王昌建，張鵬軒，2，馬 沛，何世成，唐小明，胡巧云，彭 志，林 源，王衛(wèi)國(guó)，劉道新

（1.湖南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南 長(zhǎng)沙 410014；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.湖南中凈生物科技有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410600）

我國(guó)畜禽養(yǎng)殖正在向集約化、規(guī)模化發(fā)展，動(dòng)物疫病群防群控問題變得日益突出。在動(dòng)物傳染病防控過程中，消毒是消滅病原微生物的一種重要方式，徹底消毒能夠有效切斷傳播途徑，阻斷傳染病的傳播。2018年10月非洲豬瘟傳入我國(guó)，迅速在我國(guó)范圍內(nèi)傳播，給養(yǎng)殖行業(yè)帶來(lái)了災(zāi)難性的打擊[1-3]。由于尚沒有有效疫苗和藥物防控，非洲豬瘟的防控主要依賴生物安全等級(jí)的提高，這也意味著養(yǎng)豬業(yè)對(duì)消毒技術(shù)和消毒效果提出了更高的要求[4]。

目前，市場(chǎng)上有各類消毒設(shè)備，大多數(shù)傳統(tǒng)消毒設(shè)備將消毒劑呈水滴或霧滴形態(tài)噴灑出去，消毒后很難具有空間性與持續(xù)性。現(xiàn)有一種新型懸浮空間消毒技術(shù)，可將消毒劑結(jié)合增效劑形成納米噴霧，能夠均勻擴(kuò)散到消毒空間的每個(gè)角落，在空氣中懸浮時(shí)間持久，達(dá)到物體表面消毒和空間范圍內(nèi)徹底消毒的目的。因此，本研究主要評(píng)價(jià)懸浮空間消毒技術(shù)在物體表面及空間的消毒效果，驗(yàn)證其懸浮消毒噴霧持續(xù)消毒的可能性，以及該技術(shù)在實(shí)際生產(chǎn)環(huán)境中消毒的效果和實(shí)用性。

1 試驗(yàn)材料

1.1 消毒設(shè)備與消毒劑

使用的消毒設(shè)備為一種新型懸浮消毒機(jī)，使用的消毒劑為復(fù)方戊二醛（15%戊二醛、10%烴銨鹽）、癸甲溴銨（50%），均購(gòu)自幻影三陸零農(nóng)牧科技有限公司。

1.2 主要試驗(yàn)器材與試劑

超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、電子天平、生化培養(yǎng)箱、移液器、金黃色葡萄球菌29213菌株、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、生理鹽水、棉拭子。

2 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)與方法

2.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)室部分和豬場(chǎng)部分。實(shí)驗(yàn)室部分試驗(yàn)時(shí)間為2019年9—10月，地點(diǎn)是長(zhǎng)沙市寧鄉(xiāng)高新區(qū)。豬舍部分試驗(yàn)時(shí)間為2019年11—12月，地點(diǎn)是湖南省瀏陽(yáng)市淳口鎮(zhèn)。

2.2 懸浮空間消毒技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室消毒效果及持續(xù)消毒效果的評(píng)價(jià)方法

2.2.1 制備指示菌平皿 參照《獸用消毒劑鑒定技術(shù)規(guī)范》（1992）農(nóng)（牧藥）字第101號(hào)，選用金黃色葡萄球菌29213菌株為消毒試驗(yàn)指示菌。開封凍干菌種后，進(jìn)行細(xì)菌繁殖體菌懸液的制備與活菌計(jì)量，通過菌液梯度稀釋，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平行，在固體培養(yǎng)基上涂菌，37 ℃培養(yǎng)24 h，選平皿菌落可計(jì)數(shù)范圍在30～300個(gè)，將計(jì)數(shù)結(jié)果換算成每毫升原液的菌量。原液計(jì)數(shù)后，將菌液稀釋成所需濃度，取100 μL菌液接種到LB固體培養(yǎng)基表面，用滅菌的涂布棒涂布均勻，制備60～80個(gè)含有種子菌的平皿作為指示菌平皿。

