胡 爽，辛傳偉，羊 波，夏仲尼

(浙江省中醫(yī)藥研究院，浙江省立同德醫(yī)院·浙江 杭州 310012)

糖尿病腎病(diabetic kidney disease.，DKD)是糖尿病患者常見且嚴重的微血管并發(fā)癥。研究表明，DKD占終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)的30%～47%，是引起終末期腎病的最常見誘因[1-2]，其發(fā)病機理和防治途徑是醫(yī)學界研究的熱點。腎小球系膜細胞(glomerular mesangial cells，MC)是腎小球內(nèi)的固有細胞，在各種病理因素作用下，MC凋亡造成的系膜細胞缺失是糖尿病腎損傷的重要機制[3]。因此，研究尋找抑制MC凋亡的有效藥物，具有重要的意義。消渴平合劑(Xiaokeping，XKP)作為醫(yī)院制劑，前期研究表明該藥有改善胰島素抵抗、保護大鼠腎功能等作用[4-5]；但尚未見消渴平對MC凋亡的研究報道。本實驗通過觀察消渴平對高糖誘導的大鼠腎小球系膜細胞凋亡的影響，探討其防治 DKD的作用機理。

1 材料與方法

1.1 細胞 腎小球系膜細胞株HBZY-1：購自賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 藥物與試劑 消渴平(黃芪、生地黃、丹參、山藥、菊花、麥冬、天花粉、枸杞子等配方組成)：浙江省中醫(yī)藥研究院制劑室生產(chǎn)。DMEM培養(yǎng)基：Hyclone；胎牛血清：浙江天杭生物科技股份有限公司；TUNEL凋亡試劑盒：生工生物工程(上海)股份有限公司；兔抗 cleaved caspase-3：美國 Cell Signaling；兔抗 Bax、Bcl-2、細胞色素 C (Cytochrome c，Cyt-C)抗體：英國 Abcam。

1.3 血清制備 取SPF級雄性健康SD大鼠40 只，體質(zhì)量(200±20) g，購于上海斯萊克動物實驗有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2017-0015，按實驗動物管理使用指南飼養(yǎng)。含藥血清分別使用消渴平高濃度(2 g·mL-1)、低濃度(0.5 g·mL-1)的濃縮液對大鼠進行灌胃。正常對照組則給予等體積的生理鹽水。連續(xù)給藥7 d，最后一次給藥后2 h無菌操作心臟采血，分離血清，置于-20 ℃冷存?zhèn)溆?。使用前置?6 ℃的水浴行30 min滅活，然后 0.2 μm微孔濾膜除菌備用。

1.4 實驗分組 取第5代大鼠系膜細胞，用含15%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)液，接種于96 孔板中，貼壁同步化24 h，按實驗設(shè)計分組如下：正常對照組(加入10%正常大鼠血清，NC組)、高糖組(25 mmol·L-1葡萄糖培養(yǎng)，HG組)、正常血清+高糖組(25 mmol·L-1葡萄糖+10%正常大鼠血清，NS組)、消渴平低劑量組(25 mmol·L-1葡萄糖+10%XKP 0.5 g·mL-1含藥血清，LXKP組)、消渴平高劑量組(25 mmol·L-1葡萄糖+10%XKP 2 g·mL-1含藥血清，HXKP組)、厄貝沙坦組(25 mmol·L-1葡萄糖+10%厄貝沙坦3 g·L-1含藥血清，IP組)。

1.5 觀察指標檢測

1.5.1 系膜細胞凋亡檢測 按照生工生物工程TUNEL凋亡檢測試劑盒說明書操作，首先細胞爬片，細胞貼壁后加藥。藥物作用結(jié)束棄去培養(yǎng)液，每孔加入1～2 mL預冷的4%多聚甲醛，固定10 min，PBS漂洗3次，每次5 min；通透細胞膜后，滴加Tunel工作液100 μL行Tunel反應(yīng)，PBS漂洗后，每孔加入核染試劑DAPI細胞核染色，倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。熒光顯微鏡下計數(shù)每個高倍視野中陽性染色細胞數(shù)和總細胞數(shù)，以陽性細胞百分比計算凋亡率(AI)。

1.5.2 Western blot檢測腎小球系膜細胞中cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2及Cyt-C的蛋白表達 分別添加RIPA 蛋白裂解液60 μL、蛋白酶抑制劑0.6 μL，提取細胞總蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度。分別用SDS-PAGE凝膠電泳對蛋白樣品分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗于4 ℃孵育過夜。TBST洗膜，然后加二抗2 h室溫孵育，滴加ECL后檢測，以β-actin為內(nèi)參照，用Quantity One圖像分析系統(tǒng)測定各目的條帶灰度值。

1.5.3 熒光定量PCR檢測腎小球系膜細胞中Bax mRNA、Bcl-2 mRNA表達情況 收集細胞樣品，加入Trizol試劑，提取總RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，內(nèi)參基因為GAPDH，引物設(shè)計如表1所示，實驗數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進行分析。

