李小琴，張鳳良，毛常麗，楊 湉，趙 祺，吳 裕

（云南省熱帶作物科學(xué)研究所，云南景洪666100）

橡膠樹（Hevea brasiliensis）原產(chǎn)于南美洲亞馬遜河流域，是典型的熱帶雨林經(jīng)濟(jì)樹種，對低溫較為敏感，當(dāng)溫度低于5℃時，便會出現(xiàn)不同程度的寒害［1］。我國植膠區(qū)地處熱帶北緣，冬季低溫寒害時常發(fā)生，嚴(yán)重限制著我國天然橡膠產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，因此，選育高產(chǎn)抗寒品種是我國橡膠樹育種的長期目標(biāo)之一。橡膠樹種質(zhì)資源的抗寒性鑒定已成為橡膠樹良種培育的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，目前橡膠樹抗寒性鑒定多以田間自然寒害后的調(diào)查統(tǒng)計(jì)［2-4］及人工模擬低溫寒害研究［5-10］為主。本研究以4 個橡膠樹無性系品種一年生苗木為試驗(yàn)材料，選用同一低溫不同處理時長及同一時長不同低溫處理，兩種抗寒鑒定方法相結(jié)合，通過測定其相對電導(dǎo)率的變化，同時計(jì)算其半致死時間及半致死溫度，對各品種的抗寒性進(jìn)行評價(jià)，擬找出一種室內(nèi)能快速鑒定橡膠樹幼苗抗寒性的方法，為橡膠樹種質(zhì)資源鑒定提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)地位于云南省熱帶作物科學(xué)研究所“農(nóng)業(yè)部景洪橡膠樹種質(zhì)資源圃”（100°46′～100°48′ E，21°59′～22°01′ N）苗圃地內(nèi)。選取 4 個橡膠樹無性系品種的一年生休眠枝條為試材，所選品種為 GT1、云研 77-4、IAN873 及熱墾 525。

所用苗木均以GT1 開放授粉實(shí)生苗為砧木繁殖成無性系，2019 年采集芽條，芽接成活后于2020 年 4 月鋸干，按株行距 0.6 m×0.8 m 育苗保留。苗圃地按照常規(guī)育苗管理，苗木生長良好。

1.2 方法

試驗(yàn)于2021 年2 月下旬進(jìn)行。設(shè)同一低溫不同時長和同一時長不同低溫兩種人工模擬低溫脅迫試驗(yàn)，以評價(jià)各品種的抗寒性。

從每個橡膠樹無性系品種隨機(jī)選取3 株長勢均勻的植株，剪下自上而下第三蓬葉所在的均處于半木質(zhì)化狀態(tài)的枝條，采好后用塑封帶封好編號，帶回實(shí)驗(yàn)室用自來水和蒸餾水沖洗，洗凈后吸干水分備用。

1.2.1 不同時間梯度試驗(yàn)

將LRG-1000-LT 型低溫人工氣候箱預(yù)設(shè)為：溫度-2℃，濕度60%，設(shè)置同一溫度不同的5 個時間梯度：未處理（0 h，對照）、5 h、10 h、15 h 和20 h。

放入氣候箱之前先進(jìn)行一次對照組的制樣，隨后將所有枝條一同放入，每個處理重復(fù)3 次。為減少采樣差異，使用同樣的3 根枝條進(jìn)行所有時間梯度處理。每個時間梯度的樣品制備后隨即將枝條放入氣候箱繼續(xù)下一個梯度處理，直到處理完成。

1.2.2 不同溫度梯度試驗(yàn)

將低溫人工氣候箱設(shè)置5 個溫度梯度：0℃（對照）、-1℃、-1.5℃、-2℃和-2.5℃，每個處理持續(xù)時間均為15 h，濕度設(shè)為60%，每組重復(fù)3 次。

1.2.3 相對電導(dǎo)率測定方法

將經(jīng)過處理的枝條從低溫人工氣候箱中取出，選取枝條中部，避開芽眼，每個樣準(zhǔn)確裁取0.5 cm×0.5 cm 的枝條韌皮部2 片，隨即放入試管中，加入超純水20 mL，蓋上試管蓋后搖勻，室溫放置24 h，期間搖勻數(shù)次。

