張可，姜嵐，僧東杰，朱卿文

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）起源于解剖位置較為隱秘的鼻咽部，屬于頭頸部腫瘤之一，在我國南方發(fā)病率較高。臨床多采用放射聯(lián)合化學療法治療NPC，然而其早期易出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移和浸潤，且復(fù)發(fā)率較高［1］。腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲是發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的病理基礎(chǔ)［2］，探究NPC細胞增殖、遷移的分子機制，尋找相關(guān)治療靶點可能有益于其治療效果的提高。微小RNA（miRNA）是高度保守的短鏈（20～25個核苷酸）非編碼RNA分子，可以調(diào)控基因表達。研究顯示，miRNA表達失調(diào)及功能障礙可調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖及轉(zhuǎn)移，在NPC等腫瘤中發(fā)揮癌基因或腫瘤抑制基因的作用［3］。本研究旨在通過探討miR-132和Kruppel樣因子（KLF）7在NPC增殖、遷移和侵襲中的作用，以期為NPC的治療提供新靶標。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級7周齡NIH-Foxn1rnu裸大鼠（均為雄性）70只，購自北京維通利華公司［許可證號：SCXK（京）2016-0006］，體質(zhì)量200～220 g，于鄭州大學實驗動物中心［動物許可證號：SYXK（豫）2018-0004］進行本項研究，且實驗過程遵守3R原則。鼻咽癌組織及正常鼻咽上皮組織均來自鄭州兒童醫(yī)院病理科。CNE-2Z鼻咽癌細胞和NP69永生化正常鼻咽上皮細胞均購自中國醫(yī)學科學院細胞資源中心。RNA TriPure、反轉(zhuǎn)錄試劑及熒光定量PCR（qPCR）試劑購自Roche公司，LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；miR-132 mimics及陰性對照、KLF7-WT質(zhì)粒（攜帶KLF7 3'UTR原始序列）、KLF7-MUT質(zhì)粒（攜帶KLF7 3'UTR突變序列）、KLF7-OE質(zhì)粒及空質(zhì)粒均購自上海吉瑪公司；雙熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司；引物、二辛可寧酸二鈉（BCA）、HE及CCK-8試劑盒購自上海生工公司；β-actin兔多克隆抗體、KLF7兔多克隆抗體、CD34兔多克隆抗體及山羊抗兔IgG（HRP）購自Abcam公司；培養(yǎng)基購自HyClone公司；qPCR儀器購自Thermo公司；顯微鏡購自O(shè)lympus公司；電泳儀、酶標儀購自BioRad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 CNE-2Z鼻咽癌細胞采用RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%FBS、1%鏈霉素和青霉素）進行培養(yǎng)，NP69永生化正常鼻咽上皮細胞采用Keratinocyte-SFM培養(yǎng)基（含10%FBS）進行培養(yǎng)，每日早晚觀察細胞情況，2～3 d傳代1次，取第3代狀態(tài)良好的細胞進行實驗。CNE-2Z細胞分組：空白組（不轉(zhuǎn)染）、NC組（轉(zhuǎn)染miR-132 NC和空質(zhì)粒）、miR-132 mimics組（轉(zhuǎn)染miR-132 mimics）、KLF7-OE組（轉(zhuǎn)染KLF7-OE質(zhì)粒）和miR-132 mimics+KLF7-OE組（轉(zhuǎn)染miR-132 mimics和KLF7-OE質(zhì)粒）。根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明，采用無血清培養(yǎng)基制備LipofectamineTM3000脂質(zhì)體和miR-132 mimics或（和）KLF7-OE質(zhì)?；鞈乙?，分別加入到相應(yīng)組細胞中，混勻后置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

1.2.2 qPCR檢測miR-132表達 Trizol法提取鼻咽癌、正常鼻咽組織和細胞中的RNA，測定濃度后用試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板根據(jù)試劑盒說明配置qPCR反應(yīng)體系，檢測miR-132表達。擴增條件：95℃預(yù)變性1 min；95℃變性15 s，65℃退火35 s，68℃延伸45 s，設(shè)置40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參根據(jù)公式2-ΔΔCt計算組織及細胞中miR-132相對表達量。miR-132上游引物5'-ACCGTGGCTTTCGATTG-3'，下游引物5'-GAACATGTCTGCGTATCTC-3'，產(chǎn)物大小143 bp；U6上游引物5'-CCTCACTGTCCACCTTCCA-3'，下游引物5'-GGGTGTAAAACGCAGCTCA-3'，產(chǎn)物大小127 bp。

