肖作奇，潘濤，邱盼子，歐陽(yáng)波

(湖南省婦幼保健院藥學(xué)制劑部，湖南 長(zhǎng)沙 410008)

玉竹為百合科植物玉竹[Polygatumodoratum(Mill.)Druce]的干燥根莖，湘產(chǎn)玉竹是國(guó)產(chǎn)玉竹中道地藥材的一種?！侗静菡x》準(zhǔn)確提出其有“治津液枯涸，口渴嗌干等癥，而胃火制熱，燥渴消谷，多食易饑者，尤為捷效”[1],是中醫(yī)學(xué)治療糖尿病的常用藥。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,玉竹主要成分為揮發(fā)油、黃酮、多糖、氨基酸、皂苷等[2]，其中玉竹總黃酮[3]、二氫異黃酮[4]等均具有抗糖尿病活性。玉竹中的生物堿成分也被證實(shí)具有降糖作用，劉梓晗等首次分離8個(gè)生物堿類(lèi)化合物，并證實(shí)其有顯著的糖苷酶抑制活性[5]。但是大多的研究認(rèn)為,玉竹中的多糖是治療糖尿病的主要活性成分[6]。丁登峰等分離得到玉竹褐色多糖粗提物，并用于大鼠鏈脲佐菌素糖尿病模型,證明了提取物有降糖作用[7]。還有研究者提出玉竹多糖對(duì)糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞損傷有顯著改善作用[8]。Park S等比較了玉竹、黃柏等多種中藥材，發(fā)現(xiàn)均能改善Min6細(xì)胞上的胰島素抵抗[9]。然而，近10年對(duì)玉竹多糖(POP)的改善胰島素抵抗作用機(jī)制的研究尚未見(jiàn)系統(tǒng)闡述。因此筆者運(yùn)用HepG2細(xì)胞系進(jìn)行體外研究，通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生的體外胰島素抵抗和氧化應(yīng)激損傷，探究玉竹多糖的降糖活性機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑

玉竹(衡東縣中藥飲片廠(chǎng)，批號(hào)：20170503)；胰島素(CAS# 11061-68-0)、羅格列酮(CAS#122320-73-4)(Sigma)；DEAE-52(美國(guó)Sigma公司分裝)；AB-8大孔樹(shù)脂(廊坊淼陽(yáng)化工有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(BNCC341433)；胎牛血清(FBS, BNCC344675)、HepG2細(xì)胞(BNCC316757)(北納生物)；BPS、CCK-8試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；葡萄糖、SOD、MDA、GSH檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；蛋白定量檢測(cè)試劑盒、S-PAGE凝膠制備試劑盒(武漢賽維爾生物科技)；H2O2等其他化學(xué)試劑(國(guó)藥集團(tuán))。

1.1.2 儀器設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；紫外分光光度計(jì)；CO2培養(yǎng)箱；超凈工作臺(tái)；DP72奧林巴斯顯微成像系統(tǒng)(OLYMPUS)；D-37520高速離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific)；多功能酶標(biāo)儀(奧豪斯儀器有限公司)；凝膠成像系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific)。

1.2 藥物處置及分組

正常對(duì)照組(NC)：不加任何藥物處置；胰島素抵抗模型組(IR)：0.1 μmol/L insulin處置24 h后不加其他任何藥物；羅格列酮組(RGZ)：0.1 μmol/L insulin處置24 h后加2 mg/mL羅格列酮作為陽(yáng)性對(duì)照；低劑量POP組(IR+1 mg/mL POP)：0.1 μmol/L insulin處置24 h后加1 mg/mL POP；高劑量POP組(IR+10 mg/mL POP)：0.1 μmol/L insulin處置24 h后加10 mg/mL POP。藥物孵育24 h后，除NC組外，其余各組加10 μL 0.3%H2O2溶液。每組實(shí)驗(yàn)每次設(shè)置3個(gè)平行樣，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。