2.2.2 試驗(yàn)場(chǎng)地 消毒試驗(yàn)選擇在兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)室1體積為54.46 cm3（長(zhǎng)寬高為：626 cm×290 cm×300 cm），實(shí)驗(yàn)室2體積為57.75 cm3（長(zhǎng)寬高為：500 cm×350 cm×330 cm）。試驗(yàn)組選用兩種消毒劑（復(fù)方戊二醛與癸甲溴銨），使用懸浮空間消毒方式分兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)進(jìn)行消毒；待消毒劑在實(shí)驗(yàn)室徹底散除后，再次選用復(fù)方戊二醛使用常規(guī)噴灑消毒作為對(duì)照組。消毒前將房間密閉，分開放置指示菌平皿于房間內(nèi)5個(gè)不同位點(diǎn)，不同高度。指示菌平皿放置高度下見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)室空間放置的指示菌平皿高度

2.2.3 消毒方法 試驗(yàn)所用消毒劑復(fù)方戊二醛與癸甲溴銨以及增效劑依據(jù)廠家說明，量取實(shí)驗(yàn)室所需劑量。對(duì)照組常規(guī)噴灑消毒所用消毒劑依據(jù)廠家說明稀釋到相應(yīng)比例后使用噴霧消毒工具進(jìn)行噴灑；試驗(yàn)組所用消毒劑無(wú)需稀釋，開機(jī)對(duì)房間進(jìn)行消毒。

2.2.4 試驗(yàn)分組與設(shè)計(jì) 為比較懸浮空間消毒技術(shù)與常規(guī)噴灑消毒的消毒效果，試驗(yàn)組與對(duì)照組消毒噴霧后，在固定的時(shí)間打開房間，取出和放入對(duì)應(yīng)分組的指示菌平皿。消毒時(shí)間段0～0.5 h、0～1 h，代表作用0.5 h、1 h對(duì)指示菌平皿的影響。為進(jìn)一步驗(yàn)證懸浮空間消毒技術(shù)在空間與物體表面的持續(xù)消毒效果，在消毒噴霧完成1 h、2 h后，再分別放進(jìn)新的指示菌平皿消毒1 h，看空間懸浮消毒劑是否能繼續(xù)具有消毒作用，消毒時(shí)間段為1～2 h、2～3 h。試驗(yàn)所用指示菌平皿分批分次放入和拿出，具體分組下見表2。

表2 指示菌平皿分組

2.2.5 平皿培養(yǎng)計(jì)數(shù) 消毒試驗(yàn)結(jié)束后，將所有組的指示菌平皿與對(duì)比參照平皿，放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)后對(duì)每個(gè)平皿進(jìn)行計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

2.2.6 殺菌率判定

2.3 懸浮空間消毒技術(shù)在豬舍中消毒效果的評(píng)價(jià)方法

2.3.1 制備指示菌平皿 制備方法同2.2.1，制備20～40個(gè)含有種子菌的平皿供消毒試驗(yàn)使用，準(zhǔn)備100個(gè)空的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿培養(yǎng)基供空氣沉降消毒試驗(yàn)使用。

2.3.2 試驗(yàn)場(chǎng)地 瀏陽(yáng)市某豬場(chǎng)進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)豬舍長(zhǎng)200 m、寬20 m，舍內(nèi)設(shè)備配套齊全。選擇2個(gè)豬舍（圖1），豬舍A體積為98.68 m3（長(zhǎng)寬高為2.67 m×4.2 m×8.8 m），豬舍B體積為84.00 m3（2.58 m×3.7 m×8.8 m）。每個(gè)豬舍相對(duì)密閉隔離，不對(duì)豬舍進(jìn)行前期消毒，將豬分別飼喂在2個(gè)豬舍，飼養(yǎng)1個(gè)星期后，把試驗(yàn)動(dòng)物趕離隔離豬舍進(jìn)行飼養(yǎng)。消毒前對(duì)畜禽圈舍進(jìn)行沖洗，沖洗干凈后空出場(chǎng)地用于表面消毒和空氣消毒試驗(yàn)。

圖1 試驗(yàn)場(chǎng)地平面示意

2.3.3 試驗(yàn)分組 復(fù)方戊二醛組：使用懸浮空間消毒技術(shù)在密閉豬舍A內(nèi)進(jìn)行表面與空氣消毒試驗(yàn)。癸甲溴銨組：使用懸浮空間消毒技術(shù)在密閉豬舍B內(nèi)進(jìn)行表面與空氣消毒試驗(yàn)。

2.3.4 表面消毒試驗(yàn)

