李心怡，劉永軍

（山東大學化學與化工學院,濟南250100）

醛縮酶可以催化羥醛縮合反應，即親核供體（可烯醇化的羰基，底物1）與親電受體（通常是醛類，底物2）發(fā)生縮合形成C—C鍵［1］.C—C鍵立體選擇性的生成與斷裂屬于最基本的有機化學反應，因此醛縮酶在不對稱合成中起十分重要的作用［2］.目前，在自然界已發(fā)現(xiàn)了2類醛縮酶，其中Ⅰ類醛縮酶不需要輔因子［3，4］，活性位點有一個保守的賴氨酸殘基，ε-氨基可與供體底物的羰基反應并形成Schiff堿中間體［5］，進一步轉化成親核性的烯胺形式；該烯胺再選擇性地進攻醛受體的羰基，最后經(jīng)過水解反應生成縮合產(chǎn)物.Ⅱ類醛縮酶需要二價金屬離子（如Zn2+及Mg2+等）或輔酶作為輔因子，在反應中組氨酸首先抽取供體底物上的質子使底物形成烯醇負離子，然后對醛供體發(fā)起親核進攻.絕大多數(shù)醛縮酶催化的羥醛縮合反應的立體選擇性只受酶的控制，而不依賴于底物的立體構型［2］.

迄今，一些有機胺和催化抗體等Ⅰ類醛縮酶的仿生催化劑已被合成出來［6，7］，但其催化效率相對于天然酶還存在較大差距.近年來，隨著計算模擬技術的發(fā)展，蛋白質分子設計技術已成為獲得比天然蛋白質性能更優(yōu)越的新型蛋白質的有力手段［8］.Baker等［9，10］開發(fā)了一種用于蛋白質結構預測的Rosetta算法平臺，并相繼設計了很多具有重要生物功能的新酶，它們可以催化多種類型的化學反應，包括羥醛縮合反應［11～15］、Kemp消除反應（Kemp elimination reaction）［16］及狄爾斯-阿爾德反應等［17］.2012年，Althoff等［12］設計了一種逆醛縮酶，可以催化羥醛縮合反應的逆反應，即β-羥基酮化合物的裂解反應（Scheme 1）.2016年，Obexer等［18］利用超高通量液滴微流控技術對該逆醛縮酶進行了定向進化，獲得了酶活性提升109倍的逆醛縮酶RA95.5-8F，尤其是通過6輪的突變和篩選后，RA95.5-8F的催化效率比起始進化酶RA95.5-8提高了30倍，且RA95.5-8F對R型和S型底物的立體選擇性從14∶1提高到了480∶1，成為人工設計酶最為成功的案例之一.

Scheme 1 Catalytic reaction catalyzed by retro aldolase

為了說明逆醛縮酶RA95.5-8F的高催化活性和對底物的立體選擇性，Obexer等［18］還獲得了高分辨率的RA95.5-8F酶的晶體結構，其活性中心包含一個由氫鍵網(wǎng)絡連接的Lys1083，Tyr1051，Asn1110和Tyr1180組成的催化四聯(lián)體［18～21］（Scheme 2），這可能是影響酶催化活性和底物選擇性的關鍵因素.在Obexer等提出的反應機理中，殘基Lys1083首先親核進攻供體底物羰基形成Schiff堿中間體，且四聯(lián)體中的Tyr1051主要通過抽取底物上的質子起催化作用.為了進一步理解逆醛縮酶RA95.5-8F具有高催化活性的根本原因，本文采用QM/MM組合方法對逆醛縮酶RA95.5-8F的催化機理進行了理論研究，在原子水平上闡明了β-羥基酮化合物裂解的微觀機制，解釋了催化四聯(lián)體中各殘基所起的不同作用，研究結果為相關醛縮酶的進一步改造提供了理論參考.