1.3 方法

1.3.1 POP制備

選用湘玉竹飲片粉碎后，過(guò)60目篩。用20倍體積的石油醚熱回流脫脂。熱水提取3次，每次10倍水，80 ℃下攪拌提取，合并提取液，減壓濃縮至10%，攪拌下緩慢加乙醇至80%醇沉比，取沉淀冷凍干燥得到粗多糖。粗多糖經(jīng)過(guò)AB-8大孔樹(shù)脂脫色[6]，Sevage法脫蛋白[10]，在經(jīng)過(guò)DEAE過(guò)柱，分別用去離子水，0.1 mol/L NaCl洗脫，分離得到精制的POP,硫酸-苯酚法[10]測(cè)定樣品中POP含量。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞模型制備

HepG2細(xì)胞使用含10%FBS的DMEM，5% CO2，37 ℃下培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)10次傳代后選用細(xì)胞狀態(tài)良好的細(xì)胞制備胰島素抵抗HepG2細(xì)胞模型：將HepG2細(xì)胞置于含1 μmol/L胰島素的無(wú)血清培養(yǎng)基中24 h以上，葡萄糖的消耗量明顯減少(P<0.01)時(shí)為成功誘導(dǎo)出胰島素模型[11]。進(jìn)行藥物處置時(shí)更換不含F(xiàn)BS的DMEM。

1.3.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力

更換不含F(xiàn)BS的DMEM，在培養(yǎng)基中加入梯度濃度的POP，即POP終濃度分別為0、0.1、1、5、10 mg/mL。另設(shè)置一組加造模劑量的胰島素(0.1 μmol/L insulin)，正常對(duì)照組為等體積DMEM不加藥物，按1.5×103個(gè)/孔細(xì)胞密度接種于96孔板中，24 h后，加CCK-8反應(yīng)液4 h，按CCK-8試劑盒使用說(shuō)明說(shuō)操作，在490 nm處檢測(cè)吸光度，計(jì)算細(xì)胞活力。

細(xì)胞活力(%)=各組吸光度值/正常對(duì)照組吸光度均值×100%

1.3.4 葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)

將HepG2細(xì)胞和IR-CM細(xì)胞分別更換含藥物培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，在96孔板中加入試劑盒中檢測(cè)試劑(由試劑2酶溶液和試劑3酚試劑按1:1比例混合，現(xiàn)配現(xiàn)用)，200 μL，再加入各組細(xì)胞上清液10 μL。設(shè)置空白孔。充分震蕩混勻，反應(yīng)15 min后，于505 nm處檢測(cè)吸光度。

葡萄糖消耗比(%)=[(樣品吸光度-空白孔吸光度)/(對(duì)照組吸光度均值-空白孔)-1]×100%

1.3.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)

細(xì)胞完成藥物處置培養(yǎng)后，收集樣品，用細(xì)胞裂解液裂解(冰浴)。于4 ℃，4 000 rpm離心5 min，收集沉淀。分別按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定樣品SOD、MDA和總GSH水平。

1.3.6 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞完成孵育后，棄上清，PBS洗滌2次，加細(xì)胞裂解液，轉(zhuǎn)移細(xì)胞樣品至冰浴中，用勻漿器碾磨30 min，于4 ℃，15 000 rpm離心5 min，取上清液測(cè)總蛋白濃度。用10% SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品，轉(zhuǎn)膜封閉，孵育一抗PI3K/PPARγ，過(guò)夜，孵育二抗。顯影成像,Image-J6.0分析PI3K/PPARγ蛋白表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用單因素方差分析(ANOVA)和Dunnett’st檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)評(píng)價(jià)。采用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 POP提取分離純化

玉竹多糖提取率7.97%，經(jīng)過(guò)脫色、去蛋白后過(guò)柱，去離子水洗脫分離得到中性多糖組分Ⅰ(即本文活性研究對(duì)象POP)，占玉竹粗多糖67.5%。經(jīng)硫酸-苯酚法測(cè)定樣品中POP含量為92.8%。DEAE-2纖維素洗脫曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

注：Ⅰ去離子水洗脫組分(POP)；Ⅱ0.1 mol/L NaCl洗脫組分。圖1 玉竹多糖DEAE-52洗脫曲線(xiàn)