（1）物體表面環(huán)境菌采樣：消毒前與消毒4 h后分別在畜禽圈舍取5個(gè)位點(diǎn)采樣，分別為地面2個(gè)點(diǎn)、食槽2個(gè)點(diǎn)和墻面，取樣時(shí)將棉拭子用生理鹽水浸潤(rùn)后，在面積為5 cm×5 cm的地面或其他物體表面橫直各用力擦拭10次，并不斷轉(zhuǎn)換拭子擦拭面，把拭子棉花端剪入1 mL采樣液內(nèi)用力振搖100次（振蕩器30 s），將菌洗脫，洗液以生理鹽水10倍稀釋3個(gè)梯度，分別在營(yíng)養(yǎng)瓊脂涂布均勻后放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后作活菌計(jì)數(shù)。

（2）物體表面指示菌試驗(yàn)：消毒前在畜禽圈舍內(nèi)選擇不同高度的5個(gè)位點(diǎn)放置涂布有指示菌的平皿，5個(gè)點(diǎn)分別為欄桿高低2個(gè)位點(diǎn)、食槽、地面和窗臺(tái)，每個(gè)采樣點(diǎn)放置2個(gè)平皿，一共放置10個(gè)營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿，消毒0.5 h、4 h后各取出一批平皿，放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后作活菌計(jì)數(shù)（表3）。

表3 豬舍表面消毒指示菌平皿位置高度 cm

2.3.5 豬舍空氣細(xì)菌消毒試驗(yàn) 采用平板沉降法采樣，在消毒前后圈舍內(nèi)離地面1 m的高度的不同位置放置空營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿，打開平皿（平皿蓋至于皿底，不可仰放，防止污染），每個(gè)平皿暴露于空氣中，一共放置5個(gè)，同時(shí)放一個(gè)空的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)平皿于桌面上不啟蓋，以作對(duì)照。15 min后，依次蓋好平皿，記錄每組采樣時(shí)間，保證每組采樣時(shí)間基本一致。消毒1 h后（不開門窗）采用同樣的采樣方法、位置、次數(shù)、間隔時(shí)間、采樣時(shí)間等，采樣后的平皿置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后作活菌計(jì)數(shù)。

2.3.6 殺菌率的計(jì)算

（1）表面消毒試驗(yàn)殺菌率：

（2）空氣細(xì)菌消毒試驗(yàn)殺菌率：空氣細(xì)菌總數(shù)（cfu/m3）=N×50 000/（A×T）。式中：N為平皿菌落數(shù)，A為平皿面積（cm2），T為平皿暴露時(shí)間（min）。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)兩種消毒方式殺滅指示菌結(jié)果

3.1.1 金黃色葡萄球菌原液計(jì)數(shù)結(jié)果 通過將目標(biāo)菌菌液進(jìn)行10倍的梯度稀釋，選擇合適的稀釋倍數(shù)進(jìn)行涂板、計(jì)數(shù)，最終確定的菌液中菌落數(shù)以及指示菌平皿上的菌落數(shù)如表4所示。

表4 金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)結(jié)果

3.1.2 兩種消毒方式的消毒效果比較 通過兩種不同消毒設(shè)備、不同消毒劑消毒噴霧后，消毒噴霧作用0.5 h、1 h對(duì)指示菌平皿的影響，最終確定這兩種消毒方式的殺菌率。結(jié)果顯示，試驗(yàn)組用復(fù)方戊二醛對(duì)實(shí)驗(yàn)室消毒，懸浮空間消毒的指示菌平皿在實(shí)驗(yàn)室暴露0.5 h、1 h后，活菌數(shù)均為0，對(duì)指示菌殺滅率均為100%；試驗(yàn)組用癸甲溴銨消毒，懸浮空間消毒的指示菌平皿在實(shí)驗(yàn)室暴露0.5 h、1 h后，活菌數(shù)均為0，對(duì)指示菌殺滅率均為100%。對(duì)照組用復(fù)方戊二醛對(duì)實(shí)驗(yàn)室消毒，噴壺噴灑消毒的指示菌平皿在實(shí)驗(yàn)室暴露0.5 h、1 h后，活菌數(shù)均為0，對(duì)指示菌殺滅率均為100%。試驗(yàn)表明，兩種消毒方式在實(shí)驗(yàn)室作用0.5 h或1 h，均對(duì)指示菌有明顯的殺菌作用，殺菌率均為100%（表5）。3.1.3 兩種消毒方式消毒后持續(xù)消毒效果研究 兩種不同消毒設(shè)備、不同消毒劑分別在消毒噴霧后1 h、2 h，在實(shí)驗(yàn)室5個(gè)位點(diǎn)再放入新的指示菌平皿，消毒噴霧作用時(shí)長(zhǎng)為1 h，驗(yàn)證懸浮的消毒噴霧是否還有消毒作用，以及消毒噴霧持續(xù)消毒效率。結(jié)果顯示，癸甲溴銨組這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)放入的指示平皿培養(yǎng)后均沒有菌落生長(zhǎng)；復(fù)方戊二醛組使用分析懸浮消毒技術(shù)后，1 h放入的平皿沒有菌落，2 h放入的平皿有3～8個(gè)零星的菌落；常規(guī)噴灑復(fù)方戊二醛組的平皿上都長(zhǎng)出了菌苔，大于300個(gè)菌落，見表6。