1.2.3 Western blot檢測KLF7蛋白表達 制備鼻咽癌及正常鼻咽組織的PBS勻漿液，收集各組細胞并經(jīng)PBS漂洗3次，加入蛋白裂解液混勻，冰上裂解15 min，離心分離上清液，BCA法測定所提取的蛋白濃度。分別取20μg按順序進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)印至PVDF膜，奶粉封閉，兔源一抗KLF7抗體（1∶1 000）和β-actin抗體（1∶500）4℃過夜孵育，洗膜后加入山羊抗兔IgG（HRP）二抗（1∶3 000）室溫孵育50 min，加入ECL發(fā)光液曝光拍照，根據(jù)目的蛋白和內(nèi)參β-actin條帶的灰度值計算組織及細胞中KLF7蛋白相對表達量。

1.2.4 網(wǎng)站預(yù)測及雙熒光素酶檢測KLF7與miR-132的靶向關(guān)系 經(jīng)TargetScan網(wǎng)站預(yù)測顯示，KLF7 mRNA 3'UTR區(qū)存在與miR-132序列配對結(jié)合的連續(xù)位點，進一步用雙熒光素酶檢測驗證KLF7與miR-132的靶向關(guān)系。CNE-2Z細胞分為KLF7-3'UTR-WT+miR-132 NC組、KLF7-3'UTR-WT+miR-132 mimics組、KLF7-3'UTR-MUT+miR-132 NC組和KLF7-3'UTR-MUT+miR-132 mimics組，用LipofectamineTM3000試劑盒分別將KLF7-WT質(zhì)粒、KLF7-MUT質(zhì)粒和miR-132 NC、miR-132 mimics轉(zhuǎn)染相應(yīng)細胞，48 h后收集細胞裂解后采用熒光素酶試劑盒進行檢測。以海腎熒光素酶為對照，根據(jù)螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性×100%計算報告基因的熒光素酶活性。

1.2.5 CCK-8實驗檢測細胞增殖能力 收集各組細胞重新接種于96孔板（每孔100μL含1×104個細胞），培養(yǎng)12、24、36、48、60 h后，將10μL CCK-8溶液加入各孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，輕輕混勻后上酶標儀測量各孔在450 nm處的光密度（OD）值，繪制細胞生長曲線。

1.2.6 Transwell實驗檢測細胞遷移及侵襲能力 收集各組細胞接種于Transwell小室上層（每孔200μL含5×104個細胞），下層加入500μL RPMI培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中24 h后取出小室上層，棉簽拭去上層凝膠和（或）細胞，浸沒在70%乙醇中固定15 min，PBS洗滌3次后蘇木精染色，封片并觀察。每個小室隨機讀取5個視野計算通過小室上層的平均細胞數(shù)，以評估CNE-2Z細胞遷移、侵襲能力。侵襲實驗前，將100μL基質(zhì)膠加在上層小室中，室溫過夜凝固，遷移實驗則不作此處理。

1.2.7 裸鼠成瘤實驗檢測腫瘤體內(nèi)生長情況 將雄性裸大鼠按照體質(zhì)量標號后采用隨機數(shù)字表法分為空白組（CNE-2Z）、NC組、miR-132 mimics組、KLF7-OE組和miR-132 mimics+KLF7-OE組，每組至少12只。取1.2.1中各組CNE-2Z細胞，用胰蛋白酶分離并計數(shù)。各組裸大鼠均經(jīng)腋窩外側(cè)皮下注射相應(yīng)0.2 mL細胞懸液（1.0×107細胞/mL）。每2天用游標卡尺測量一次裸大鼠腋窩處腫瘤的最小直徑（a）和最大直徑（b），根據(jù)公式1/2（a2×b）計算瘤體體積。

