于鳳琳 袁丹 陳宇 李美芽 竇曉兵 蔣福升
浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053
牡蒿(Artemisia japonica Thunb.)為菊科蒿屬植物,全草可入藥。《現(xiàn)代本草綱目》記載,中藥牡蒿味苦、微甘,寒,具有清熱、解表、涼血、殺蟲(chóng)等功效;主治感冒發(fā)熱,勞傷咳嗽,潮熱,中暑,瘧疾,高血壓病,口瘡,疥癬,濕疹等[1]。藥理學(xué)研究表明,牡蒿富含多糖、萜類、黃酮類和酚類等成分[2],具有活血、止血、抗炎[3]、抗氧化[4]和抗關(guān)節(jié)炎[5]等諸多藥理活性,且毒性低、安全性好[3-4],民間也常作野菜食用和泡茶飲用[6]。
除了上述藥理活性外,牡蒿在民間也常用于肝炎治療。早在1977年,張世友[7]采用牡蒿根治愈一例傳染性肝炎;2017年,姚萍[8]采用鴨乙型肝炎病毒感染模型確證牡蒿提取物對(duì)鴨乙型病毒性肝炎具有較好療效。然而對(duì)于牡蒿的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究相對(duì)較少。筆者前期研究發(fā)現(xiàn),牡蒿中含有大量綠原酸類成分。研究表明,綠原酸類成分具有良好的抗病毒[9]、保肝退黃、抗氧化、抗炎、抑菌等活性[10],可見(jiàn)綠原酸類成分極有可能是牡蒿發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。因此,本研究擬采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)建立牡蒿葉中綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C的含量測(cè)定方法;另外由于綠原酸類成分不穩(wěn)定,易水解,因此本研究以上述4個(gè)綠原酸類成分總含量為響應(yīng)值,以乙醇濃度、液料比、超聲功率為主要因素,采用Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,以便更確切地反映牡蒿葉中綠原酸類成分含量,為其質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù),同時(shí)為牡蒿的后續(xù)開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
1.1 儀器 UltiMate3000型高效液相色譜儀購(gòu)于美國(guó)戴安公司,配備LPG-3400A泵、WPS-3000SL自動(dòng)進(jìn)樣器和PDA-3000檢測(cè)器;Thermo Scientific Syncronis Amino色 譜 柱 (4.6mm×250mm,5μm) 購(gòu) 于 Thermo Fisher公司(批號(hào):12156);SK2510HP型超聲波清洗器購(gòu)于上??茖?dǎo)超聲儀器有限公司;DFT-50型手提式高速粉碎機(jī)購(gòu)于北京新諾立華儀器有限公司;Milli-Q Biocel超純水儀為美國(guó)密理博有限公司。
1.2 藥物和試劑 牡蒿采自福建省寧德市壽寧縣,經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)丁志山教授鑒定為菊科蒿屬植物牡蒿(Artemisia japonica Thunb.),樣品保存于浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)研究所(編號(hào):2019051001);綠原酸對(duì)照品購(gòu)于上海畢得醫(yī)藥科技有限公司(批號(hào):AGA445,含量≥99%);異綠原酸A對(duì)照品購(gòu)于上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司(批號(hào):DST190918-036,含量≥98%);異綠原酸B對(duì)照品、異綠原酸C對(duì)照品均購(gòu)于成都普思生物科技股份有限公司(批號(hào):PS001054、PS001057,含量≥98%);色譜純乙腈購(gòu)于默克公司(批號(hào):JA078630);色譜純甲酸購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司(批號(hào):C10332078);95%醫(yī)用乙醇購(gòu)于上海凌峰化學(xué)試劑有限公司(批號(hào):20190917)。
1.3 色譜條件 Thermo Scientific Syncronis Amino色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),乙腈:0.1%甲酸水(40:60,V/V)為流動(dòng)相,流速1mL·min-1,柱溫25℃,檢測(cè)波長(zhǎng)325nm,進(jìn)樣量10μL。
1.4 溶液制備
1.4.1 對(duì)照品溶液的配制 取綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C對(duì)照品,分別精密稱定,以60%乙醇溶解定容后進(jìn)行系列對(duì)倍稀釋,分別配成對(duì)照 品 濃 度 均 為200.00、100.00、50.00、25.00、12.50和6.25μg·mL-1的系列混合對(duì)照品溶液。
