崔立華，李楊，白晶，馬小焱，王萌，馬婧怡，宋佳慧，馮福民

丙戊酸鈉（valproate，VPA）是臨床常用的兒童廣譜抗癲癇藥，在控制和治療嬰幼兒各種類型癲癇中具有重要作用［1-2］。但是，其不良反應(yīng)主要為肝毒性，嚴(yán)重時可致患者肝功能衰竭而死亡［3］。因此，臨床用藥需定期監(jiān)測肝功能，減少肝損傷的發(fā)生。傳統(tǒng)的臨床診斷肝損傷的實驗室指標(biāo)反應(yīng)滯后［4］。尋找早期診斷VPA致肝損傷的生物標(biāo)志物對藥物性肝損傷的預(yù)防和臨床治療具有重要的意義。近期研究發(fā)現(xiàn)微小RNA（miRNA，miR）廣泛參與了肝臟的多種生理和病理過程，影響肝細胞的發(fā)育和疾病的進程［5］。miR-122在肝臟中含量豐富，與病毒感染［6］、炎癥反應(yīng)［7］、癌癥［8］等有著密切聯(lián)系，被認為是一個新的肝損傷預(yù)警標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)miR-155與酒精性脂肪肝及乙型肝炎病毒感染密切相關(guān)，在調(diào)控炎癥反應(yīng)中可能發(fā)揮重要作用［9-10］。但是，miR-122和miR-155能否對VPA致兒童肝損傷進行早期預(yù)警尚需驗證。本研究旨在探討血清miR-122和miR-155在VPA致小鼠仔鼠肝損傷過程中的動態(tài)表達及其與肝損傷的關(guān)系，以期為兒童藥物性肝損傷的早期診斷尋找新的生物標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 主要材料 SPF級3周齡昆明小鼠86只，雌雄各半，體質(zhì)量10～15 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)溫度24～26℃，相對濕度60%～70%，光照明暗時間各12 h，提供標(biāo)準(zhǔn)飼料，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。丙戊酸鈉，100 mg/片，購自湖南省湘中制藥有限公司，批號：171211。TRIpure總RNA抽提試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）；miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript?RT master Kit）和實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）試劑盒（日本TaKaRa公司）。7600-020全自動生化分析儀（日本日立公司）；qPCR儀（美國Applied Biosystems公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組與給藥 將適應(yīng)性喂養(yǎng)后的小鼠按隨機數(shù)字表法和雌雄均等分為對照組30只和實驗組56只。實驗組又分為7組，分別給予375 mg·kg-1·d-1VPA（按標(biāo)準(zhǔn)每千克體質(zhì)量劑量的25倍計算）灌胃1、3、5、7、14、21和28 d。每組灌胃，2次/d。對照組又分為5組，分別給予1 mL生理鹽水灌胃1、7、14、21和28 d。各組小鼠末次給藥后12 h，摘眼球取血，室溫靜置15 min后，3 500 r/min離心20 min，收集血清，-80℃保存，待測miRNA和肝功能指標(biāo)。采血后，收集小鼠的肝組織，用4%多聚甲醛固定。

1.2.2 HE染色觀察肝組織病理學(xué)變化 按照標(biāo)準(zhǔn)步驟制作肝組織切片，進行HE染色。經(jīng)多聚甲醛固定的肝組織，常規(guī)石蠟包埋，制成4μm切片，37℃恒溫烘烤24 h。切片放入二甲苯中脫蠟10 min；經(jīng)無水乙醇浸泡10 min，雙蒸餾水洗2 min；放入蘇木素浸泡10 min染核，自來水藍化20 min；入伊紅染液浸泡2 min染細胞質(zhì)；經(jīng)95%乙醇和無水乙醇脫水；二甲苯浸6 min透明；最后中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察各時間點小鼠肝組織的病理學(xué)狀態(tài)。

1.2.3 肝功指標(biāo)檢測 采用全自動生化分析儀檢測實驗組和對照組小鼠各時間點血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平。

1.2.4 qPCR檢測miR-122和miR-155表達量 Trizol法提取血清中總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用qPCR檢測miR-122和miR-155表達水平，U6為內(nèi)參。10μL逆轉(zhuǎn)錄體系：PrimeScript?RT master Mix 2μL，莖環(huán)引物0.5μL，總RNA 500 ng，RNase-Free ddH2O加至10μL。反應(yīng)條件：37℃15 min，80℃5 s。20μL PCR反應(yīng)體系：2×SYBR Green PCR Mastermix 10μL，cDNA 2μL，RNase-Free ddH2O 6μL，上、下游引物各0.8μL，ROXdyeⅡ0.4μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，共60個循環(huán)，熔解曲線檢測。以2-ΔΔCt計算miR-122和miR-155的相對表達量。使用課題組前期設(shè)計的miR-122、miR-155、U6引物［11］，引物序列見表1，由上海生工生物工程有限公司合成。

