng)切片機(jī)將大鼠大腦切成 2 mm 的厚片，浸入2% TTC染液(Solarbio，G3005，北京，中國(guó))中，用錫箔紙包裹避光，放在搖床上37 ℃ 孵育15～30 min，使腦片均勻接觸到染色液。紅色表示正常的腦組織，而灰色區(qū)域表示梗塞的組織。使用Image-Pro Plus 6.0軟件(Media Cybernetics)計(jì)算梗塞體積。

1.6 HE染色

如前所示，再灌注24 h后收集大鼠鼠腦，常規(guī)石蠟包被后制備10 μm石蠟切片，然后浸入二甲苯中脫蠟。隨后，依次置于無(wú)水乙醇、95%酒精、90%酒精、80%酒精、70%酒精中5 min，最后用蒸餾水沖洗使切片水合。切片放入Harris蘇木素染6 min，用1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，使用0.6%氨水返藍(lán)，流水沖洗后放入伊紅染液中染色2 min。常規(guī)脫水透明后使用中性樹(shù)膠封片。用Olympus BX50光學(xué)顯微鏡觀(guān)察載玻片并拍照。

1.7 免疫熒光染色

大鼠用生理鹽水灌注2 min后用4%多聚甲醛灌注固定，取出鼠腦后放在4%多聚甲醛中浸泡過(guò)夜。制備40 μm厚的冰凍切片，室溫下使用山羊血清封閉2 h，然后孵育抗TUNEL(1∶100，Abcam)，抗LC3(1∶400，Cell Signaling Technology)，抗NeuN(1∶300，Abcam)4 ℃過(guò)夜。室溫孵育山羊來(lái)源的二抗(1∶1 000，Cell Signaling Technology)2 h，滴加防熒光淬滅劑后封片。顯微鏡下拍片后進(jìn)行后續(xù)分析。

1.8 蛋白質(zhì)免疫印跡

再灌注24 h后在麻醉狀態(tài)下處死動(dòng)物。在冰上分離鼠腦并制備勻漿后，用RIPA緩沖液裂解組織。離心后收集上清液，使用BCA法測(cè)蛋白濃度。等量蛋白上樣電泳，然后將其轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore，MA，美國(guó))中。10%脫脂奶室溫封閉2 h，然后用抗大鼠LC3 I(1∶3 000，Cell Signaling Technology)，抗大鼠LC3 Ⅱ，抗大鼠Beclin(1∶3 000，Cell Signaling Technology)，抗大鼠Bcl-2(1∶2 000，Abcam)，抗大鼠Atg7(1∶2 000，Cell Signaling Technology)，抗大鼠β-actin(1∶5 000，Cell Signaling Technology)，4 ℃孵育過(guò)夜。PBST洗滌后，將膜與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的山羊抗兔IgG(北京天根生物技術(shù)有限公司)在室溫下孵育1 h。在化學(xué)發(fā)光試劑(Millipore，MA)中測(cè)量蛋白質(zhì)的表達(dá)量，結(jié)果表示為目的蛋白/β-actin的值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 香葉木素對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦血流量和神經(jīng)系統(tǒng)功能的影響

為了直觀(guān)觀(guān)察短暫局灶性缺血再灌注的腦血流量變化，因此通過(guò)激光多普勒系統(tǒng)對(duì)腦血流進(jìn)行成像觀(guān)察。如圖1A顯示，Sham組大鼠的腦血量正常，全腦均有血液灌流，而I/R組中可以明顯觀(guān)察到紅色區(qū)域減少，表征鼠腦的腦血流量減少(P<0.001)，提示I/R組大鼠腦梗死區(qū)域增多。值得注意的是，Dio治療組大鼠的腦血流量相較于Sham組有所下降，但是比起I/R組有明顯的增加(P<0.01)。大鼠的神經(jīng)功能方面,如圖1B所示，Sham組大鼠神經(jīng)功能正常，平均分低于1分；而I/R組的平均分為3分，表明I/R組大鼠神經(jīng)功能損傷嚴(yán)重；I/R+Dio組大鼠平均得分為1分，表明大鼠出現(xiàn)了較輕微的神經(jīng)功能損傷。

注：與Sham組相比，###P<0.001；與I/R組相比，**P<0.01。圖1 香葉木素對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦血流量(A)和神經(jīng)系統(tǒng)功能(B)的影響

