陳 霞，楊鴿華

(1諸暨市中心醫(yī)院藥劑科·浙江 諸暨 311800；2諸暨市人民醫(yī)院中藥庫·浙江 諸暨 311800)

中藥配伍用藥是祖國醫(yī)學(xué)的特色之一，配伍可通過藥性的相合與制約，充分發(fā)揮藥物之間的相互作用，以增進療效，擴大治療范圍，同時降低毒性反應(yīng)[1]。五味子、黃芪是臨床常用的配伍藥對，五味子是木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.的干燥成熟果實，習(xí)稱“北五味子”，因其酸、苦、甘、辛、咸五種性味俱全，故名為五味子，是《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載的上品滋補藥材[2]。多糖作為五味子的主要活性成分之一，具有含量高、毒性低等優(yōu)點，眾多研究表明，五味子多糖具有降脂、抗氧化、抗疲勞、調(diào)節(jié)免疫等多重藥理活性，具有較佳的新藥開發(fā)價值[3-4]。黃芪是豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var.Mongholicus(Bge.) Hsiao 或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根，主要活性成分包含皂苷、黃酮和多糖等，研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖具有保肝、降壓、抗菌、抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激和增強機體免疫等藥理作用[5-7]，其中，因黃芪多糖表現(xiàn)出的明顯的抗氧化作用，使黃芪被認為是強大的潛在外源性抗氧化劑[8]，在藥物的研究開發(fā)與疾病的預(yù)防治療方面，均有重要價值。本研究旨在觀察五味子與黃芪不同比例配伍對混合多糖含量的影響，并通過DPPH自由基清除實驗研究五味子、黃芪不同比例配伍對混合多糖體外抗氧化活性的影響，以探討二者不同劑量配伍用藥的合理性，并為五味子、黃芪配伍的物質(zhì)基礎(chǔ)研究及藥理學(xué)研究提供思路和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 藥材與試劑 五味子藥材(批號：190601)，經(jīng)諸暨市人民醫(yī)院中藥庫楊鴿華主任鑒定為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.的干燥成熟果實；黃芪藥材(批號：190401)，經(jīng)諸暨市人民醫(yī)院中藥庫楊鴿華主任鑒定為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var.mongholicus(Bge.) Hsiao的干燥根；均購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司。L-抗壞血酸(批號：113170-1911)：上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司。D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(批號：110833-201908)：購于中國食品藥品檢定研究院；水為雙蒸水，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器設(shè)備 UV2800/UV2800S型紫外可見分光光度計：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司； BSA224S-CW 電子天平(1/10000)：賽多利斯斯泰帝(上海)貿(mào)易有限公司；SKM數(shù)顯恒溫電加熱套：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FD-2型密封式恒溫可調(diào)式電加熱器：嘉興市欣欣儀器設(shè)備有限公司；HWS-28電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SFG-02.500電熱鼓風(fēng)干燥箱：黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司。

1.3 五味子-黃芪混合多糖的提取 取五味子、黃芪混合藥材，粉碎后置于圓底燒瓶中，按料液比1∶30加入蒸餾水，電熱套加熱至85 ℃，連續(xù)回流提取3 h，過濾，濾液濃縮至濃稠狀，冷卻后以95%乙醇醇沉，酒精計測定至乙醇體積分數(shù)為80%，4 ℃靜置沉淀過夜。將沉淀物4 500 r/min離心10 min，離心半徑8 cm，所得沉淀物依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌2次，真空干燥至恒重，即得五味子-黃芪混合多糖。

1.4 五味子-黃芪混合多糖含量測定方法的建立

1.4.1 對照品溶液的制備 精密稱取105℃ 干燥至恒重的D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品100.2 mg，置于100 mL量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得1.002 g/L的對照品貯備液。

1.4.2 供試品溶液的制備 精密稱取五味子、黃芪藥材各5 g(1∶1配伍)，按“1.3”項下方法制得五味子-黃芪混合多糖。精密稱取混合多糖1.005 g，置于100 mL量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品貯備液，后續(xù)試驗根據(jù)需要進行稀釋。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取“1.4.1”項下對照品貯備液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL分別置于10 mL 量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，混勻，另取蒸餾水作為空白對照，各依次加入5%苯酚溶液1.0 mL，混勻，再依次加入98 %濃硫酸5.0 mL，充分混勻后置于60 ℃恒溫水浴中放置30 min，取出后冷卻至室溫，于490 nm波長處測定吸光度，以葡萄糖濃度(C)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1，計算得回歸方程為：A=6.0658C+0.0036，R2=0.9997，可見，葡萄糖濃度(C)與吸光度(A)在0.1 002～1.0 020 g/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.4.4 換算因子的測定 取“1.4.2”項下制得的五味子-黃芪混合多糖約20 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻。按“1.4.3”標(biāo)準(zhǔn)曲線項下方法處理并測定吸光度，重復(fù)測定3次，取平均值。代入回歸方程，計算得出混合多糖溶液的葡萄糖濃度(C)，按下式計算得出換算因子f=1.301。換算因子f=W/(C×D)[W為五味子-黃芪混合多糖的質(zhì)量(mg)；C為混合多糖溶液的葡萄糖濃度(g/L)；D為混合多糖的稀釋倍數(shù)]。