1.4.2 供試品溶液的制備 牡蒿葉于60℃烘干,打粉,過(guò)80目篩;精密稱取0.2g,置于50mL帶蓋管中,加入60%乙醇40mL,精密稱定,重復(fù)制備3份;超聲頻率53kHz,功率250W,50℃下提取30min,冷卻至室溫,以60%乙醇補(bǔ)足質(zhì)量,混勻,過(guò)0.22μm濾膜,備用。
1.5 測(cè)定方法建立
1.5.1 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 分別取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液,按照1.3中的色譜條件各進(jìn)樣10μL,記錄色譜圖,分析各峰分離度。
1.5.2 線性關(guān)系考察 按照1.3中的色譜條件,對(duì)系列對(duì)倍稀釋的混合對(duì)照品溶液進(jìn)行進(jìn)樣分析,以濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性關(guān)系擬合。
1.5.3 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取1.4.1配制的混合對(duì)照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄4個(gè)對(duì)照品對(duì)應(yīng)峰面積,計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)值。
1.5.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取1.4.2制備的供試品溶液,按照1.3中的色譜條件,分別于0、2、4、6、8、12、24h進(jìn)樣10μL,記錄峰面積,并計(jì)算綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C的RSD。
1.5.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一批樣品適量,共6份,按照1.4.2的方法制備供試品溶液,再按照1.3中的色譜條件進(jìn)樣分析,計(jì)算樣品中4個(gè)成分含量RSD。
1.5.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取9份已知含量的牡蒿葉粉末樣品,精密稱定,分別加入已知成分含量80%、100%和120%的對(duì)照品,按照1.4.2的方法制備供試品溶液,然后按照1.3中的色譜條件進(jìn)樣分析,計(jì)算4個(gè)成分的平均加樣回收率及RSD。
1.6 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝
1.6.1 單因素實(shí)驗(yàn) 精密稱取牡蒿葉0.250g,固定其他因素不變,在超聲頻率53kHz條件下分別考察乙醇濃度、液料比、超聲功率、超聲時(shí)間和超聲溫度單因素變化對(duì)4個(gè)成分提取的影響,提取完成后分別定容至100mL,過(guò)0.22μm濾膜,按照1.3中的色譜方法進(jìn)樣分析。
1.6.2 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì) 根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選定乙醇濃度、液料比和超聲功率3個(gè)因素為優(yōu)化對(duì)象,設(shè)定3個(gè)水平;采用Design-Expert 8.0.6軟件,根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理,設(shè)置5個(gè)中心實(shí)驗(yàn)點(diǎn),共17組實(shí)驗(yàn);以4個(gè)成分總含量為響應(yīng)值,優(yōu)化提取工藝[11]。
1.7 工藝驗(yàn)證和含量測(cè)定 根據(jù)響應(yīng)面法優(yōu)化的提取工藝方法,重復(fù)提取6次,按照1.3中的色譜方法進(jìn)樣分析,測(cè)定牡蒿葉中綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C含量。
1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料以±s表示,各組間比較采用單因素方差分析。采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)Box-Behnken響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸方程擬合,并對(duì)其回歸系數(shù)進(jìn)行方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 系統(tǒng)適用性驗(yàn)結(jié)果 按照1.3中色譜條件進(jìn)樣分析,提示在該色譜條件下綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C理論塔板數(shù)均>3 000,分離度均>2,各成分基線分離良好。見(jiàn)圖1。
圖1 混合對(duì)照品和牡蒿提取物高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography of mixed reference and Artemisia japonica extract