表1 熒光定量 PCR實驗引物設(shè)計表

2 結(jié)果

2.1 消渴平對各組大鼠腎小球系膜細胞凋亡的影響 實驗發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，高糖組大鼠腎小球系膜細胞中凋亡率顯著升高(P<0.01)。與高糖組相比，正常血清+高糖組大鼠腎小球系膜細胞中凋亡率無顯著性變化，消渴平高劑量治療組及IP治療組細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 各組腎小球系膜細胞的凋亡變化(×400)

表2 各組大鼠腎小球系膜細胞凋亡率比較

2.2 消渴平對高糖培養(yǎng)腎小球系膜細胞cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2及Cyt-C蛋白表達的影響 實驗結(jié)果表明，與NC組相比，高糖組cleaved Caspase-3、Bax、Cyt-C蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達明顯降低(P<0.01)。與高糖組比較，HXKP及IP組cleaved Caspase-3、Bax、Cyt-C表達明顯降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達明顯升高(P<0.05)，其中消渴平高劑量組與IP組相比無顯著性差異(P>0.05)，見圖2，表3。

圖2 各組腎小球系膜細胞Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2及Cyt-C蛋白表達Western blot 檢測結(jié)果

表3 各組腎小球系膜細胞Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2及Cyt-C蛋白表達的比較

2.3 消渴平對高糖培養(yǎng)腎小球系膜細胞Bax mRNA、Bcl-2 mRNA表達的影響 與空白對照組相比，高糖組Bax mRNA的表達水平顯著升高(P<0.01)，Bcl-2 mRNA表達水平顯著降低(P<0.01)。與高糖組比較，HXKP及IP治療組Bax mRNA表達均明顯降低(P<0.05)，Bcl-2 mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)。其中HXKP組與IP治療組相比無顯著性差異(P>0.05)，見表4。

表4 各組腎小球系膜細胞Bax mRNA、Bcl-2 mRNA表達的比較

3 討論

糖尿病腎病(DKD)發(fā)病機理復雜，研究表明，糖尿病腎病腎臟損傷從腎小球系膜細胞凋亡開始，致使腎小球基底膜增厚，誘發(fā)腎衰竭，干預腎小球系膜細胞的凋亡能夠有效減少DKD腎損傷[6]。本研究利用體外高糖對系膜細胞進行培養(yǎng)，TUNEL研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)系膜細胞在高糖(25 mmol·L-1葡萄糖)環(huán)境下明顯出現(xiàn)凋亡；與高糖組相比，消渴平高劑量組能顯著抑制高糖誘導的系膜細胞凋亡。Western blot檢測結(jié)果顯示，消渴平高劑量組能明顯抑制腎小球系膜細胞中cleaved caspase-3、Bax及Cyt-C的蛋白表達(P<0.05)，升高Bcl-2蛋白表達(P<0.05)；熒光定量PCR實驗同樣證實消渴平對高糖誘導的系膜細胞凋亡具有抑制作用，可顯著降低Bax mRNA表達(P<0.05)，明顯升高Bcl-2 mRNA表達水平(P<0.05)。

研究表明，B淋巴細胞瘤基因相關(guān)X蛋白(Bax)主要作用在線粒體水平，其與B淋巴細胞瘤基因-2(Bcl-2)屬于一個家族，通過控制線粒體膜的通透性來阻止Cyt-C從線粒體釋放到細胞質(zhì)，從而抑制細胞凋亡[7]。半胱天冬酶-3(Caspase-3)是參與細胞凋亡過程中的信號分子，它的活化可以被Bcl-2阻斷，從而產(chǎn)生抑制凋亡的作用[8]。生理狀態(tài)下Bax/Bcl-2保持相對動態(tài)平衡，在疾病狀態(tài)下，Bax介導Cyt-C的釋放，具有促凋亡作用，而Bcl-2可阻止凋亡形成因子Cyt-C從線粒體釋放出來，具有抗凋亡作用[9]。本實驗研究結(jié)果顯示，高糖刺激下系膜細胞凋亡率明顯增加，凋亡相關(guān)蛋白Bax、Cyt-C、cleaved caspase-3表達增高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低，而消渴平高劑量組能顯著抑制高糖誘導的系膜細胞凋亡。

消渴平合劑為筆者所在醫(yī)院院內(nèi)制劑，前期臨床研究表明該藥可提高胰島素敏感性[4]，動物實驗證實消渴平合劑可以明顯降低db/db小鼠體質(zhì)量及血肌酐、尿素氮水平[10]。本實驗從系膜細胞凋亡的角度探討了消渴平合劑對DKD的防治機制，實驗結(jié)果顯示，消渴平合劑可明顯抑制高糖誘導的大鼠系膜細胞凋亡，明顯抑制腎小球系膜細胞中cleaved caspase-3、Bax及Cyt-C蛋白表達，升高Bcl-2 蛋白表達，這可能是其防治DKD的機制之一。