2.2 香葉木素對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積及組織損傷的影響

缺血再灌注24 h后取出鼠腦分析鼠腦的組織損傷和梗死情況。如圖2A所示，Sham組大鼠的鼠腦呈現(xiàn)鮮紅色，且顏色分布均勻；I/R組大鼠的左側(cè)鼠腦出現(xiàn)灰色的梗死區(qū)域，且大腦中部梗死區(qū)域更多(P<0.001)；I/R+Dio組大鼠的左側(cè)鼠腦有一定的梗死，但是相較于I/R組大大降低。HE染色觀(guān)察大鼠皮層區(qū)域的損傷情況，發(fā)現(xiàn)Sham組大鼠皮層結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞形態(tài)正常；I/R組大鼠皮層結(jié)構(gòu)出現(xiàn)大量破壞，細(xì)胞排列疏松，部分神經(jīng)細(xì)胞可見(jiàn)腫脹、破裂和壞死，細(xì)胞核出現(xiàn)解體；I/R+Dio組大鼠皮層結(jié)構(gòu)未發(fā)生較大改變，細(xì)胞形態(tài)較為正常，未見(jiàn)明顯壞死區(qū)域。

注：與Sham組相比，###P<0.001；與I/R組相比，**P<0.01。圖2 香葉木素對(duì)大鼠鼠腦梗死區(qū)域(A)和皮層組織(B)的保護(hù)作用

2.3 香葉木素對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦中細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL染色發(fā)現(xiàn)，正常的細(xì)胞幾乎沒(méi)有DNA的斷裂，因此沒(méi)有3′-OH形成，很少能夠被標(biāo)記。Sham組中僅有少量的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，而I/R組中出現(xiàn)大量TUNEL陽(yáng)性的神經(jīng)元(P<0.001)，表明I/R組大鼠皮層區(qū)域有大量神經(jīng)元出現(xiàn)凋亡。相較于I/R組，I/R+Dio組中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量降低(P<0.01)，表明Dio治療對(duì)大鼠鼠腦神經(jīng)元具有保護(hù)作用。

2.4 香葉木對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦中細(xì)胞自噬的影響

圖4A顯示，Sham組中幾乎無(wú)LC3信號(hào)，而I/R組中LC3陽(yáng)性細(xì)胞顯著增加，I/R+Dio組中LC3信號(hào)明顯少于I/R組。另外，相較于Sham組，I/R組的NeuN陽(yáng)性細(xì)胞有少量降低；相較于I/R組，I/R+Dio組NeuN陽(yáng)性細(xì)胞有所增加。LC3是細(xì)胞自噬的標(biāo)志物，而NeuN可以標(biāo)記成熟的神經(jīng)元。I/R可以導(dǎo)致大鼠神經(jīng)元自噬增多，從而導(dǎo)致神經(jīng)元的數(shù)量減少。并且使用Western Blot對(duì)自噬相關(guān)的蛋白進(jìn)行了定量檢測(cè)，結(jié)果顯示與Sham組相比I/R組中LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比例增加(P<0.001)，Beclin和Atg7表達(dá)均顯著增加(P<0.001)；抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)低于I/R +Dio組(P<0.001)。

注：A.免疫熒光染色代表圖；B.凋亡率統(tǒng)計(jì)圖。與Sham組相比，###P<0.001；與I/R組相比，**P<0.01。圖3 香葉木素治療對(duì)皮層神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響

注：A.免疫熒光染色代表圖；B.Western Blot代表圖；C.LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ統(tǒng)計(jì)圖；D.Beclin統(tǒng)計(jì)圖；E.Agt7統(tǒng)計(jì)圖；F.Bcl-2統(tǒng)計(jì)圖。與Sham組相比，###P<0.001；與I/R組相比，**P<0.01。圖4 香葉木素對(duì)神經(jīng)元自噬的影響

3 討論

在本研究中，筆者證實(shí)了香葉木素對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞后誘導(dǎo)的腦缺血再灌注損傷的積極影響,發(fā)現(xiàn)用香葉木素處理的動(dòng)物在腦缺血再灌注后腦血流量增加，動(dòng)物的神經(jīng)行為功能評(píng)分減少。香葉木素治療組腦梗死體積減少，神經(jīng)元的凋亡和自噬均減少。研究結(jié)果表明，香葉木素可以減輕腦缺血再灌注的損傷。