2.2 POP對(duì)氧化應(yīng)激損傷HepG2細(xì)胞的保護(hù)作用

0.01～10 mg/mL濃度的POP對(duì)正常培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞增殖均沒(méi)有顯著的影響，各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),結(jié)果見(jiàn)表1。高劑量POP對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞有保護(hù)作用，作用同RGZ。高劑量POP組較模型組細(xì)胞活性有顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,玉竹中性多糖幾乎沒(méi)有HepG2細(xì)胞毒性，且對(duì)H2O2引起的氧化應(yīng)激損傷有顯著的改善作用。

表1 玉竹多糖對(duì)胰島素抵抗HepG2和正常HepG2細(xì)胞活力的影響

表2 玉竹多糖對(duì)氧化應(yīng)激損傷的胰島素抵抗HepG2細(xì)胞活力的影響

2.3 POP對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗能力的影響

胰島素誘發(fā)產(chǎn)生胰島素抵抗后，細(xì)胞的葡萄糖消耗水平顯著下降(P<0.01)，陽(yáng)性藥物RGZ和不同濃度的POP能顯著增加胰島素抵抗細(xì)胞的葡萄糖消耗(P<0.01)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 玉竹多糖對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗水平的影響

2.4 POP對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞中SOD、GSH和MDA水平的影響

在細(xì)胞給藥24 h后，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH和MDA水平以評(píng)估胰島素抵抗引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)。誘發(fā)IR后，抗氧化酶SOD和GSH顯著降低(P<0.01)，胞內(nèi)活性氧失衡，引起氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致MDA蓄積(P<0.01)。RGZ作為胰島素增敏劑，有一定氧化應(yīng)激保護(hù)作用，結(jié)果顯示,RGZ明顯升高IR細(xì)胞的SOD和GSH水平，同時(shí)顯著降低MDA蓄積(P<0.01)，POP孵育與RGZ有相同的作用，與IR組比較，高劑量的POP能明顯升高IR細(xì)胞的SOD和GSH水平，同時(shí)顯著降低MDA蓄積(P<0.01)，結(jié)果見(jiàn)表4。這可能是POP有氧化應(yīng)激損傷保護(hù)作用，拮抗IR誘發(fā)的IR作用，使得SOD和GSH維持在正常水平,從而保護(hù)保內(nèi)活性氧平衡。

2.5 POP對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的P13K和PPARγ蛋白表達(dá)的影響

細(xì)胞完成孵育后，棄上清取細(xì)胞提取蛋白，檢測(cè)細(xì)胞中的P13K和PPARγ蛋白表達(dá)量。與正常對(duì)照組細(xì)胞比較，IR細(xì)胞蛋白表達(dá)量都顯著降低(P<0.01)，這可能是細(xì)胞發(fā)生胰島素抵抗后，下游信號(hào)通路P13K/PPARγ被抑制，進(jìn)而導(dǎo)致SOD和GSH水平下調(diào)，與IR組比較，陽(yáng)性藥物RGZ和POP均能顯著提高IR細(xì)胞內(nèi)的P13K/PPARγ表達(dá)水平(P<0.05)，即激活了P13K信號(hào)通路，POP可能有胰島素素增敏作用和氧化應(yīng)激保護(hù)作用。結(jié)果見(jiàn)圖2。

注：A.與NC組比較， #P<0.05；與IR組比較，*P<0.05。B.與NC組比較， ##P<0.01；與IR組比較， *P<0.05。圖2 玉竹多糖對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的PI3K/PPARγ水平的影響