Tab.1 Primer sequences of miR-122,miR-155 and internal reference U6表1 miR-122、miR-155及內(nèi)參U6的引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內(nèi)不同時間點比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t法，用Spearman行相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝組織病理學(xué)結(jié)果 各組小鼠肝臟表面光滑，未見結(jié)節(jié)及腫物生長。對照組小鼠肝臟組織切片未見明顯異常改變，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞呈放射狀排列，肝索整齊，肝細胞界限清晰。實驗組肝臟組織均出現(xiàn)不同程度的肝細胞空泡變性，1 d時肝組織結(jié)構(gòu)正常；3、5、7 d時可見肝細胞胞漿內(nèi)存在圓形的小空泡，少量炎性細胞；14 d時肝細胞胞漿內(nèi)圓形的空泡增多，細胞腫脹，較多炎性細胞浸出；21 d時大量肝細胞變性壞死，胞漿內(nèi)空泡增大，大量炎性細胞，肝細胞間結(jié)構(gòu)不清，肝索紊亂；28 d時肝細胞變性壞死，大量肝細胞再生。見圖1。

Fig.1 Pathological diagram of VPA-induced liver injury in mice(HE，×400)圖1 VPA誘導(dǎo)的小鼠肝損傷病理圖（HE，×400）

2.2 血清ALT與AST的變化 與對照組相比，實驗組血清ALT與AST均呈現(xiàn)下降-升高的趨勢（均P＜0.01），兩者的總體走向大致相同。給藥后1 d，血清ALT與AST一過性升高，之后持續(xù)下降；ALT在給藥后5 d下降到給藥前水平（15.43±0.50）U/L，后又開始出現(xiàn)升高，至給藥后21 d達到高峰（30.25±3.64）U/L；AST在給藥后7 d降低至低點（28.11±2.33）U/L，之后開始出現(xiàn)持續(xù)上升，至給藥后28 d升高至高峰（46.68±5.17）U/L。見圖2。

Fig.2 The serum levels of ALT and AST at different time points in VPA-induced liver injury in mice圖2 VPA誘導(dǎo)的小鼠肝損傷過程中不同時點血清ALT和AST的水平

2.3 miR-122和miR-155表達水平的變化 與對照組相比，實驗組miR-122在1 d后開始下調(diào)，至7 d時降至最低點，此時下降了81%，之后開始回升，但低于對照組的相對表達量。miR-155的表達趨勢與miR-122相反，其在1 d后上調(diào)，在給藥后7 d達到最高點，此時表達水平是對照組的2.88倍，之后開始下調(diào)。見圖3。

2.4 miR-122、miR-155與ALT、AST的相關(guān)性分析 miR-122與ALT和AST呈正相關(guān)（rs分別為0.965、0.900，均P＜0.05），miR-155與AST呈負相關(guān)（rs=-0.811，P＜0.05），而miR-155與ALT無相關(guān)性（rs=-0.198，P＞0.05）。

Fig.3 The relative expressions of miR-122 and miR-155 in VPA-induced liver injury in mice圖3 VPA誘導(dǎo)的小鼠肝損傷過程中不同時點miR-122和miR-155的相對表達量

3 討論

3.1 臨床診斷肝損傷方法的局限性 丙戊酸鈉是臨床上導(dǎo)致兒童藥物性肝損傷的常見藥物之一，臨床用藥時需警惕藥物導(dǎo)致的肝損傷、肝衰竭。目前，臨床診斷肝損傷主要依據(jù)肝穿刺活檢和血清肝功能檢查?；顧z雖是診斷肝損傷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其創(chuàng)傷大，不易被臨床接受。ALT和AST是臨床診斷肝損傷時廣泛應(yīng)用的實驗室指標(biāo)，但其在診斷過程中存在靈敏度和特異度偏低，易出現(xiàn)假陽性或假陰性，并且反應(yīng)滯后，易錯過肝損傷最佳治療時機。因此，及早、有效地監(jiān)測肝功能，找到靈敏的早期監(jiān)測指標(biāo)對預(yù)防兒童藥物性肝損傷的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。