用SG3-ELK 型便攜式電導(dǎo)率儀先測出初始電導(dǎo)值（C1），再蓋上試管蓋，沸水浴30 min，取出冷卻至室溫后，再測出終電導(dǎo)值（C2），同時測定超純水的電導(dǎo)值（C0）。以相對電導(dǎo)率表示細(xì)胞膜透性大小，按以下公式進(jìn)行計(jì)算相對電導(dǎo)率：

相對電導(dǎo)率REC（%）=（C1-C0）（/C2-C0）×100%

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003 對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理作圖和計(jì)算，用SPSS 23.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。

對不同時間/不同低溫處理下的相對電導(dǎo)率變化用 Logistic 方程Y=K/（1+ae-bt）擬合。其中：Y為相對電導(dǎo)率，t為處理時間/溫度，K、a、b為參數(shù)，K為Y的最 大 極 限 值 ，b反映了t與Y之間的對應(yīng)關(guān)系，a表示曲線對原點(diǎn)的相對位置。求該方程的二階導(dǎo)數(shù)并令其為零，可獲得曲線的拐點(diǎn)的t值，即t=（lna）/b，t為半致死時間/半致死溫度LT50。拐點(diǎn)t值溫度值越低，表明其半致死溫度越低，即該樹種抗寒性越強(qiáng)［11］。

2 結(jié)果與分析

2.1 同一溫度不同處理時間對橡膠樹相對電導(dǎo)率的影響

4 個橡膠樹無性系品種經(jīng)同一低溫（-2℃）不同處理時長枝條相對電導(dǎo)率的變化情況見圖1?？芍?，隨著低溫持續(xù)時間的延長，相對電導(dǎo)率呈“先緩慢上升—快速上升”的變化趨勢。處理5 h時，相對電導(dǎo)率整體均值（35.25%）僅比未處理的（31.97%）增加10.28%，表明5 h 的低溫對橡膠樹枝條組織基本沒有影響；到10 h 時，相對電導(dǎo)率整體均值增加至42.38% ，比未處理時增長32.57%，植物組織已開始受到寒害；隨著低溫持續(xù)時間的增加，至15 h 時，GT1 和熱墾525 兩個品種的相對電導(dǎo)率均已超過50%，4 個品種的整體均值達(dá)50.51%，此時低溫對組織的傷害已過半，受寒害程度較重；低溫持續(xù)到20 h 時，GT1 和熱墾525 兩個品種呈快速上升趨勢，分別達(dá)到87.04%和72.10%，說明在相對電導(dǎo)率超過50%后，橡膠樹對低溫更加敏感，隨著低溫的持續(xù)，組織受寒害程度迅速加重。

圖1 不同品種橡膠樹隨低溫處理時間的增加相對電導(dǎo)率的變化

2.2 不同品種橡膠樹半致死時間的比較

利用Logistic 方程對4 個橡膠樹品種在同一低溫下不同處理時長相對電導(dǎo)率進(jìn)行半致死時間的計(jì)算（表1）?？梢缘贸?，4 個品種按照半致死時間排序?yàn)樵蒲?77-4（19.79 h）＞IAN873（16.88 h）＞熱墾 525（13.73 h）＞GT1（10.40 h），Logistic 方程的擬合度R2在0.887～0.963 之間，擬合效果好。根據(jù)植物半致死時間越長，其抗寒性越強(qiáng)，可得出4 個品種抗寒性強(qiáng)弱依次為云研77-4＞IAN873＞熱墾525＞GT1，此結(jié)果與生產(chǎn)上已知的抗寒性相符，表明用此方法對橡膠樹無性系抗寒性進(jìn)行室內(nèi)鑒定是可行的。

表1 4個橡膠樹無性系品種半致死時間的比較

2.3 不同低溫處理對橡膠樹相對電導(dǎo)率的影響

在同一處理時間為15 h 的條件下，經(jīng)不同低溫脅迫后，4 個橡膠樹無性系品種枝條相對電導(dǎo)率的變化情況見圖2。隨溫度的降低，枝條韌皮部組織相對電導(dǎo)率呈“先緩慢上升—迅速上升到極值”的變化趨勢。在-1℃、-1.5℃及-2℃，3 個溫度點(diǎn)，其相對電導(dǎo)率的整體均值比對應(yīng)前一個溫度點(diǎn)分別上升24.63%、14.83%及19.59%，上升速度基本相當(dāng)，在-2℃低溫時，除云研77-4 相對電導(dǎo)率為48.25%（接近50%）以外，其余3 個品種均大于50%，說明-2℃（處理15 h）的低溫對橡膠樹傷害開始變大，橡膠樹對低溫變得敏感，與同一溫度不同時長所得結(jié)果相符合；當(dāng)?shù)蜏叵陆抵?2.5℃時，所有品種的相對電導(dǎo)率均超過90%，組織已基本死亡。

