胡居吾

（江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所，江西南昌 330096）

高尿酸血癥（Hyperuricemia，HUA）是指在正常嘌呤飲食狀況下，血液中尿酸（Uric Acid，UA）含量異常升高的異質(zhì)性疾病。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，HUA與痛風(fēng)、高血壓、高血脂、動脈硬化、冠心病、糖尿病、肥胖癥等疾病密切相關(guān)。

蔓三七（Gynura procumbens (Lour.) Merr.），又名平臥菊三七，是菊科（Compositae）千里光族（Senecioneae-Cass）菊三七屬（GynuraCass），多年生草本藥食兩用植物，分布于我國廣東、海南、貴州、云南等地，越南、泰國、印度尼西亞和非洲也有分布，具有清熱解毒、止血止咳、活血通絡(luò)、提高人體免疫力和抗病毒能力、補(bǔ)鈣、抗感冒、降三高、提高免疫力等功效[1]，是一種無毒級的藥食兼可的植物。有研究表明，蔓三七具有抗高尿酸作用[2]，但沒有文獻(xiàn)報道，蔓三七對急性高尿酸血癥是否具有治療效果。

本文選擇腹腔注射氧嗪酸鉀，建立一個穩(wěn)定可靠的小鼠急性高尿酸血癥模型，考察蔓三七提取物對急性高尿酸血癥的影響，通過測定血清中尿酸值的變化來評價蔓三七提取物對急性高尿酸血癥的治療情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級KM 小鼠100 只，雄性，體重18～22 g（合格證號：0002448），由江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物科技中心提供[生產(chǎn)許可證號：SCXK（贛）2018-0003]。動物飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物科技中心屏障系統(tǒng)動物房（使用許可證號：SYXK（贛）2017-0004）。每籠5 只，食水自取。

動物房溫度21～24 ℃；相對濕度55%～62%。任何疑似非健康小鼠在試驗前均已剔除。

1.2 藥品與試劑

氧嗪酸鉀：上海凜恩科技發(fā)展有限公司，批號RH206114，用生理鹽水配制成300 mg/kg、600 mg/kg。別嘌醇：爵葉生物，98%，批號X27J10Y9，用0.5%羧甲基纖維素鈉稀釋。羧甲基纖維素鈉：索萊寶生物科技有限公司，化學(xué)純。

1.3 主要儀器

尿酸試劑盒：南京建成生物工程研究所公司，批號C012-2-1；3001 型號酶標(biāo)儀：上海賽默飛世爾公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 蔓三七提取物制備

蔓三七干葉10 kg，加入65%乙醇200 kg，用檸檬酸調(diào)節(jié)提取液pH=3.0，提取1.5 h 后過濾，再加入65%乙醇200 kg，用檸檬酸調(diào)節(jié)提取液pH=3.0，提取時間為1.0 h，合并兩次提取液，回收乙醇，濃縮液進(jìn)行噴霧干燥（進(jìn)風(fēng)溫度120 ℃，出風(fēng)溫度82 ℃），得蔓三七提取物（MSQ）。

1.4.2 MSQ 制劑

分別按照10 倍、20 倍成人日推薦劑量（3 g/50 kg 人體質(zhì)量）配制為低高劑量，用0.5%羧甲基纖維素鈉稀釋。

1.4.3 模型建立

按1 mL/100 g 的劑量將氧嗪酸鉀進(jìn)行小鼠腹腔注射，構(gòu)建高尿酸血癥（HUA）模型。如果SUA 水平明顯升高，即表明模型復(fù)制成功。

1.4.3.1 造模時間及造模劑量的摸索

60 只雄性KM 小鼠，隨機(jī)分為5 組，每組12 只。各組動物腹腔注射300 mg/kg、400 mg/kg、450 mg/kg、500 mg/kg、600 mg/kg 氧嗪酸鉀建立高尿酸血癥模型；給藥后1 h、2 h、3 h、4 h，小鼠眼眶靜脈取血0.5 mL，室溫放置1 h，以3 500 r/min 離心，取血清；按照尿酸試劑盒說明書檢測血清尿酸（SUA）水平。通過比較SUA 水平，篩選出最佳造模劑量及取樣時間。

1.4.3.2 陽性藥劑量摸索

40 只雄性KM 小鼠，隨機(jī)分為4 組，每組10 只；分別灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉、5 mg/kg 別嘌醇、10 mg/kg 別嘌醇、20 mg/kg 別嘌醇（0.5%羧甲基纖維素鈉），每天給藥1 次，連續(xù)5 d；末次給藥前1 h，各組動物腹腔注射氧嗪酸鉀建立高尿酸血癥模型；給藥后，小鼠眼眶靜脈取血0.5 mL，室溫放置1 h，以3 500 r/min 離心，取血清；按照尿酸試劑盒說明書檢測血清尿酸（SUA）水平。通過比較SUA 水平，篩選出最佳陽性藥劑量。