1.4.5 精密度實驗 精密吸取同一對照品溶液，按“1.4.3”標(biāo)準(zhǔn)曲線項下方法處理，重復(fù)測定吸光度5次，計算得吸光度的RSD值為0.52%，表明，儀器的精密度良好。

1.4.6 重復(fù)性實驗 精密量取同一批供試品貯備液5份各1 mL，置于10 mL具塞試管中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，按“1.4.3”標(biāo)準(zhǔn)曲線項下方法處理并測定吸光度，計算得多糖含量的RSD值為0.83%，表明，本方法的重復(fù)性良好。

1.4.7 穩(wěn)定性實驗 精密量取同一供試品溶液，分別于第0、1、2、3、4、5、6 h按“1.4.3”標(biāo)準(zhǔn)曲線項下方法處理并測定吸光度，計算得吸光度的RSD值為0.79%，表明，該供試品溶液在6 h 內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

1.4.8 加樣回收率實驗 取已知含量的同一批五味子-黃芪混合多糖6份各2 mg，精密稱定，置于10 mL具塞試管中，分別精密加入“1.4.1”項下對照品貯備液1.5 mL，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，按“1.4.3”標(biāo)準(zhǔn)曲線項下方法處理并測定吸光度，計算得平均加樣回收率為99.25%，RSD值為0.92%，見表1。

表1 加樣回收率實驗結(jié)果

1.5 五味子-黃芪不同比例配伍對混合多糖含量的影響 按以下9 個配伍比例(3∶1、2.5∶1、2∶1、1.5∶1、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3)，稱取9批五味子、黃芪混合藥材，各10 g，按照“1.3”項下方法提取制得五味子-黃芪混合多糖，計算得率。

多糖得率(%)=多糖質(zhì)量(g)/ 五味子、黃芪混合藥材質(zhì)量(g)×100%

以苯酚-濃硫酸比色法檢測多糖含量，按照“1.4.2”項下供試品溶液的制備方法制得不同配伍比例五味子-黃芪混合多糖的供試品溶液，按“1.4.3”標(biāo)準(zhǔn)曲線項下方法處理并測定吸光度，按下式計算不同配伍比例五味子-黃芪混合多糖的含量，每個配伍劑量重復(fù)進行3次實驗，取平均值。多糖含量(%)= C×D×f / W×100%[W 為五味子-黃芪混合多糖的質(zhì)量(mg)；C 為混合多糖溶液的葡萄糖濃度(g/L)；D 為混合多糖的稀釋倍數(shù)；f為換算因子]。

1.6 五味子-黃芪不同比例配伍對體外抗氧化活性的影響 采用DPPH自由基清除實驗測定不同配伍比例五味子-黃芪混合多糖的抗氧化活性，精密量取上述9 個配伍比例的五味子-黃芪混合多糖供試品溶液各100 μL，置于5 mL具塞試管中，分別加入200μL新配制的DPPH溶液(以無水乙醇配制0.1 mmol/L的DPPH溶液)，蒸餾水定容后，室溫下避光反應(yīng)30 min，在波長517 nm處測定吸光度。同時以0.2 g/L的L-抗壞血酸作為陽性對照，同法測定吸光度。按下式計算不同配伍比例五味子-黃芪混合多糖的DPPH自由基清除率，每個配伍劑量重復(fù)進行3次實驗，取平均值。DPPH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/ A0] ×100% ()A1為供試品溶液 + DPPH溶液的吸光度；A2為供試品溶液 + 無水乙醇的吸光度；A0為無水乙醇+ DPPH溶液的吸光度)。

2 結(jié)果

2.1 五味子-黃芪不同比例配伍對混合多糖含量的影響 見表2。五味子-黃芪混合多糖在五味子、黃芪3∶1配伍時得率最高，隨著五味子比例降低，黃芪比例升高，多糖得率呈現(xiàn)降低-升高-再降低的趨勢，在五味子、黃芪1∶1配伍時達到一個峰值，到五味子、黃芪1∶3配伍時，多糖得率降至最低。五味子-黃芪混合多糖的含量在五味子、黃芪3∶1配伍時最低，隨著五味子比例降低，黃芪比例升高，多糖含量呈現(xiàn)升高-降低的趨勢，在五味子、黃芪1∶1.5配伍時達到一個峰值?？梢?，五味子、黃芪藥材不同比例配伍后，所提取得到的混合多糖得率和多糖含量均表現(xiàn)出較明顯的差異。