2.2 測(cè)定方法學(xué)考察結(jié)果
2.2.1 線性關(guān)系考察結(jié)果 按照1.3中色譜條件,將對(duì)倍稀釋混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣分析,以濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性關(guān)系擬合,結(jié)果提示4個(gè)對(duì)照品在6.25~200.00μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見(jiàn)表1。
表1 4個(gè)對(duì)照品線性關(guān)系Tab.1 Linear relationship of the four references
2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果 精密吸取混合對(duì)照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,分析4個(gè)對(duì)照品對(duì)應(yīng)峰面積RSD值,分別為1.059 6%、0.479 9%、0.386 2%和0.952 6%,表明儀器精密度良好。
2.2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 取供試品溶液,分別于0、2、4、6、8、12、24h進(jìn)樣10μL,計(jì)算得綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C的RSD分別為1.878 0%、0.778 1%、1.722 9%和1.478 4%,表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 精密稱取同一批樣品適量,共6份,按照1.3中色譜條件進(jìn)樣分析,計(jì)算得出樣品中4個(gè)成分含量RSD分別為1.544 7%、1.883 1%、1.763 2%和1.772 8%,表明本方法重復(fù)性良好。
2.2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 4個(gè)成分RSD分別為0.887 1%、1.886 1%、2.219 3%和1.624 0%,加樣回收率均在95%~105%區(qū)間內(nèi),且RSD小于3.000 0%,表明該方法準(zhǔn)確性良好。見(jiàn)表2。
表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=9)Tab.2 Results of sample recovery(n=9)
2.3 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝
2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 各單因素分析結(jié)果表明,乙醇濃度、液料比、超聲功率、超聲時(shí)間和超聲溫度各單因素變化時(shí),4個(gè)成分合計(jì)含量極差分別為6.731 4mg·g-1、5.334 1mg·g-1、2.689 7mg·g-1、1.546 8mg·g-1和0.683 0mg·g-1,表明上述5個(gè)因素對(duì)4個(gè)綠原酸類成分提取率影響排序?yàn)椋阂掖紳舛龋疽毫媳龋境暪β剩境晻r(shí)間>超聲溫度。見(jiàn)圖2??傮w上,異綠原酸B和異綠原酸C含量相對(duì)低,各因素變化對(duì)其提取率影響不大;綠原酸含量較高,但水溶性好,上述各因素變化情況下對(duì)綠原酸提取率影響也不顯著,在高乙醇(70%)提取條件下提取率反而有所下降。見(jiàn)圖2A。異綠原酸A含量最高,極性相比綠原酸有所降低,乙醇濃度、液料比和超聲功率對(duì)其有顯著影響。在超聲溫度50℃、液料比20:1mL·g-1、超聲頻率53kHz、超聲功率250W、超聲時(shí)間20min條件下,乙醇濃度50%時(shí),提取率較高。見(jiàn)圖2A。在超聲溫度50℃、乙醇濃度50%、超聲頻率53kHz、超聲功率250W、超聲時(shí)間20min條件下,液料比達(dá)到20:1mL·g-1后提取率增加并不明顯。見(jiàn)圖2B。在超聲溫度50℃、乙醇濃度50%、液料比20:1mL·g-1、超聲頻率53kHz、超聲時(shí)間20min條件下,隨超聲功率增加,提取率增加,因此以儀器上限功率250W為提取超聲功率。見(jiàn)圖2C。而在乙醇濃度50%、液料比20:1mL·g-1、超聲頻率53kHz、超聲功率250W條件下,超聲時(shí)間和超聲溫度變化均未能顯著增加提取率。見(jiàn)圖2D、2E。綜合考慮提取率和能耗等因素,初步確定乙醇濃度50%、液料比20∶1mL·g-1、超聲功率250W、室溫超聲提取20min較為合適。
圖2 各提取因素對(duì)4個(gè)成分提取率影響Fig.2 Impact of extraction factors on the extraction rate of the four components