1.2.8 免疫組化檢測腫瘤血管密度 取各組裸大鼠的腫瘤組織制備石蠟切片，按順序進行脫蠟、水化、滅活內(nèi)源性過氧化物酶、抗原修復(fù)、一抗（CD34抗體）孵育、二抗孵育、鏈霉親和素-過氧化物酶孵育后，加入DAB顯色，蘇木素染液復(fù)染后脫水、透明、封片，顯微鏡下拍照觀察。每片任取6個視野，通過Image Pro Plus 6.0軟件進行圖像分析。判斷標準：CD34陽性表示內(nèi)皮細胞，由內(nèi)皮細胞圍繞成的不規(guī)則管腔結(jié)構(gòu)判斷為微血管。每張切片取6個視野進行微血管計數(shù)，以平均值代表腫瘤微血管密度（microvessel density，MVD）。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad 8.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以±s表示，2組間比較采用t檢驗，多組比較間比較采用one-way ANOVA，組間多重比較采用Bonferroni校正t檢驗分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-132在鼻咽癌組織及細胞中的表達 鼻咽癌組織中miR-132表達水平（0.35±0.05）較正常鼻咽組織（1.00±0.02）降低（n=30，t=66.111，P＜0.01）；鼻咽癌CNE-2Z細胞中miR-132表達水平（0.41±0.02）較正常鼻咽上皮細胞NP69（1.00±0.03）降低（n=6，t=40.083，P＜0.01）。

2.2 KLF7與miR-132靶向關(guān)系驗證及KLF7在鼻咽癌組織及細胞中的表達 經(jīng)TargetScan預(yù)測顯示，KLF7為miR-132的靶基因，見圖1。雙熒光素酶檢測結(jié)果顯示，KLF7-3'UTR-WT+miR-132 NC組、KLF7-3'UTR-WT+miR-132 mimics組、KLF7-3'UTR-MUT+miR-132 NC組和KLF7-3'UTR-MUT+miR-132 mimics組熒光素酶活性分別為1.00±0.03、0.45±0.03、1.02±0.05和1.01±0.02，差異有統(tǒng)計學意義（n=6，F(xiàn)=400.681，P＜0.01）。與KLF7-3'UTRWT+miR-132 NC組比較，KLF7-3'UTR-WT+miR-132 mimics組熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），KLF7-3'UTR-MUT+miR-132 NC組和KLF7-3'UTRMUT+miR-132 mimics組無明顯變化。Western blot結(jié)果顯示，鼻咽癌組織中KLF7蛋白表達水平（3.41±0.09）較正常鼻咽組織（1.00±0.03）增高（n=30，t=139.141，P＜0.01）；鼻咽癌CNE-2Z細胞中KLF7蛋白表達水平（3.37±0.06）較正常鼻咽上皮細胞NP69（1.00±0.02）增高（n=6，t=91.790，P＜0.01），見圖2。

Fig.1 The targeting relationship between KLF7 and miR-132圖1 KLF7與miR-132的靶向關(guān)系分析

Fig.2 The expression levels of KLF7 in nasopharyngeal carcinoma tissues and cells圖2 KLF7在鼻咽癌組織及細胞中的表達

2.3 轉(zhuǎn)染miR-132 mimics和（或）KLF7-OE質(zhì)粒對KLF7表達的影響 空白組、NC組、miR-132 mimics組、KLF7-OE組和miR-132 mimics+KLF7-OE組KLF7蛋白表達水平分別為1.05±0.03、1.04±0.04、0.49±0.02、2.38±0.07和1.11±0.05，差異有統(tǒng)計學意義（n=6，F(xiàn)=1 421.155，P＜0.01）。與空白組和NC組比較，miR-132 mimics組CNE-2Z細胞中KLF7蛋白表達水平顯著降低，KLF7-OE組其表達水平顯著增高（P＜0.05）。與miR-132 mimics組比較，miR-132 mimics+KLF7-OE組KLF7蛋白表達顯著增高（P＜0.05）。

2.4 miR-132靶向KLF7對鼻咽癌細胞增殖的影響 CKK-8分析結(jié)果顯示，相比空白組和NC組，miR-132 mimics組的CNE-2Z細胞36、48、60 h增殖活力顯著降低，KLF7-OE組則顯著增高（P＜0.05）。相比miR-132 mimics組，miR-132 mimics+KLF7-OE組的CNE-2Z細胞36、48、60 h增殖活力顯著增高（P＜0.05），見表1。