Scheme 2 Crystal structures of the engineered retroaldolase RA95.5-8F with a bound 1,3-di ketone inhibitor(PDB ID:5AN7)(A)and active site of the retro-aldolase RA95.5-8F in which the inhibitor has been manually modified to the reaction intermediate(B)

1 計算方法與模型

1.1 模型構建

由于Obexer等［18］解析出的RA95.5-8F酶的晶體結構是酶與酰胺中間體形成的復合物（PDB ID：5AN7），本文首先將酰胺中間體上的羰基手動改為羥基構建了計算模型［Scheme 2（B）］.羥基H原子有2種可能取向，本文根據(jù)其可與附近水分子形成氫鍵的特點確定了其優(yōu)勢構象.在此模型中，殘基Lys1083已經(jīng)與底物形成Schiff堿中間體，故在QM/MM計算中，以此反應中間體為起始點，分別研究Schiff堿中間體的形成及其進一步裂解過程.由于RA95.5-8F酶晶體結構缺失了殘基Ser1058-Asp1061，本文利用Modeller軟件包［22］將缺失的殘基補全，并通過分子動力學模擬獲得了較為穩(wěn)定的計算模型.

1.2 分子動力學模擬

首先利用PROPKA程序［23］計算出實驗pH值下可滴定殘基的pKa值，并結合可視化的VMD程序［24］確定了各殘基的質子化狀態(tài).根據(jù)Obexer等提出的可能反應機理［18］，將活性中心的Tyr1051殘基設為去質子化狀態(tài)，而Tyr1180殘基為質子化狀態(tài)；體系中所有缺失的氫原子用CHARMM軟件包［25］中的HBUILD模塊進行添加.首先將整個蛋白質體系溶解在一個直徑為3 nm的TIP3P［26］類型的水球中.為了保證體系的電中性，還隨機向體系中加入了9個Na+，最終整個體系含有12386個原子，包括2761個TIP3P水分子.在進行分子動力學模擬之前，首先在CHARMM22/CMAP全原子力場［27］下對體系進行能量最小化，然后進行35 ns的分子動力學模擬.分子動力學模擬得到蛋白質骨架原子的RMSD變化如圖1所示，可見約在7 ns后蛋白質骨架基本達到平衡.

Fig.1 RMSD for the backbone atoms of the enzyme in complex with a Schiff base intermediate in 35 ns MD simulation

1.3 QM/MM計算

選取分子動力學模擬后的最后一個快照作為QM/MM計算的初始構型.所有QM/MM計算均使用Chemshell軟 件 包［28］，調 用Turbomole程 序［29］和DL_POLY程序［30］分別用于QM計算和MM計算.在計算中將整個體系分為QM區(qū)和MM區(qū)，其中QM區(qū)包括底物、參與反應的殘基Lys1083、殘基Tyr1051及與之形成氫鍵網(wǎng)絡的殘基Asn1110，Tyr1180和1個水分子（圖2）.QM區(qū)共有84個原子，電荷為0，自旋多重度為1.QM區(qū)與MM區(qū)的邊界采用連接氫原子方法飽和［31］.在QM/MM計算中，利用HDLC程序［32］進行幾何構型優(yōu)化，用L-BFGS方法［33，34］尋找反應路徑中的能量最小點，采用P-RFO算法［35］尋找過渡態(tài)結構；所有幾何優(yōu)化均在B3LYP/6-31G（d，p）水平上進行［36］.為了得到更準確的相對能量，對優(yōu)化后的構型在B3LYP/6-311++G（2d，2p）水平上進行了單點能計算.此外，還用DFT-D3程序［37］對QM區(qū)進行了經(jīng)驗色散校正.

Fig.2 Selected QM region for the QM/MM calculations

2 結果與討論

盡管本文進行的計算以Schiff堿中間體IM2為起始點，但為了清楚地描述β-羥基酮在RA95.5-8F酶催化下發(fā)生裂解的微觀機制，仍然從底物β-羥基酮與殘基Lys1083形成共價中間體開始說明.