表5 懸浮空間消毒方式和噴壺噴灑消毒方式消毒結(jié)果對(duì)比

表6 兩種消毒方式持續(xù)消毒結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，常規(guī)噴灑消毒在對(duì)實(shí)驗(yàn)室消毒1 h后，對(duì)新的指示菌平皿殺菌效果顯著下降，殺菌率低于98.5%；懸浮空間消毒技術(shù)在對(duì)實(shí)驗(yàn)室消毒后3 h內(nèi)，仍具有較強(qiáng)的殺菌作用，對(duì)新的指示菌平皿殺菌率達(dá)到99.9%以上。

3.2 豬舍物體表面消毒與空氣消毒試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 金黃色葡萄球菌原液計(jì)數(shù)結(jié)果 通過將菌液進(jìn)行10倍的梯度稀釋，選擇合適的稀釋倍數(shù)進(jìn)行涂板、計(jì)數(shù)，菌液濃度為1.9×109cfu/mL， 涂布指示菌平皿上的菌量為1.9×104cfu。

3.2.2 豬舍物體表面消毒試驗(yàn)結(jié)果

（1）兩種消毒劑對(duì)指示菌平皿的殺菌結(jié)果。懸浮空間消毒技術(shù)使用兩種不同消毒劑，分別在密閉豬舍消毒噴霧后，消毒噴霧作用0.5 h、4 h對(duì)指示菌平皿的影響，最終確定不同消毒劑的殺菌率。結(jié)果顯示，用復(fù)方戊二醛懸浮空間消毒方式對(duì)密閉豬舍消毒，指示菌平皿在密閉豬舍暴露0.5 h，4個(gè)指示菌平皿均沒有長(zhǎng)出菌落，1個(gè)平皿長(zhǎng)出61個(gè)菌落；指示菌平皿在密閉豬舍暴露4 h后，5個(gè)指示菌平皿菌沒有菌落生長(zhǎng)。懸浮空間消毒技術(shù)用癸甲溴銨消毒，指示菌平皿在密閉豬舍暴露0.5 h、4 h后，10個(gè)指示菌平皿都沒有菌落生長(zhǎng)，表明平皿上的細(xì)菌都被殺滅（表7）。試驗(yàn)表明，懸浮空間消毒技術(shù)用兩種消毒劑在密閉豬舍內(nèi)作用0.5 h，即對(duì)指示菌有明顯的殺菌作用，殺菌率均大于99%；作用4 h后，指示菌殺菌率均達(dá)到100%。

表7 豬舍環(huán)境消毒后指示菌計(jì)數(shù)結(jié)果

（2）兩種消毒劑對(duì)物體表面菌的殺菌結(jié)果。用兩種不同消毒劑，分別在密閉豬舍消毒，消毒前后分別在食槽、墻面、地面等地方采樣、培養(yǎng)細(xì)菌后計(jì)數(shù)，計(jì)算出取樣面積內(nèi)的菌量，計(jì)算確定不同消毒劑的對(duì)密閉豬舍不同位置物體表面菌的殺菌率。結(jié)果顯示，用復(fù)方戊二醛消毒劑采用懸浮空間消毒的方式對(duì)密閉豬舍消毒，對(duì)地面上細(xì)菌殺滅率均能達(dá)到97.6%以上，對(duì)墻面上細(xì)菌殺滅率均能達(dá)到99.6%以上，對(duì)食槽上細(xì)菌殺滅率能達(dá)到100%。消毒對(duì)豬舍物體表面菌的殺菌率平均能達(dá)到99%以上。

懸浮空間消毒設(shè)備用癸甲溴銨消毒劑對(duì)密閉豬舍消毒，對(duì)地面上細(xì)菌殺滅率均能達(dá)到98.2%以上，對(duì)墻面上細(xì)菌殺滅率均能達(dá)到95.6%以上，對(duì)食槽上細(xì)菌殺滅率能達(dá)到99.2%以上。消毒對(duì)豬舍物體表面菌的殺菌率平均能達(dá)到98%以上（表8）。