香葉木素廣泛存在與自然界的草本藥物中，是很多藥用植物的有效成分，常用于治療惡性腫瘤[3]。例如香葉木素可以抑制人類(lèi)肝細(xì)胞CYP1A 酶活性，具有抗誘變和抗變應(yīng)的特性，可用于肝癌的治療[9]。另外，香葉木素可減弱 CCl4誘導(dǎo)的肝損傷大鼠NLRP3 炎性小體信號(hào)通路活化增加細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞凋亡從而降低大鼠的肝纖維化程度[10]。香葉木素會(huì)降低IL-1β誘導(dǎo)的新生大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞NF-κB P65從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)，通過(guò)抑制NF-κB通路活化緩解軟骨細(xì)胞凋亡和免疫反應(yīng)[11]。香葉木素這種抑制細(xì)胞凋亡，減輕炎癥反映的功能是否可以緩解因缺血再灌注導(dǎo)致的腦損傷呢？筆者采用激光多普勒系統(tǒng)觀(guān)察大鼠腦部的血流變化，發(fā)現(xiàn)I/R造模組大鼠血流明顯減少，而Dio治療可以增加大鼠的腦血流量；另外，對(duì)腦組織的切片TTC染色也顯示出I/R會(huì)導(dǎo)致大鼠鼠腦梗死區(qū)域增加，皮層組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)壞死，Dio的治療可以減少梗死，維持大腦的正常細(xì)胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)。且經(jīng)過(guò)腦I/R后，大鼠出現(xiàn)了明顯的行為障礙，神經(jīng)功能評(píng)分增加；提前的Dio干預(yù)可以有效預(yù)防I/R造成的行為缺陷。

腦缺血再灌注引起的損傷主要表現(xiàn)為進(jìn)行性的腦細(xì)胞損傷。在I/R過(guò)程中，神經(jīng)元可能發(fā)生壞死和凋亡[12]。自噬是一種高度保守的細(xì)胞行為，主要參與細(xì)胞內(nèi)大分子循環(huán)以及受損細(xì)胞器和功能障礙蛋白的清除，這在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性中起著重要作用。細(xì)胞通過(guò)自噬相關(guān)基因的表達(dá)和調(diào)控自主發(fā)揮作用，降解細(xì)胞內(nèi)成分，而缺血和缺氧是自噬激活的重要誘因[13]。自噬相關(guān)蛋白 (autophagy-related protein，Atg) 是一類(lèi)自噬相關(guān)的蛋白, 在生物體內(nèi)參與調(diào)節(jié)自噬的過(guò)程。其中幾個(gè)關(guān)鍵蛋白, 也成為自噬標(biāo)志物，如微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 (LC3)以及與其結(jié)合輔助LC3成熟的Atg 7，液泡分選蛋白30基因的同源物Beclin等[14]。細(xì)胞內(nèi)的LC3經(jīng)過(guò)加工，在胞漿中形成可溶性的LC3Ⅰ，之后LC3Ⅰ需要Atg7和Atg3參與的泛素化修飾加工[15]。泛素化LC3Ⅰ與通過(guò)自噬體膜表面的磷脂酰乙醇胺耦聯(lián)，成為膜結(jié)合形式的LC3Ⅱ。LC3Ⅱ定位于前自噬體和自噬體, 是自噬體的標(biāo)志分子，隨自噬體膜的增多而增加。LC3Ⅱ的含量或LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比例與自噬體的數(shù)量呈正相關(guān)，LC3Ⅱ與LC3Ⅰ的比值增加，反映了細(xì)胞的自噬活性增加[16]。Beclin在細(xì)胞內(nèi)主要位于反面高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線(xiàn)粒體中。Beclin包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域：BH-3域，中央卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域和進(jìn)化保守結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域參與自噬調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)相互作用[17]。在正常情況下，抗凋亡蛋白Bcl-2通過(guò)與BH-3結(jié)構(gòu)域的相互作用來(lái)抑制自噬[18]。免疫熒光和蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示，I/R組大鼠的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞顯著增多，自噬相關(guān)蛋白LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ的值顯著增加，Beclin和Atg 7的表達(dá)也顯著增加，而抗凋亡的Bcl-2表達(dá)則明顯低于I/R+Dio組，表明腦I/R可以激活神經(jīng)元的自噬信號(hào)，促進(jìn)細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡，而Dio的治療可以抗細(xì)胞凋亡，減少神經(jīng)元的自噬現(xiàn)象從而維持神經(jīng)功能的正常。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)了香葉木素對(duì)腦缺血再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)元自噬的保護(hù)作用。香葉木素的干預(yù)可以減少神經(jīng)元自噬來(lái)預(yù)防腦缺血再灌注損傷。但是，筆者研究有一些局限性，在未來(lái)的研究中將繼續(xù)探索腦缺血再灌注損傷出現(xiàn)之后，香葉木素是否也能發(fā)揮治療作用，以及其發(fā)揮作用是否通過(guò)其他信號(hào)通路和分子機(jī)制。