1.4.3.3 正式實驗的分組及給藥

50 只雄性KM 小鼠，隨機(jī)分為5 組：正常組、模型組、別嘌醇組（10 mg/kg）和MSQ 組（300 mg/kg，600 mg/kg），每組10 只，正常組和模型組灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉，給藥組灌胃相應(yīng)的藥液，10 mL/kg，每天給藥1 次，連續(xù)5 d；末次給藥后1 h，除正常組外，其余各組動物腹腔注射氧嗪酸鉀建立高尿酸血癥模型，正常組注射等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉；給藥后1 h，小鼠眼眶靜脈取血0.5 mL，室溫放置1 h，以3 500 r/min 離心，取血清。

1.4.3.4 指標(biāo)測定

本實驗UA 濃度均由尿酸檢測試劑盒測定，檢測原理是尿酸在水和氧氣的存在下通過尿酸酶形成尿囊素，過氧化氫和4-APP 及TOOS 在過氧化物酶的作用下形成醌系色素，在特定波長處比色，可計算出尿酸的濃度。按操作說明書將小鼠血清5 μL 加入至96 孔板里，超純水5 μL 作為空白品，試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)液5 μL 作為標(biāo)準(zhǔn)品，底液250 μL 后混勻，37 ℃孵育10 min，波長510 mm，放入酶標(biāo)儀讀取吸光度，通過計算公式測定尿酸濃度。

式中：A測為測定管吸光值；A標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)管吸光值；C標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，500 μmol/L。

1.4.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用Graphpad prism 8.0 比較進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，以p＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 模型建立實驗

采用氧嗪酸鉀進(jìn)行小鼠腹腔注射，構(gòu)建HUA 模型。如果SUA 水平明顯升高，即表明模型復(fù)制成功。由圖1 可知，造模后，不同濃度氧嗪酸鉀對小鼠血清中尿酸值與正常組相比，血清中尿酸值濃度顯著升高（p＜0.001），表明氧嗪酸鉀可成功復(fù)制大鼠急性HUA 模型。

圖1 不同濃度氧嗪酸鉀造模后小鼠血清中尿酸值的變化

2.2 陽性對照物的選擇及其劑量的研究

選擇0.5%羧甲基纖維素鈉和別嘌醇作為陽性對照物并通過比較UA 水平，篩選出最佳陽性藥劑量。由表2 可知，選擇別嘌醇作為陽性對照物，別嘌醇組明顯降低由氧嗪酸鉀引起的高尿酸值（p≤0.05）。

表2 別嘌醇對小鼠血清中尿酸值的影響（±s，n=10）

表2 別嘌醇對小鼠血清中尿酸值的影響（±s，n=10）

組別UA 濃度/（μmol/L）0.5% CMC-Na53.13±29.64 5 mg/kg 別嘌醇43.13±25.76 10 mg/kg 別嘌醇24.38±7.48 20 mg/kg 別嘌醇33.75±14.49

2.3 MSQ 對氧嗪酸鉀致小鼠急性高尿酸血癥的影響

由圖2 可知，造模后，不同濃度MSQ 對小鼠血清中尿酸值與模型組相比，血清中尿酸值濃度基本無變化，表明MSQ 無抗急性高尿酸作用。

圖2 不同藥物對急性高尿酸模型小鼠血清中尿酸值的影響

氧嗪酸鉀是一種競爭性尿酸酶抑制劑，可阻斷肝臟尿酸酶的作用，并在嚙齒類動物中產(chǎn)生尿酸，是合適嚙齒類動物的高尿酸造模用藥[3]。氧嗪酸鉀不溶于水，采用腹腔注射氧嗪酸鉀造模，采用合適的溶劑是成功的關(guān)鍵。0.5%羧甲基纖維素鈉是脂溶性物質(zhì)的常用助懸溶劑，可作為灌胃的輔料，不能作為腹腔注射溶液。因此，本文采用生理鹽水進(jìn)行溶解氧嗪酸鉀，效果良好，可供借鑒使用。

由于前期實驗表明，性別不同的小鼠對氧嗪酸鉀所致的高尿酸狀態(tài)差異較大，雄性小鼠相對較為穩(wěn)定，因此本文采用單一性別的雄性小鼠進(jìn)行實驗。急性高尿酸血癥模型的另一個關(guān)鍵點是，造模后的尿酸測定時間的控制。氧嗪酸鉀造模1 h 后尿酸顯著升高，并隨后逐漸下降，因此實驗中應(yīng)保證各組取樣時間一致。

目前高尿酸的治療多以化學(xué)藥為主，但長期服用會導(dǎo)致嚴(yán)重副作用。中藥具有多成分、多靶點、副作用小的特點，是新藥篩選的寶庫，采用簡單有效的動物模型進(jìn)行藥效學(xué)驗證，是一個有效的中藥新藥篩選途徑[4]。本文采用急性高尿酸血癥模型評價蔓三七提取物的抗尿酸作用，可知該部分蔓三七干葉無抗急性高尿酸作用。

3 結(jié)論

通過腹腔注射氧嗪酸鉀建立高尿酸血癥模型，將造模成功的雄性KM 小鼠采用不同劑量的MSQ 灌胃治療5 d 后，MSQ 未表現(xiàn)出對氧嗪酸鉀致小鼠急性高尿酸模型具有抗尿酸作用。