3 討論

用高糖、TNF-α和胰島素等刺激HepG2細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生胰島素抵抗模型用于2型糖尿病(T2DM)研究的體外研究方法已經(jīng)應(yīng)用得十分廣泛[12-14]，IR是T2DM主要發(fā)病機(jī)制，研究表明，脂肪細(xì)胞因子失調(diào)或胰島素信號(hào)破壞均會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生，氧化應(yīng)激反應(yīng)在這個(gè)過(guò)程中起十分重要的作用[15]。氧化應(yīng)激損傷也是T2DM主要并發(fā)癥之一，高糖、高脂肪酸或持續(xù)的胰島素刺激均會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧化物(ROS)的堆積，ROS代謝產(chǎn)物——共軛二烯烴類(lèi)、丙二醛(MDA)有嚴(yán)重的細(xì)胞毒性，會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷[16]。T2DM動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，發(fā)生胰島素抵抗的大鼠，肝臟超氧化物歧化酶(SOD)和總谷胱甘肽(GSH)均會(huì)顯著降低，而代謝產(chǎn)物MDA會(huì)蓄積更多[17]。李蘭芳等研究證實(shí)，TNF-α誘導(dǎo)產(chǎn)生IR的HepG2細(xì)胞經(jīng)吡格列酮孵育后，模型組的ROS水平顯著降低，可見(jiàn),吡格列酮能通過(guò)改善氧化應(yīng)激損傷抑制JNK信號(hào)通路[18]。實(shí)際上，ROS與IR之間的分子關(guān)聯(lián)十分復(fù)雜，蛋白激酶C(PKC)通路和炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)道通路(NF-κB)等也均與OS-IR形成有關(guān)[19-20]，在胰島素信號(hào)調(diào)控下游，胰島素和受體結(jié)合后經(jīng)胰島素受體底物-1(IRS-1)和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3-K)傳導(dǎo)信號(hào)，因此在改善PI3-K胰島素抵抗發(fā)生中起重要樞紐作用。RGZ作為胰島素增敏劑，增敏機(jī)制被報(bào)道與特異性過(guò)氧化物酶體增殖因子激活劑的γ型受體(PPARγ)有關(guān)，在大鼠胰島素抵抗模型中，RGZ能使IR模型大鼠血清SOD顯著升高，MDA顯著降低[21]。綜上所述，本次研究采用胰島素誘導(dǎo)產(chǎn)生IR-HepG2細(xì)胞模型作為研究模型是可行的。而筆者研究結(jié)果表明，IR細(xì)胞中發(fā)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)，與正常對(duì)照組比較，模型組中SOD和GSH水平增加，MDA顯著降低，且RGZ可有效改善這種氧化應(yīng)激損傷?？梢?jiàn),此模型可以用于研究POP的降血糖作用。

近年來(lái),POP的分離純化及生物活性分析已成為玉竹藥理活性研究的重點(diǎn)，Chen Yi等分離得到精制POP并在體外研究中表明其有抗氧化活性[22]，Huiyan Jiang等從玉竹分離純化后得到分子量約3 500 KD的純化多糖YZ-2，并在STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型上證實(shí)POP能降低模型小鼠的空腹血糖含量并能促進(jìn)其胰島素釋放，POP能顯著改善模型小鼠肝臟組織中的SOD、CAT和GSH水平[23]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，體外細(xì)胞孵育時(shí)，0.01～10 mg/mL POP對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有影響，且POP可有效改善對(duì)于H2O2造成的氧化應(yīng)激損傷，與模型組比較，POP給藥組細(xì)胞存活率顯著升高。且10 mg/mL濃度的細(xì)胞保護(hù)作用優(yōu)于1 mg/mL濃度，1～10 mg/mL POP濃度都能有效改善胰島素抵抗，促進(jìn)模型細(xì)胞的葡萄糖攝取，POP會(huì)顯著升高模型細(xì)胞中的的SOD和GSH水平，同時(shí)顯著降低細(xì)胞中的MDA濃度， MDA濃度降低是POP改善氧化應(yīng)激損傷的結(jié)果。蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IR細(xì)胞中PIK3蛋白水平顯著降低，PPARγ表達(dá)降低，POP通過(guò)激活PIK3通路，改善胰島素抵抗，進(jìn)一步激活下游PPARγ的蛋白表達(dá)。10 mg/mL POP可以達(dá)到陽(yáng)性對(duì)照藥物RGZ的顯著效果。綜上所述，本研究進(jìn)一步用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)法證實(shí)了玉竹中的多糖有基于改善氧化應(yīng)激損傷而緩解胰島素抵抗的作用，其分子機(jī)制可能是通過(guò)激活PIK3通路而發(fā)揮胰島素增敏的效應(yīng)。