圖2 不同品種橡膠樹在不同低溫處理下相對電導(dǎo)率的變化

2.4 不同品種橡膠樹半致死溫度的比較

根據(jù)4 個橡膠樹品種經(jīng)不同低溫處理后枝條組織相對電導(dǎo)率變化，利用Logistic 方程計(jì)算出其半致死溫度（表2）?？芍?，4 個品種按半致死溫度排序?yàn)?GT1（-1.2℃）＞熱墾 525（-1.48℃）＞IAN873（-1.57℃）＞云研77-4（-1.61℃），擬合度R2在0.815～0.931 之間，擬合效果較好。根據(jù)半致死溫度越低，其抗寒性越強(qiáng)，可得出抗寒性最強(qiáng)的品種為云研77-4，最差的為GT1，與各品種田間表現(xiàn)結(jié)果相一致。

表2 4個橡膠樹無性系品種半致死溫度的比較

3 小結(jié)

當(dāng)植物受到低溫脅迫時，細(xì)胞膜作為細(xì)胞感受環(huán)境脅迫最敏感的部位首先受到傷害，致使膜透性增大，而抗寒性強(qiáng)的植物細(xì)胞膜受傷害較輕，電解質(zhì)外滲少。通過對外滲液的電導(dǎo)值變化進(jìn)行測定，可判斷出細(xì)胞膜傷害程度，進(jìn)而判斷植物抗寒性的大小。這種鑒定抗寒性的研究方法簡便、結(jié)果顯著，在植物上已廣泛應(yīng)用［12-15］。本試驗(yàn)同一溫度不同時長處理及同一時長不同低溫處理等兩種方法所測結(jié)果相似，4 個橡膠樹品種枝條組織相對電導(dǎo)率均呈先緩慢上升后快速上升的變化趨勢，當(dāng)相對電導(dǎo)率值達(dá)到50%后，橡膠樹對低溫環(huán)境表現(xiàn)出極不耐受性，當(dāng)出現(xiàn)極端點(diǎn)低溫，橡膠樹可能會出現(xiàn)大面積寒害現(xiàn)象。

在-2℃低溫下，4 個品種所測的半致死時間為10.40～19.79 h，品種間差異較大；在處理15 h時長下，半致死溫度為-1.2～-1.61℃，半致死溫度范圍較窄；2 個處理所測結(jié)果抗寒性排序完全相同，且與田間耐寒性的表現(xiàn)相符；從Logistic 方程擬合度情況來看，同一溫度不同處理時長所測效果更好，操作性更強(qiáng)且樣品誤差小。雖然自然界的寒害發(fā)生條件是復(fù)雜多變的，人工低溫模擬寒害測定不可能完全反映自然條件，但實(shí)驗(yàn)測定所采用的是同一水平下，所得結(jié)果可表現(xiàn)出橡膠樹種質(zhì)間的相對抗寒性，且能顯著縮短鑒定時間。因此，室內(nèi)采用電導(dǎo)法對橡膠樹種質(zhì)資源抗寒性進(jìn)行批量淘汰鑒定是可行的，根據(jù)所測相對電導(dǎo)率變化趨勢，建議選用-2℃低溫處理15 h 來對橡膠樹種質(zhì)幼苗期的抗寒性作快速初步鑒定。

此試驗(yàn)所采用的是經(jīng)過冬季自然低溫鍛煉的休眠枝，抗寒能力是一年中最強(qiáng)的時期，低溫寒害首先傷害的就是植物的樹皮，其對植物營養(yǎng)的運(yùn)輸起關(guān)鍵作用，選用枝條韌皮部做寒害測定材料具有代表性。后期將選擇不同樹齡、不同材料、不同季節(jié)及不同測定指標(biāo)更深入地進(jìn)行抗寒性綜合評價(jià)，以期為批量快速鑒定橡膠樹種質(zhì)資源抗寒性提供理論基礎(chǔ)。