2.1 烯胺中間體的形成與C—C鍵斷裂

Fig.3 Optimized structures of species involved in the formation of the aldehyde and enamine

Obexer等［18］提出β-羥基酮的裂解反應是由Lys1083親核進攻底物上的羰基碳引發(fā)的，本文首先對共價烯胺中間體的形成機制進行了研究.在優(yōu)化得到的反應物構型中（圖3），Lys1083氨基上的N1原子距底物C1原子僅為0.324 nm，非常有利于反應.此外，底物與附近殘基形成多個較強的氫鍵，如Tyr1051的H2與底物O3相距0.168 nm，Tyr1180的酚羥基與底物羰基相距0.182 nm；Lys1083和Asn1110的氨基也分別與底物和Tyr1180存在氫鍵作用，極性活性口袋與底物形成了強大的氫鍵網(wǎng)絡，從而使底物更準確地定位在酶的活性中心.計算結果表明，Lys1083親核進攻底物羰基的同時，與N1相連的質子H1轉移到O1原子上，形成一個以C1為手性碳的四面體結構IM1，反應能壘為77.82 kJ/mol.對于接下來的脫水形成烯胺過程，存在2種可能性，即底物上的羥基可與Tyr1051的H2或Tyr1180的H4結合形成水分子.IM1中O1與H2原子距離為0.172 nm，O1與H4原子的距離為0.197 nm，∠H1—O1—H2和∠H1—O1—H4分別為115.9°和94.1°.從相對距離和角度判斷，羥基似乎更易與H2作用，計算結果也證實了這一點.羥基與H2結合脫水能壘為20.92 kJ/mol，而羥基與H4結合脫水的能壘略高，為25.10 kJ/mol.從IM1到IM2，隨著底物OH-的離去，N1與C1形成烯胺雙鍵，N1—C1鍵長也由0.142 nm縮短到0.131 nm.然后，去質子化的Tyr1051抽取底物上的質子（H3）促進底物C—C鍵的裂解.由于IM2中O2與H3相距較遠（0.444 nm）且相對取向不利于反應，因此羥基需要先經(jīng)歷翻轉.計算結果表明，羥基旋轉過程十分容易，旋轉后的中間體IM3也比旋轉前更加穩(wěn)定（圖4）.

烯胺中間體IM3的裂解（IM3→IM4）涉及多個化學鍵的斷裂與形成，包括Tyr1051抽取底物上的質子和C2—C3鍵的斷裂.計算結果表明，IM3→IM4過程的能壘為67.36 kJ/mol.底物的裂解首先導致產(chǎn)物醛的生成，同時生成另一分子的烯胺.C2與C3相距0.308 nm，說明醛碳基仍與殘基Tyr1051形成氫鍵.由圖4還可以看出，第一步Lys1083的親核進攻過程對應的能壘較高，而脫水、羥基旋轉等過程都很容易發(fā)生.

Fig.4 Potential energy profile for the formation of the aldehyde and enamine

2.2 烯胺水解反應及丙酮的生成

Fig.5 Optimized structures of species involved in the hydrolysis of the enamine and the release of acetone

圖5給出烯胺水解及丙酮生成過程中優(yōu)化得到的中間體和過渡態(tài)結構.可見，活性中心的水分子起到質子橋作用，Tyr1051上的質子首先傳遞水分子，同時水合質子加成到C2原子上生成IM5，由于C1=C2雙鍵變?yōu)閱捂I，其鍵長由IM4中的0.135 nm經(jīng)過TS5（0.142 nm）拉長至IM5的0.148 nm，同時C1=N1雙鍵形成，其鍵長由0.136 nm縮短至0.130 nm，此過程的能壘為72.38 kJ/mol.隨后水分子的O—H鍵異裂，其中OH-親核進攻C1原子，H+轉移回Tyr1051上，生成IM6，此過程的能壘僅為25.52 kJ/mol（圖6），說明烯胺水解反應比較容易發(fā)生.