2.3.2 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)結(jié)果 根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選定乙醇濃度、液料比和超聲功率3個(gè)因素為優(yōu)化對(duì)象,設(shè)定3個(gè)水平。見(jiàn)表3。采用Design-Expert 8.0.6軟件,根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理,設(shè)置5個(gè)中心實(shí)驗(yàn)點(diǎn),以4個(gè)成分總含量為響應(yīng)值,共完成17組實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)表4。
表3 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)因素與水平Tab.3 Factors and levels of response surface experiment design
表4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)安排與結(jié)果Tab.4 Arrangement and results of response surface experiment design
借助Design-Expert 8.0.6軟件分析,4個(gè)成分合計(jì)提取率對(duì)因素A、B、C的二次多項(xiàng)回歸方程為:提取率=11.86+0.72A+0.17B+0.050C-0.17AB-0.050AC+0.063BC-0.77A2-0.067B2+0.10C2,建立的回歸模型P<0.01。見(jiàn)表5。表明模型對(duì)提取率預(yù)測(cè)較準(zhǔn),擬合精度較好,可利用該模型作后續(xù)優(yōu)化設(shè)計(jì)。失擬項(xiàng)P=0.182 3>0.05,表明該模型擬合較好。同時(shí),多元相關(guān)系數(shù)R2=0.986 7,接近于1,表明相關(guān)性好;校正決定系數(shù)R2和預(yù)測(cè)系數(shù)R2均較高且數(shù)值接近,表示該回歸模型能充分解釋工藝過(guò)程。此外,變異系數(shù)<10%,精密度>4,表明實(shí)驗(yàn)的可信度和精確度高,有效信號(hào)與噪聲比值較為合理。模型的二次項(xiàng)系數(shù)為負(fù),曲線開(kāi)口向下,說(shuō)明提取率有極大值。一次項(xiàng)中因素A和二次項(xiàng)A2對(duì)結(jié)果影響極顯著,一次項(xiàng)因素B對(duì)結(jié)果影響顯著,因素A和B交互作用也非常顯著。見(jiàn)表5。
表5 Box-Behnken響應(yīng)面二次模型及其回歸系數(shù)方差分析Tab.5 Box Behnken response surface quadratic model and its regression coefficient variance analysis
2.3.3 響應(yīng)曲面和等高線圖分析結(jié)果 固定任意1個(gè)因素處于零水平,按照擬合的二次回歸方程對(duì)其他2個(gè)因素進(jìn)行編程運(yùn)算,經(jīng)Design-Expert 8.0.6分析得到交互因素的響應(yīng)面和等高線圖。見(jiàn)圖3。從圖3中看出,乙醇濃度對(duì)4個(gè)成分提取率的影響最顯著,曲線弧度較大;液料比與超聲功率相對(duì)次之,曲線弧度較小。2個(gè)因素交互影響方面,乙醇濃度與液料比交互作用比較明顯。以提取量取最大值為參考,采用Design-Expert 8.0.6優(yōu)化分析,超聲提取牡蒿中總綠原酸最佳工藝為:乙醇濃度為59.75%,液料比為40:1mL·g-1,超聲頻率53kHz,功率為250W,室溫下提取20min,95%置信度下,提取量的預(yù)測(cè)值為49.061 2mg·g-1。
圖3 乙醇濃度、液料比和超聲功率對(duì)牡蒿葉4個(gè)綠原酸成分總提取率交互影響的響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface diagram of interaction among ethanol concentration,liquid-solid ratio and ultrasonic power on total extraction rate of four chlorogenic acid components in Artemisia japonica leaves
2.4 工藝驗(yàn)證和含量測(cè)定結(jié)果 為方便操作,調(diào)整乙醇濃度為60%,以液料比為40:1mL·g-1,超聲頻率53kHz,超聲功率為250W,室溫下提取20min,平行試驗(yàn)6次,按照1.3中的色譜方法進(jìn)樣分析,實(shí)際測(cè)得綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C含量分別為14.317 0mg·g-1、27.945 2mg·g-1、1.230 4mg·g-1和5.066 5mg·g-1,合計(jì)總量達(dá)48.559 0mg·g-1。見(jiàn)表6。4個(gè)成分合計(jì)含量與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)偏差為1.0236%,表明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的超聲提取牡蒿中4個(gè)綠原酸類成分的工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。此外,值得注意的是,與其他富含綠原酸類中藥相比,牡蒿葉中綠原酸和異綠原酸A含量高于大多數(shù)中藥材。見(jiàn)表7。