表2 不同配伍比例五味子-黃芪混合多糖得率和含量測定結(jié)果

2.2 五味子-黃芪不同比例配伍對體外抗氧化活性的影響 見表3。五味子-黃芪混合多糖的DPPH自由基清除率，在五味子、黃芪3∶1和2.5∶1配伍時較高，表現(xiàn)出與L-抗壞血酸效果相當(dāng)?shù)目寡趸钚裕S著五味子比例降低，黃芪比例升高，其DPPH自由基清除率呈現(xiàn)降低-升高-再降低的趨勢，在五味子、黃芪1∶1配伍時達到峰值，其次為1∶1.5?？梢?，五味子、黃芪藥材不同比例配伍后，所提取得到的混合多糖在體外抗氧化活性方面，呈現(xiàn)出較明顯的差異，其中，在五味子、黃芪1∶1和1∶1.5配伍時，體外抗氧化活性最強。

表3 不同配伍比例五味子-黃芪混合多糖的DPPH自由基清除率

3 討論

多糖是一種聚合糖高分子碳水化合物，研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)中藥中提取的多糖成分均具有抗氧化應(yīng)激作用，一方面可自身清除機體內(nèi)多余的氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生，一方面可通過提高機體內(nèi)其他內(nèi)源性抗氧化酶的活性，修復(fù)機體氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，進而對抗氧化應(yīng)激損傷[9]。五味子是臨床常用的滋補性中藥?！侗静菥V目》記載“五味子南產(chǎn)者紅，北產(chǎn)者黑，入滋補藥，必用北者為良”，可見，滋補用藥以北五味子最佳[10]。大量研究表明，從北五味子水提液中分離得到的五味子多糖，除具有抗氧化作用外，還具有調(diào)節(jié)免疫、延緩衰老、抗腫瘤、抗疲勞等多重生理活性，而這些作用的產(chǎn)生均以抗氧化作用為基礎(chǔ)[9]。李珊珊等[11]研究發(fā)現(xiàn)，北五味子多糖具有較好的體外抗氧化活性，與DPPH和羥自由基清除活性存在明顯的劑量依賴性，且隨著多糖濃度的升高而增強。Niu[12]等的研究可見，隨著五味子多糖濃度的升高，DPPH 自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的清除率均增加，并呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，其中，DPPH 自由基清除效果與同濃度的VE相當(dāng)，而羥自由基清除效果略低于同濃度的VC。黃芪多糖是從黃芪藥材的干燥根系中提取出的一種水溶性雜多糖，具有抗菌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等多重生物活性。Xue等[13]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可通過降低活性氧含量、丙二醛水平和NF-κB通路活性，升高GSH含量和SOD活性，進而抑制PCV2感染誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。此外，黃芪多糖還可通過ErbB/AKT信號通路提高機體細胞的抗氧化能力和對NO的生物利用度，用以減輕內(nèi)、外源性因素造成的氧化損傷[14]。

中藥配伍用藥是中醫(yī)學(xué)的特點之一，不同中藥之間的合理配伍應(yīng)用，不僅能夠增強原有療效，還能夠抑制或消除自身的烈性和毒性，而藥物之間配伍不合理，則可能使原有功效降低，甚至喪失藥效[15]。配伍的關(guān)鍵在于藥物不同劑量的搭配，相同藥物不同配伍比例的變化，不但會對藥效強弱造成影響，還可能改變藥物的功效主治。五味子、黃芪在中醫(yī)臨床中是較常用的配伍藥對，如《宋·太平惠民和劑局方》中載有人參養(yǎng)榮湯，含五味子和黃芪3∶4配伍，主治肺脾氣虛、積勞虛損?！度~氏女科》記載柏子養(yǎng)心湯，方中五味子和黃芪按1∶4比例組成，主治妊娠子煩。2015版《中國藥典》[16]中記載成藥益氣養(yǎng)血口服液中，取黃芪和五味子3∶1比例配伍，功效益氣養(yǎng)血，常用于氣血不足、體虛乏力的治療。由上可見，相同藥物配伍比例的不同，其功效差異較大。本研究參照2015版《中國藥典》[16]建立了五味子-黃芪混合多糖的含量測定方法，并對五味子與黃芪不同比例配伍后提取得到的多糖進行了含量測定，結(jié)果可見，五味子與黃芪不同比例配伍能夠明顯影響其混合多糖的得率和多糖含量；DPPH自由基清除實驗結(jié)果表明，不同比例配伍所得五味子-黃芪混合多糖的體外抗氧化性活性有著明顯差異。該結(jié)論從化學(xué)成分和藥理活性方面進一步驗證了中藥不同比例配伍的合理性和意義，也為五味子與黃芪藥對的臨床合理配伍用藥提供了依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。