決速步驟是丙酮分子的生成，中間體IM6需要經(jīng)歷C1—N1鍵的斷裂及羥基O—H鍵的異裂，完成整個催化循環(huán)，此步的能壘為106.27 kJ/mol（圖6）.值得注意的是此過程與R→IM1的賴氨酸親核進攻互為逆反應，因此二者能壘比較相近.此外，本文中的底物是R構型的β-羥基酮，在優(yōu)化得到的反應物、中間體及過渡態(tài)構型中，底物的β-羥基始終與殘基Tyr1051和Tyr1180等形成較強的氫鍵，有利于底物C—C鍵裂解反應的發(fā)生，這可能是導致此酶對于R構型底物的選擇性遠遠高于S構型的原因之一.

Fig.6 Potential energy profile for the hydrolysis of the enamine and the release of acetone

2.3 殘基突變計算

為了探討由Lys1083，Tyr1051，Asn1110和Tyr1180構成的催化四聯(lián)體對反應的影響，Obexer等［18］對四聯(lián)體中的關鍵殘基進行了突變，即將Tyr1051和Tyr1180突變?yōu)楸奖彼?，將Asn1110突變?yōu)榻z氨酸.基于此，本文也對上述殘基突變進行了計算研究.優(yōu)化后反應物的結構（圖7）表明，底物不再被附近殘基形成的氫鍵網(wǎng)絡所穩(wěn)定，但底物的羰基C1原子與Lys1083的N1原子的距離（0.320 nm）與突變前類似.本文計算了Lys1083對底物羰基的親核進攻過程，結果表明，這一過程的反應能壘為157.23 kJ/mol，比突變前的能壘高79.41 kJ/mol，并且生成的四面體中間體IM1′比R′高34.12 kJ/mol.我們認為，反應能壘的升高可能是由于過渡態(tài)結構中缺少了底物與周圍殘基之間氫鍵的作用.此結果也說明，催化四聯(lián)體對于穩(wěn)定底物、降低反應能壘起到關鍵作用，這與Obexer等提出的猜想［18］相吻合.

Fig.7 Optimized structures of R′to IM1′after the mutation of Tyr1051Phe,Asn1110Ser and Tyr1180Phe

基于計算結果，推測了逆醛縮酶RA95.5-8F催化β-羥基酮C—C裂解的詳細機制（圖8）：賴氨酸首先通過親核進攻底物羰基引發(fā)反應，并通過脫水生成Schiff堿中間體；在底物C—C鍵裂解過程中，去質子化的Tyr1051起關鍵的催化作用；在隨后的水解反應中，活性位點的水分子起著質子橋的作用，質子化的殘基Tyr1051通過此水分子橋將質子傳遞給底物，導致底物C=N雙鍵中π鍵的斷裂；最后，隨著C—N鍵的斷裂，底物羥基發(fā)生異裂，質子返回到賴氨酸上，生成丙酮分子.

Fig.8 Suggested catalytic mechanism of the retro-aldolase RA95.5-8F based on the QM/MMcalculations

3 結 論

利用QM/MM方法對人工逆醛縮酶RA95.5-8F催化β-羥基酮化合物的裂解反應進行了理論研究，結果表明，整個催化過程中最后一步C—N鍵的裂解是反應的決速步驟，能壘為106.27 kJ/mol.在催化循環(huán)中，由Tyr1180，Tyr1051，Lys1083和Asn1110組成的催化四聯(lián)體起關鍵作用，Tyr1180和Tyr1051主要用于穩(wěn)定底物在活性位點的位置與朝向，并通過與活性位點的水分子形成氫鍵在脫水、水解過程中發(fā)揮作用，而Asn1110則主要通過與Lys1083形成氫鍵來影響其與底物的結合，Lys1083和Tyr1051則分別作為親核試劑和催化酸堿直接參與了催化反應.此外，催化四聯(lián)體的氫鍵網(wǎng)絡使得底物羥基更容易與R構型的底物結合，從而導致了RA95.5-8F對R構型底物的高選擇性，這些研究結果可為進一步改進逆醛縮酶提供理論參考.