汪昕 張旭 樊垚 魏來 沈沖 薛永★

作者單位：1.江蘇省淮安市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇，淮安223001

2.南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)系，江蘇，南京210000

精神分裂癥（schizophrenia，SZ）是一組發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、原因未明的精神系統(tǒng)性疾病，具有情感、意志、行為、感知等多種精神異常表現(xiàn)，以精神表現(xiàn)與現(xiàn)實(shí)環(huán)境之間的不一致為主要特點(diǎn)［1］。SZ 的發(fā)生涉及遺傳和環(huán)境因素的共同作用。全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome?wide association study，GWAS）發(fā)現(xiàn)了大量與SZ 相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）。鑒于CEP164基因和CENPU基因在SZ 及其他精神疾病中的研究尚未見報道，本研究通過TaqMan 基因分型技術(shù)檢測CEP164基因rs9163 位點(diǎn)和CENPU基因rs13478位點(diǎn)多態(tài)性，探討CEP164基因和CENPU基因變異與SZ 之間的關(guān)系，旨在從分子生物學(xué)角度探討CEP164基因和CENPU基因在SZ 人群中的遺傳機(jī)制，初步探索miRNA 在SZ 發(fā)生中的下游相關(guān)分子機(jī)制，為臨床診斷及治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取淮安市第三人民醫(yī)院2009年8月到2018年8月住院的SZ 患者2 555 例為病例組，其中男性1 173 例，女性1 382 例，平均年齡（34.72±13.08）歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：符合《疾病和有關(guān)健康問題的國際統(tǒng)計分類》第10 版（ICD?10）診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］。排除標(biāo)準(zhǔn)：腦器質(zhì)性和軀體疾病所致精神障礙、精神活性物質(zhì)所致精神障礙?；颊卟∏盁o肥胖、糖尿病、高血壓及內(nèi)分泌疾病史，無相關(guān)遺傳病史。同時選取同時期淮安市社區(qū)的健康人2 139 例為對照組，男性1 331 例，女性808 例，平均年齡（44.07±8.50）歲。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA 的提取

研究對象均在早晨空腹條件下，用EDTA 抗凝采血管采集靜脈血5 mL。在24 h 內(nèi)對血樣本進(jìn)行4 000 轉(zhuǎn)離心10 min，血漿分離至1.5 mL 離心管中。剩余血樣本留存放置于-80℃冰柜中保存。DNA 提取采用酚氯仿法。

1.2.2 SNP 位點(diǎn)的選擇

應(yīng)用生物信息學(xué)預(yù)測軟件PolymiRTS Database 3.0（2013）和NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的dbSNP 數(shù)據(jù)庫，進(jìn)一步篩選重復(fù)驗(yàn)證可能與SZ 相關(guān)聯(lián)的遺傳位點(diǎn)進(jìn)行研究，最終選擇CEP164基因rs9163 位點(diǎn)和CENPU基因rs13478 位點(diǎn)。

1.2.3 基因分型

應(yīng)用美國ABI 公司Taqman?MGB 探針技術(shù)完成研究對象的基因分型。針對rs9163 和rs13478兩個SNP 位點(diǎn)分別設(shè)計聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）引物和TaqMan 探針，進(jìn)行實(shí)時熒光PCR 擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增在ABI 9700 PCR 儀上讀取，實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過分析軟件SDS 2.3 獲得。整個PCR 反應(yīng)體系的體積為4.2 μL，具體包括1.6 μL 的Mix 預(yù)混液，正向引物和反向引物各0.1 μL，兩種探針各0.1 μL，去離子水1.2 μL，DNA 模板1 μL。

PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃預(yù)反應(yīng)2 min，95℃預(yù)變10 min；PCR 擴(kuò)增95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸1 min，45 個循環(huán)。rs9163 位點(diǎn)多態(tài)性PCR 正向引物：5′?CCACAACGGCAGCATCTCCA?3′，反向引物：5′?TCCTCCTGGGACACTTTGGGT?3′，TaqMan探針序列為5′?CAGGGCCAGGCAC?3′和5′?CCAGGG CCGGGCA?3′；rs13478 位點(diǎn)多態(tài)性PCR正向引物：AGGTAACAGCATGAGACTCGTCTT CCT?3′，反向引物：TCTGGGAGCCGAAAGCCATC?3′；TaqMan 探針序列為5′?TAGACTGCTCTTCT?CATC?3′和5′?TAGACTGCTTTTCTCATC?3′。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用多元Logistic 回歸模型分析基因位點(diǎn)多態(tài)性與SZ 的關(guān)聯(lián)性，計算比值比（odds ratio，OR）及其95%可信區(qū)間（confidence interval，CI），并校正年齡、性別協(xié)變量。健康對照組基因型進(jìn)行Hardy?Weinberg 平衡定律檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CEP164 基因和CENPU 基因多態(tài)性與SZ 的關(guān)聯(lián)分析

C 和T 等位基因在健康對照組中的分布頻率分別為85.6%和14.4%（rs9163 位點(diǎn)），67.7%和32.3%（rs13478 位點(diǎn)），符合Hardy?Weinberg 定律（P>0.05）。Logistic 回歸分析顯示，在調(diào)整性別和年齡后，rs9163 位點(diǎn)和與rs13478 位點(diǎn)相加模型、顯性模型和隱性模型與SZ 的關(guān)聯(lián)均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 CEP164 基因和CENPU 基因多態(tài)性與SZ 發(fā)生風(fēng)險的關(guān)聯(lián)分析Table 1 Association analysis of CEP164 gene and CENPU gene polymorphism with SZ risk

2.2 CEP164 基因和CENPU 基因變異與SZ 發(fā)生風(fēng)險的性別分層分析

Logistic 回歸分析顯示，在調(diào)整年齡后，無論是男性還是女性人群中，rs9163 和與rs13478 位點(diǎn)與SZ 關(guān)聯(lián)無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2 性別分層分析CEP164 基因和CENPU 基因多態(tài)性與SZ 的發(fā)生風(fēng)險Table 2 Gender stratified analysis of CEP164 gene and CENPU gene polymorphism and the risk of SZ

2.3 CEP164 基因和CENPU 基因變異與SZ 發(fā)生風(fēng)險的家族史分層分析

根據(jù)SZ 患者有無家族史為變量對研究對象分層，并調(diào)整年齡和性別，Logistic 回歸分析顯示，rs9163 和與rs13478 位點(diǎn)多態(tài)性與SZ 關(guān)聯(lián)均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

表3 家族史分層分析CEP164 基因和CENPU 基因多態(tài)性與SZ 的發(fā)生風(fēng)險Table 3 Stratified analysis of family history of CEP164 gene and CENPU gene polymorphism and the risk of SZ

3 討論

自2008年第1 篇關(guān)于SZ GWAS 分析的文章發(fā)表以來［3］，通過GWAS 分析已發(fā)現(xiàn)許多與SZ 相關(guān)的SNP［4?6］。以SZ 為焦點(diǎn)的GWAS 發(fā)現(xiàn)也具有交叉表型意義。研究發(fā)現(xiàn)rs13107325 T 等位基因與SZ、體重指數(shù)、高密度脂蛋白膽固醇、血壓以及N 端前腦鈉素（N?terminal forebrain natriuretic hor?mone，NT?proBNP）相關(guān)［7?12］。Verena 等［13］在染色體15q25.1 上的CHRNA3/CHRNA5/CHRNB4簇中發(fā)現(xiàn)了SZ 與肺癌的共同突變位點(diǎn)，另外兩個位點(diǎn)（6p22.1 和11q12.1）在肺癌和SZ 的相關(guān)組織類型中顯示交叉表型關(guān)聯(lián)和基因表達(dá)的下游多向效應(yīng)。本研究尚未發(fā)現(xiàn)CEP164基因和CENPU基因位點(diǎn)多態(tài)性與SZ 存在顯著性關(guān)聯(lián)，是否還有其他因素，如SZ 患者的生活環(huán)境、身體活動水平、其他疾病等因素影響rs9163 和rs13478 位點(diǎn)多態(tài)性對SZ 的發(fā)生風(fēng)險有待深入探討。