表6 牡蒿葉中各成分含量測(cè)定結(jié)果Tab.6 Content determination results of four chlorogenic acids in Artemisia japonica leaves
表7 各藥材中綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C含量(mg·g-1)Tab.7 Contents of chlorogenic acid,isochlorogenic acid A,isochlorogenic acid B and isochlorogenic acid C in different Chinese herbs(mg·g-1)
綠原酸類成分是眾多藥用植物的藥效成分,常作為指標(biāo)成分用于中藥材質(zhì)量分析和藥物制劑質(zhì)控[12-20]。從文獻(xiàn)資料看,多數(shù)研究采用RP18反相色譜柱,以乙腈和甲酸水(或磷酸水)為流動(dòng)相,對(duì)綠原酸類成分含量進(jìn)行測(cè)定[12-20]。而筆者前期研究發(fā)現(xiàn),牡蒿提取物中有少量雜質(zhì)峰,與異綠原酸A、B和C峰重疊,RP18色譜柱難以有效分離;但采用Thermo Scientific Syncronis Amino正相色譜柱,以乙腈:0.1%甲酸水(40:60,V/V)為流動(dòng)相,1mL·min-1等度洗脫,大多雜質(zhì)峰在7min內(nèi)已出峰,綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C峰周?chē)匆?jiàn)雜質(zhì)峰,且4個(gè)成分分離度良好。Syncronis Amino正相色譜柱常用于糖類和氨基酸等水溶性成分分析,綠原酸類成分含奎尼酸基團(tuán),極性大,從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看,該色譜柱也適用于綠原酸類成分分離,所建立的色譜方法穩(wěn)定可靠,適用于牡蒿葉中綠原酸類成分含量測(cè)定。
在單因素考察基礎(chǔ)上,以牡蒿葉中4個(gè)主要綠原酸類成分總提取率為響應(yīng)值,采用Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)乙醇濃度、液料比和超聲功率3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。結(jié)果與單因素考察結(jié)果類似,各因素的影響大小依次為乙醇濃度>液料比>超聲功率,其中乙醇濃度和液料比交互作用顯著。通過(guò)Design-Expert 8.0.6計(jì)算和工藝驗(yàn)證,確定最佳提取工藝為:60%乙醇,液料比40:1(mL·g-1),超聲頻率53kHz,功率250W,室溫超聲提取20min。在該優(yōu)化提取工藝下,測(cè)得牡蒿葉中綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C含量 分 別 高 達(dá)14.317 0mg·g-1、27.945 2mg·g-1、1.230 4mg·g-1和5.066 5mg·g-1,與提取工藝優(yōu)化前比較,測(cè)得的4個(gè)成分含量明顯提高,這在一定程度上與綠原酸類成分穩(wěn)定性有關(guān),尤其是水提過(guò)程中更易降解,因此通過(guò)合理優(yōu)化提取工藝后,能更為真實(shí)地反映牡蒿葉中綠原酸類成分的實(shí)際含量。另外,綜合比較現(xiàn)有文獻(xiàn)資料可以發(fā)現(xiàn),牡蒿葉中綠原酸含量低于金銀花、甜葉菊和款冬花,與綿茵陳和毛連菜相當(dāng);異綠原酸A含量低于金銀花,但高于綿茵陳;異綠原酸B和異綠原酸C含量也較高;4個(gè)成分總含量?jī)H次于金銀花,高于大多傳統(tǒng)中藥。尤其值得注意的是,與同科屬植物綿茵陳比較,除了綠原酸含量相當(dāng)外,牡蒿中的其余3個(gè)成分含量均高于綿茵陳。綿茵陳具有清熱、利濕、退黃等功效,常用于治療濕熱黃疸和傳染性肝炎等病癥;而研究已證實(shí)綠原酸、異綠原酸類成分是其發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗病毒、保肝退黃等重要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[9-10]。因此,本研究從物質(zhì)含量角度,間接提示了牡蒿治療黃疸型肝炎的潛在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。此外,中藥成分復(fù)雜,建立多指標(biāo)成分測(cè)定方法對(duì)建立中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、提升中藥材品質(zhì)具有重要意義[21],因此本研究為牡蒿的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定了良好的基礎(chǔ)。
浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)2021年6期