表8 豬舍消毒后物體表面的指示菌計(jì)數(shù)結(jié)果

試驗(yàn)表明，懸浮空間消毒技術(shù)用兩種消毒劑在密閉豬舍內(nèi)消毒后，即對(duì)豬舍地面、墻面、食槽等表面菌有明顯的殺菌作用，殺菌率均大于98%。

3.2.3 豬舍空氣消毒試驗(yàn)結(jié)果 使用兩種不同消毒劑，分別在密閉豬舍消毒，消毒前后分別在圈舍內(nèi)離地面1 m高的5個(gè)位點(diǎn)放置無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿、培養(yǎng)細(xì)菌后計(jì)數(shù)，計(jì)算確定不同消毒劑對(duì)密閉豬舍空氣中細(xì)菌的殺菌率。結(jié)果顯示，懸浮空間消毒技術(shù)采用復(fù)方戊二醛消毒劑對(duì)密閉豬舍消毒，消毒前空氣中的平均菌數(shù)為8.5×103cfu/cm3，消毒后空氣中的平均菌數(shù)為1.8×102cfu/cm3。消毒對(duì)空氣中細(xì)菌的殺菌率能達(dá)到97.9%以上。懸浮空間消毒技術(shù)采用癸甲溴銨消毒劑對(duì)密閉豬舍消毒，消毒前空氣中的平均菌數(shù)為5.8×103cfu/cm3，消毒后空氣中的平均菌數(shù)為4.6×102cfu/cm3。消毒對(duì)空氣中細(xì)菌的殺菌率能達(dá)到92.1%以上（表9）。

表9 豬舍消毒后舍內(nèi)空氣菌計(jì)數(shù)

試驗(yàn)表明，應(yīng)用懸浮空間消毒技術(shù)經(jīng)兩種消毒劑在密閉豬舍內(nèi)消毒后，對(duì)豬舍空氣中細(xì)菌有明顯的殺菌作用，均能達(dá)到90%以上，復(fù)方戊二醛對(duì)空氣中細(xì)菌的殺菌作用略為明顯。

4 討論

隨著我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，生物安全問題在豬場(chǎng)養(yǎng)殖業(yè)中愈發(fā)重要，高效高質(zhì)量的消毒設(shè)備更能為豬群健康成長(zhǎng)保駕護(hù)航。本研究通過實(shí)驗(yàn)室與豬舍消毒試驗(yàn)，對(duì)一種新型的懸浮空間消毒技術(shù)的殺菌效能、適用性進(jìn)行評(píng)價(jià)研究，結(jié)果顯示其在實(shí)驗(yàn)室和豬舍對(duì)于物體表面和空間都有很好的消毒效果。

該技術(shù)與傳統(tǒng)噴灑或超聲波的消毒方式相比較，創(chuàng)新之處在于增加了增效劑，集成微泵技術(shù)將常用的化學(xué)消毒劑形成懸浮狀消毒噴霧，消毒噴霧可以充滿消毒的空間，并在空間內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間懸浮，通過調(diào)節(jié)消毒劑噴霧的濃度和消毒的有效作用時(shí)間，可以達(dá)到預(yù)期的消毒效果。這種消毒方式將消毒劑最大程度地送到空間每個(gè)接觸面，還能實(shí)現(xiàn)消毒劑在空間長(zhǎng)時(shí)間懸浮，實(shí)現(xiàn)空間的空氣和物體表面同時(shí)消毒，解決了以往噴霧消毒作用時(shí)間不能保證、消毒面不確定是否均勻的問題，讓消毒可以做到更專業(yè)、更可控、更有效。

在當(dāng)前非洲豬瘟疫情背景下，豬病形勢(shì)嚴(yán)峻，勢(shì)必需要明確消毒效果保證豬場(chǎng)生物安全體系的有效執(zhí)行。新型的消毒設(shè)備可以通過控制噴射時(shí)間定量消毒劑驗(yàn)證消毒效果，為豬場(chǎng)有效消毒提供了技術(shù)支撐和強(qiáng)效的工具。空間消毒的性能較高，可供豬場(chǎng)生產(chǎn)中的空間和物體表面消毒，如豬舍、倉(cāng)庫(kù)、辦公室、藥品房、車輛等地方消毒使用。該設(shè)備操作簡(jiǎn)單，一鍵啟動(dòng)，應(yīng)用于生產(chǎn)一線，大幅提高了工作人員的消毒效率。