2.5 miR-132靶向KLF7對鼻咽癌細胞遷移和侵襲的影響 Transwell實驗結(jié)果顯示，相比空白組和NC組，miR-132 mimics組的CNE-2Z細胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低（P＜0.05），KLF7-OE組遷移和侵襲數(shù)量均顯著增高（P＜0.05）。相比miR-132 mimics組，miR-132 mimics+KLF7-OE組的CNE-2Z細胞遷移和侵襲數(shù)量顯著增高（P＜0.05）。見圖3、表2。

Tab.1 Comparison of CNE-2Z cell proliferation ability between the five groups at different time points表1 各組CNE-2Z細胞不同時點增殖能力比較 （n=6，OD值，±s）

Tab.1 Comparison of CNE-2Z cell proliferation ability between the five groups at different time points表1 各組CNE-2Z細胞不同時點增殖能力比較 （n=6，OD值，±s）

＊＊P＜0.01；a與空白組比較，b與NC組比較，c與miR-132 mimics組比較，d與KLF7-OE組比較，P＜0.05

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Fig.3 Comparison of CNE-2Z cell migration and invasion between the five groups(hematoxylin dyeing,×200)圖3 各組CNE-2Z細胞遷移及侵襲情況比較（蘇木精染色，×200）

Tab.2 Comparison of CNE-2Z cell migration and invasion between the five groups表2 各組CNE-2Z細胞遷移及侵襲情況比較（n=6，個/視野，±s）

Tab.2 Comparison of CNE-2Z cell migration and invasion between the five groups表2 各組CNE-2Z細胞遷移及侵襲情況比較（n=6，個/視野，±s）

＊＊P＜0.01；a與空白組比較，b與NC組比較，c與miR-132 mimics組比較，d與KLF7-OE組比較，P＜0.05

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2.6 miR-132靶向KLF7對裸鼠體內(nèi)腫瘤生長的影響 相比空白組和NC組，miR-132 mimics組的腫瘤體積在第8～20天均顯著降低（P＜0.05），KLF7-OE組的腫瘤體積在第8～20天均顯著增高（P＜0.05）。相比miR-132 mimics組，miR-132 mimics+KLF7-OE組的腫瘤體積在第8～20天顯著增高（P＜0.05）。見表3。

2.7 miR-132靶向KLF7對裸鼠腫瘤內(nèi)血管生成的影響 免疫組化檢測結(jié)果顯示，空白組、NC組、miR-132 mimics組、KLF7-OE組和miR-132 mimics+KLF7-OE組MVD（條/視野）分別為65.47±5.06、62.86±4.93、35.14±4.51、184.83±8.50和68.07±4.28，差異有統(tǒng)計學意義（n=12，F(xiàn)=1 268.092，P＜0.01）。相比空白組和NC組，miR-132 mimics組的腫瘤內(nèi)血管減少，MVD降低（P＜0.05），KLF7-OE組的腫瘤內(nèi)血管增多，MVD顯著增高（P＜0.05）；相比miR-132 mimics組，miR-132 mimics+KLF7-OE組的腫瘤內(nèi)血管增多，MVD顯著增高（P＜0.05）。見圖4。

3 討論

隨著放射和化學療法的進步，放療的敏感性和局部控制效果明顯改善，然而仍有30%～40%的NPC患者會在4年內(nèi)發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，嚴重影響預(yù)后［4］。進一步認識NPC轉(zhuǎn)移的分子模式，對于開發(fā)有效的新治療策略至關(guān)重要。目前，已在NPC中觀察到多種miRNA表達失調(diào)，且特定miRNA異常表達與NPC細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲有關(guān)［5］。