3.2 miR-122和miR-155在VPA致小鼠肝損傷中異常表達分析 研究發(fā)現(xiàn)miR-122和miR-155在肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用［9，12］。miR-122是肝特異性表達的miRNA，約占肝臟總miRNA的70%，參與肝細胞發(fā)育、脂代謝、應(yīng)激、肝炎病毒感染和肝癌等生理、病理過程［5］。miR-155與人體免疫密切相關(guān)，參與B細胞及T細胞等重要免疫細胞的分化、活化，從而影響免疫細胞功能，并可調(diào)控多個基因，如轉(zhuǎn)錄因子和細胞因子等表達［13-14］，在炎癥和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在VPA致肝損傷的過程中，血清miR-122、miR-155均出現(xiàn)了異常表達，隨著給藥時間的延長，miR-122的表達水平出現(xiàn)先下調(diào)、后上調(diào)的趨勢，至7 d時降低至最低點；而miR-155的表達趨勢與miR-122相反，至7 d時升高至最高點。結(jié)合病理學(xué)結(jié)果顯示，給藥3～7 d肝組織開始出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。血清miR-122主要來自于肝細胞，當(dāng)肝細胞受損時miR-122表達水平下調(diào)，miR-155表達水平上調(diào)，且相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)miR-122與ALT和AST、miR-155與AST存在較強的相關(guān)性，提示miR-122和miR-155可能參與了VPA誘導(dǎo)小鼠肝損傷的發(fā)生，兩者發(fā)生異常表達時間早于病理學(xué)變化。miR-122和miR-155在給藥7 d后又逐漸向正常水平恢復(fù)，這可能是由于隨著炎癥的加重，抗炎因子表達增強，抑制了miR-155的表達水平［15］，也可能與肝細胞再生和自身修復(fù)有關(guān)。具體機制有待于進一步探究。

3.3 血清miR-122和miR-155在VPA致肝損傷中的預(yù)警作用分析 目前ALT和AST是檢測肝損傷的標(biāo)志性酶，兩者活性的高低反映了細胞膜相結(jié)構(gòu)的損傷程度。通過血清檢測及病理組織觀察，結(jié)果顯示給藥后1 d血清ALT與AST一過性升高，但此時病理學(xué)結(jié)果顯示肝組織結(jié)構(gòu)正常，未見明顯異常改變，因此這可能與應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。由于實驗組動物全程用同一劑量染毒，起始階段肝臟對藥物的應(yīng)激反應(yīng)較大，而使血清ALT與AST快速升高；隨著染毒劑量逐漸升高可能大大降低了起始階段VPA藥物對肝臟的刺激反應(yīng)，不會出現(xiàn)ALT與AST一過性升高。這一結(jié)果提示臨床上癲癇兒童服用VPA時，起始藥量應(yīng)低于治療劑量，隨治療時間逐漸增加劑量，防止發(fā)生肝損傷和其他不良反應(yīng)。給藥3 d后血清ALT與AST水平下降，可能是機體發(fā)生了適應(yīng)性變化。ALT、AST分別在給藥7 d后持續(xù)上升，此階段與病理學(xué)結(jié)果炎癥反應(yīng)逐漸加劇相吻合。進一步結(jié)合miR-122和miR-155基因表達情況，發(fā)現(xiàn)在給藥起始階段（3 d、5 d）血清miR-122和miR-155與ALT和AST均能反映肝功能的早期狀況，而且miR-155表達水平變化的幅度更大。若早期用藥時逐漸增加藥物劑量，減少或控制肝臟對藥物的應(yīng)激反應(yīng)，血清miR-122和miR-155發(fā)生異常表達時間可能早于ALT與AST的升高；而且兩者發(fā)生異常表達的時間早于病理學(xué)變化，顯示出血清miR-122和miR-155能更早地反映肝損傷。因miR-122在肝組織中高度表達，且種屬間高度保守，能被高特異度和靈敏度的qPCR技術(shù)快速、定量、準(zhǔn)確地檢測出，成為評估藥物性肝損傷的理想血液學(xué)檢測指標(biāo)。上述結(jié)果表明血清miR-122和miR-155能早期預(yù)警肝損傷的發(fā)生，有望成為VPA致肝損傷的早期預(yù)警標(biāo)志物，但兩者在肝損傷中的具體作用機制尚不明確，需進一步探究它們是通過何種途徑調(diào)控炎癥反應(yīng)及其他病理過程的。

綜上所述，血清miR-122低表達和miR-155高表達與VPA藥物性肝損傷的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，有望成為VPA致肝損傷的早期預(yù)警指標(biāo)，為臨床VPA藥物性肝損傷的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療提供了新的實驗依據(jù)。