miRNA為一類長度約為18～25個核苷酸（nt）、具有高度保守性的非編碼的微小RNA，通過與靶基因的3′非翻譯區(qū)（3′Non?translation area，3′UTR）結(jié)合，抑制靶基因的翻譯過程或者降解靶基因mRNA 而在基因轉(zhuǎn)錄后水平起到調(diào)控作用［14］。研究表明，精神障礙性疾病的易感基因變異及相應(yīng)的生物學(xué)功能的改變與miRNA 表達(dá)量或者結(jié)構(gòu)改變有關(guān)聯(lián)［15］。本研究前期實(shí)驗(yàn)表明miR?328、miR?886?5p、miR1243、miR?663b、miR?1274a 可能參與SZ的發(fā)病機(jī)制。

位于靶基因mRNA 3′UTR 區(qū)miRNA 結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)的SNP 將會影響miRNA 與mRNA 的結(jié)合，從而使miRNA 對mRNA 的調(diào)控過程受阻。近年來，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)若干個位于miRNA 結(jié)合位點(diǎn)的SNP 對SZ的發(fā)生發(fā)展具有影響。William 等［16］發(fā)現(xiàn)miR?616與H3F3B轉(zhuǎn)錄本的結(jié)合會被位于H3F3B3′UTR 內(nèi)的rs1060120 的等位變異所改變，rs1060120 A 等位基因顯著降低了熒光素酶的表達(dá)，表明A 等位基因與miR?616的相互作用強(qiáng)于G等位基因，從而通過下游效應(yīng)增加了SZ 譜系診斷的風(fēng)險。Hou等［17］通過對GWAS SZ 相關(guān)變異位點(diǎn)的檢索發(fā)現(xiàn)，位于FURIN基因3′UTR 區(qū)rs4702?G 可通過增加miR?338?3p 的結(jié)合能力而參與FURIN的表達(dá)下調(diào)，而FURIN的表達(dá)量降低將導(dǎo)致成熟腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain de?rived neurotrophic factor，BDNF）的生成減少，后者的降低已經(jīng)報道與SZ 的發(fā)生相關(guān)。這些結(jié)果證實(shí)了位于miRNA 結(jié)合位點(diǎn)的SNP 可能改變SZ 的表觀遺傳機(jī)制，從而增加SZ 相關(guān)疾病的風(fēng)險。本研究應(yīng)用miRNA 靶基因預(yù)測軟件預(yù)測差異表達(dá)的miRNA 結(jié)合區(qū)域有2 個SNP 位點(diǎn)，分別為rs9163 位點(diǎn)和rs13478 位點(diǎn)，這兩位點(diǎn)在SZ 及其他精神疾病中的研究暫未見報道。本研究尚未發(fā)現(xiàn)這兩位點(diǎn)多態(tài)性與SZ 存在顯著性關(guān)聯(lián)，推測miRNA 并非通過結(jié)合rs9163 位點(diǎn)和rs13478 位點(diǎn)調(diào)控SZ 的發(fā)生，很有可能通過其他信號通路參與SZ的發(fā)生和發(fā)展。

現(xiàn)有的預(yù)測軟件或網(wǎng)站只能從生物信息學(xué)方面預(yù)測位于miRNA 結(jié)合位點(diǎn)的SNP 對miRNA 結(jié)合mRNA 的影響，具體的功能還需要構(gòu)建熒光報告載體驗(yàn)證。本研究初步表明了CEP164基因rs9163 位點(diǎn)和CENPU基因rs13478 位點(diǎn)變異與SZ的關(guān)系。為進(jìn)一步探討這兩位點(diǎn)與SZ 的關(guān)系，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將會檢測CEP164基因和CENPU基因在SZ 病例組和健康對照組中的表達(dá)，以及采用熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證CEP164基因和CENPU基因是否是miRNA 的靶基因。