王淑玲

（1.揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)南京海陵藥業(yè)有限公司，江蘇南京 210000；2.南昌大學(xué)，江西南昌 330000）

N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）是含巰基（-SH）的還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）前體，曾用作黏液溶解劑和對乙酰氨基酚中毒的治療[1]。其在調(diào)節(jié)免疫、抗感染、抗毒素等領(lǐng)域中也具有獨(dú)特優(yōu)勢。本文基于《中國藥典》2015 版對該藥品的微生物限度檢查方法進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LRH－150、MJ150-1 生化培養(yǎng)箱，上海索譜儀器有限公司；XG1.G 脈動真空滅菌器，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；1384-A2 生物安全柜，賽默飛；PL202-L 電子天平，METTLER TOLEDO；EZ 自動微生物過濾檢驗(yàn)裝置，密理博。

乙酰半胱氨酸（批號201904014、201905008、201908005），武漢遠(yuǎn)大弘元股份有限公司。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、白色念珠菌[CMCC （F)98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]，北京三藥科技開發(fā)公司。

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，北京三藥；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，青島日水生物技術(shù)有限公司；麥康凱液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，BD；pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（以下簡稱緩沖液），揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)。

1.3 溶液制備

接種金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，于30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h；接種大腸埃希菌液體培養(yǎng)物胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，于30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h，接種白色念珠菌液體培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，于20～25 ℃培養(yǎng)18～24 h，分別將金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌培養(yǎng)物用緩沖液制成含菌數(shù)≤10 000 cfu/mL 的菌懸液，將大腸埃希菌培養(yǎng)物制成含菌數(shù)≤100 cfu/mL 的菌懸液。接種黑曲霉培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，于20～25 ℃培養(yǎng)5～7 d，加入含0.05%的聚山梨酯80 的緩沖液，制成含菌數(shù)≤10 000 cfu/mL 的菌懸液。

取樣品10 g，加90 mL 緩沖液，再加入6 mol/L 的氫氧化鈉溶液10 mL，充分混勻，制成1 ∶10 的供試液，用緩沖液稀釋制成1 ∶50 的供試液。

1.4 需氧菌總數(shù)檢查驗(yàn)證（薄膜過濾法）

1.4.1 試驗(yàn)組

取1 ∶50 的供試液9.9 mL 和≤10 000 cfu/mL的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌等菌懸液、黑曲霉孢子懸液0.1 mL 混勻后，取1 mL 加入約50 mL 緩沖液過濾（濾膜已用50 mL 緩沖液潤濕），沖洗5 次，每次100 mL。取出濾膜，菌面朝上，貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，于30～35 ℃倒置培養(yǎng)不超過3 d，過濾白色念珠菌菌懸液、黑曲霉孢子懸液的平皿于30～35 ℃倒置培養(yǎng)不超過5 d，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。

1.4.2 菌液組

取緩沖液9.9 mL，其他均同試驗(yàn)組操作方法。

1.4.3 供試品對照組

取緩沖液50 mL 和1 ∶50 供試液1 mL，過濾、沖洗5 次，每次100 mL。取出濾膜，菌面朝上，貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，于30～35 ℃倒置培養(yǎng)不超過3 d（操作方法同試驗(yàn)組），點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。

1.4.4 陰性對照組

取緩沖液50 mL，過濾、沖洗5 次，每次100 mL。取出濾膜，菌面朝上，貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，于30～35 ℃倒置培養(yǎng)不超過3 d（操作方法同試驗(yàn)組），點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。

1.5 霉菌和酵母菌總數(shù)檢查驗(yàn)證（平皿法）

1.5.1 試驗(yàn)組

取1 ∶10 的供試液9.9 mL 分別和白色念珠菌懸液（含菌數(shù)≤10 000 cfu/mL）及黑曲霉孢子懸液（含孢子數(shù)≤10 000 cfu/mL）各0.1 mL 混勻，吸取1 mL 加入平皿中，加入45 ℃的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基15～20 mL，混勻，凝固，于20～25 ℃倒置培養(yǎng)不超過5 d，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。

1.5.2 菌液組

取緩沖液9.9 mL，其他均同試驗(yàn)組操作方法。

1.5.3 供試品對照組

取1 ∶10 的供試液1 mL 加入平皿中，加入45 ℃的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基15～20 mL，混勻，凝固，于20～25 ℃倒置培養(yǎng)不超過5 d，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。

1.5.4 陰性對照組

取緩沖液1 mL 加入平皿中，加入45 ℃的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基15～20 mL，混勻，凝固，于20～25 ℃倒置培養(yǎng)不超過5 d，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。

1.6 控制菌-大腸埃希菌檢查驗(yàn)證（薄膜過濾法）

1.6.1 陽性對照組

取1 ∶10 的供試液10 mL 和緩沖液50 mL，用已潤濕濾膜過濾、沖洗（每次100 mL，沖洗3 次），在最后一次沖洗液中加入不大于10 000 cfu/mL 的菌懸液1 mL，沖洗結(jié)束后，取出濾膜，接種至100 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，于30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h，備用。

1.6.2 供試品對照組

取1 ∶10 的供試液10 mL 和緩沖液50 mL，用濾膜（已用50 mL 的緩沖液潤濕）過濾、沖洗（每次100 mL，沖洗3 次），沖洗結(jié)束后，取出濾膜，接種至100 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，于30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h，備用。

1.6.3 陰性對照組

取緩沖液50 mL，用濾膜（已用緩沖液潤濕）過濾、沖洗（每次100 mL，沖洗3 次），沖洗結(jié)束后，取出濾膜，接種至100 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，于30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h，備用。

1.7 回收率計(jì)算

根據(jù)公式（1）計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與分析

需氧菌總數(shù)檢查驗(yàn)證（薄膜過濾法）結(jié)果見表1，霉菌和酵母菌總數(shù)檢查驗(yàn)證（平皿法）結(jié)果見表2，控制菌-大腸埃希菌檢查驗(yàn)證（薄膜過濾法）結(jié)果見表3。回收率數(shù)據(jù)表明，需氧菌檢查、控制菌檢查采用薄膜過濾法，霉菌和酵母菌數(shù)檢查采用平皿法，試驗(yàn)菌的回收率均在0.5～2.0，方法準(zhǔn)確度高。

表1 需氧菌總數(shù)檢查驗(yàn)證結(jié)果

表2 霉菌和酵母菌總數(shù)檢查驗(yàn)證結(jié)果

表3 大腸埃希菌檢查驗(yàn)證結(jié)果

3 結(jié)論

乙酰半胱氨酸的需氧菌檢查、控制菌檢查采用薄膜過濾法，霉菌和酵母菌數(shù)檢查采用平皿法，試驗(yàn)菌的回收率均在0.5～2.0，方法可行。