miR-132在腫瘤中的作用具有差異性，其在膽管癌、胰腺癌中高表達，發(fā)揮促增殖、促侵襲等致癌作用［6-7］。然而，miR-132在更多腫瘤中表達降低，發(fā)揮腫瘤抑制作用，其中miR-132在前列腺癌中低表達，且在轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中的表達更低，miR-132的功能喪失可能通過提高葡萄糖代謝，促進癌細胞生長［8］。在卵巢癌和非小細胞肺癌中miR-132亦低表達，過表達miR-132可抑制細胞的增殖、克隆形成、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移和侵襲等過程［9-10］。Chen等［11］研究顯示，miR-132在甲狀腺癌組織和細胞系中顯著下調(diào)，過表達miR-132可通過靶向FOXA1等發(fā)揮抑癌作用。另有研究顯示，miR-132在胃癌中通過靶向黏蛋白（MUC13）、CD44、纖連蛋白1（FN1）等促進胃癌細胞的擴散和遠處轉(zhuǎn)移［12-13］。Yang等［14］采用GSE36682芯片分析發(fā)現(xiàn)miR-132在NPC腫瘤組織中表達降低，且miR-132低表達與遠處轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后有關(guān)。本研究也在NPC組織和細胞系中觀察到miR-132表達下調(diào)，過表達miR-132可抑制CNE-2Z細胞增殖、遷移和侵襲，進一步體內(nèi)實驗表明過表達miR-132可抑制NPC細胞在裸鼠內(nèi)生長和腫瘤內(nèi)血管形成，表明在鼻咽癌中miR-132亦發(fā)揮抑癌作用，其機制有待探索。

Tab.3 Comparison of tumor volume in nude mice between the five groups at different time points表3 各組裸鼠體內(nèi)不同時點腫瘤體積的比較 （n=12，mm3，±s）

Tab.3 Comparison of tumor volume in nude mice between the five groups at different time points表3 各組裸鼠體內(nèi)不同時點腫瘤體積的比較 （n=12，mm3，±s）

＊＊P＜0.01；a與空白組比較，b與NC組比較，c與miR-132 mimics組比較，d與KLF7-OE組比較，P＜0.05

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Fig.4 Comparison of angiogenesis in tumor of nude mice between the five groups(SP immunohistochemistry,×200)圖4 各組裸鼠腫瘤內(nèi)血管生成的比較（SP免疫組化，×200）

本研究結(jié)果顯示，過表達miR-132可顯著降低CNE-2Z細胞中KLF7蛋白表達，進一步通過TargetScan網(wǎng)站預(yù)測［15］和雙熒光素酶檢測證實KLF7為miR-132的直接靶標之一，推測KLF7可能是miR-132的作用靶點。KLF可與DNA轉(zhuǎn)錄區(qū)域結(jié)合并充當轉(zhuǎn)錄激活因子或阻遏因子，可影響細胞增殖、分化和遷移等過程［16］。近年研究發(fā)現(xiàn)，KLF7在宮頸癌［17］、肺癌［18］等多種腫瘤組織或細胞中高表達，可促進腫瘤進展，造成患者不良預(yù)后。Li等［19］報道，KLF7可調(diào)節(jié)非小細胞肺癌組織中Wnt/β-catenin信號介導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，并作為miR-103的直接靶標，KLF7表達上調(diào)可能促進胃癌發(fā)展。另有研究發(fā)現(xiàn)，KLF7在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中高度表達，可通過激活精氨酸琥珀酸裂合酶（ASL）轉(zhuǎn)錄，觸發(fā)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的異常生長，上述作用受到miR-136-3p的負調(diào)控［20-21］。Gupta等［22］報道，KLF7可通過維持高爾基體結(jié)構(gòu)和功能復(fù)雜性，促進胰腺導(dǎo)管腺癌生長和轉(zhuǎn)移。本研究證實，KLF7蛋白在NPC組織和細胞系中均表達上調(diào)，過表達KLF7可促進CNE-2Z細胞增殖、遷移、侵襲及其在裸鼠內(nèi)生長和腫瘤內(nèi)血管形成，且過表達KLF7可減弱miR-132 mimics的抑腫瘤作用，進一步表明miR-132可靶向KLF7，對NPC細胞增殖、遷移及侵襲產(chǎn)生影響。

綜上所述，miR-132在NPC組織和細胞中呈低表達，KLF7呈高表達，miR-132可通過負調(diào)控KLF7，影響NPC細胞的增殖、遷移及侵襲，這為NPC靶向治療提供了新思路。然而miR-132具有多個靶點，且基因表達可受到多種miRNA調(diào)控。本研究僅揭示了miR-132和KLF7在NPC中的作用，因此后續(xù)還需要對miR-132的其他靶標及調(diào)控KLF7的其他miRNA進行系統(tǒng)分析。