李珂兒，李劼，李增強，魏立翔，孫延鳴

(石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832000)

天然免疫系統(tǒng)是機體的保護屏障，分為3道基本防線，而其中第一道防線包括皮膚、黏膜，是抵御病原體入侵機體的最重要的一步。分布在氣道上皮細胞的短腭、肺及鼻咽上皮克隆1(short palate，lung nasal epithelial clone 1，SPLUNC1)是一種分泌蛋白，同時是天然免疫第一道防線中的關(guān)鍵蛋白[1]。SPLUNC1屬于PLUNC(palate，lung and nasal epithelium clone)家族11個成員之一[2-3]，在培養(yǎng)的人原代氣道上皮細胞中，SPLUNC1占上皮組織液總蛋白的十分之一[4]。其有著與殺菌性/通透性增強蛋白(bactericidal/permeabilityincreasing protein，BPI)相似的結(jié)構(gòu)，能夠結(jié)合脂多糖(LPS)，參與抗微生物和抗腫瘤的免疫過程[5]，并對某類炎癥刺激及具有反向調(diào)控的作用[6]。Wahlen等[7]用比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對季節(jié)性過敏鼻炎患者的鼻腔沖洗液分析，結(jié)果顯示，與健康對照組比較，過敏性鼻炎患者先天性免疫蛋白SPLUNC1水平下降，而α1-抗胰蛋白酶水平升高，提示SPLUNC1蛋白可作為上呼吸道癥狀潛在的生物標(biāo)志物。本實驗室先前證實了綿羊重組SPLUNC1蛋白在體外對綿羊肺炎支原體具有抗菌功能[8]。研究發(fā)現(xiàn)，對不同工作環(huán)境中具有流行癥狀的病患進行檢測，鼻咽處SPLUNC1基因表達水平較低可能影響先天免疫防御功能[9]。

強冷應(yīng)激會造成機體免疫應(yīng)答能力受到抑制。產(chǎn)于極冷阿勒泰地區(qū)的阿勒泰羊是新疆的常見優(yōu)質(zhì)羊種，它體格肥碩、產(chǎn)肉性能高，抗寒產(chǎn)熱能力異于其他羊種，面對冷應(yīng)激時能迅速觸發(fā)機體防御機制，維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，免受病原微生物的侵襲[10]。薩?？搜蛟a(chǎn)于德國，是著名的肉用綿羊，自引進中國以來，適應(yīng)性強，繁殖力高，生長發(fā)育快，Good等[11]通過對比薩福克羊及特塞爾純種羔羊?qū)ξ改c道線蟲的抵抗情況顯示，薩福克羊的自然染蟲量更高。此外，在生產(chǎn)養(yǎng)殖中發(fā)現(xiàn)，薩?？搜?qū)χгw易感性較強[12]。據(jù)此猜測，2種品種的羊在抗病原微生物上產(chǎn)生的差異可能與天然免疫基因SPLUNC1的表達量及定位有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)SPLUNC1高表達于人、鼠的氣道上皮細胞中[13]，有關(guān)SPLUNC1在綿羊各器官組織中的定位分布還未有報道。本試驗應(yīng)用SYBR絕對熒光定量PCR的方法，檢測SPLUNC1基因在2種綿羊不同組織器官的差異表達量，為深入揭示該基因的調(diào)控機制和生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)，同時為綿羊抗病選育研究提供資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于新疆省石河子市選取臨床健康成年阿勒泰羊5只，多胎薩福克羊5只，頸動脈放血致死后，迅速分別剪取瘤胃、氣管、支氣管、食管、心臟、脾臟、肺葉處、升結(jié)腸處及股內(nèi)側(cè)皮膚樣本，將其置于液氮中低溫保存，用于提取總RNA。

1.2 主要試劑

TRIzol(美國Ambion公司)；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)；SYBR qPCR Master Mix、DNA Marker(南京諾唯贊生物科技有限公司)；pMD19-T載體、Prme Script RT reagent Kit(日本TaKaRa公司；質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。

1.3 引物合成及模板制備

1.3.1 設(shè)計并合成引物

通過GenBank中綿羊SPLUNC1基因的mRNA序列(KP883281)，根據(jù)其序列利用DNAMAN、Primer 5設(shè)計特異性引物：上游引物:5′-TACGTAATGCACCACCACCACCACCACCTGCTAGAAGCCCTGC-CCG-3′；下游引物：5′-GCGGCCGCTCAGACTTTGATGACAAATTCTAGCCC-3′，預(yù)計擴增目的基因片段長度為748 bp。引物交由上海生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3.2 樣品總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

按照TRIzol Reagent試劑盒操作說明分別提取阿勒泰羊及多胎薩?？搜虻姆巍夤?、支氣管、食管、心臟、脾臟、結(jié)腸及皮膚的總RNA，DEPC處理水溶解，核酸蛋白測定儀NanoDrop One測定總RNA的濃度和純度，調(diào)整濃度至500 ng/μL左右。同時，取5 μL提取樣品經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后利用紫外凝膠成像儀分析其完整性。參照Prme Script RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將各樣品從RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，于-80 ℃。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于制備絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品及定量PCR擴增反應(yīng)。

1.4 絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備

1.4.1 SPLUNC1基因片段的擴增

以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行PCR擴增反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系如下:氣管cDNA 4 μL，濃度為10 μmol/L的上、下游引物各0.8 μL，ddH2O219.4 μL，2×TaqPCR MasterMix(含染料)25 μL。PCR擴增程序為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4.2 克隆SPLUNC1基因片段并驗證

利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行PCR產(chǎn)物純化，純化產(chǎn)物與pMD619-T連接，連接體系為：目的片段4.5 μL，Solution one 5 μL，T載體0.5 μL。在16 ℃條件下過夜連接。第2天將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，涂至含100 mg/L的氨芐青霉素(Amp)的LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃溫箱中過夜培養(yǎng)。次日挑取白色陽性單菌落，接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)1 h。對菌液進行PCR初步鑒定，選取陽性菌準(zhǔn)備進行質(zhì)粒提取。

1.4.3 質(zhì)粒DNA的提取

利用質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒對鑒定正確的陽性菌液進行質(zhì)粒提取，用核酸分析儀Nanodrop one測定質(zhì)粒濃度及純度，根據(jù)公式計算質(zhì)粒拷貝數(shù)，將質(zhì)粒10倍倍比稀釋，選取8個稀釋度(10-1～10-8)的質(zhì)粒作為模板進行熒光定量PCR來建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，20 μL熒光定量PCR體系：待測樣本cDNA 2 μL，濃度為10 μmol/L的上、下游引物各0.4 μL，ddH2O27.2 μL，SYBR qPCR Mix 10 μL。PCR擴增程序為95 ℃預(yù)變形30 s；循環(huán)反應(yīng)：95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s(40個循環(huán))；溶解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。以拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，循環(huán)數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?？截悢?shù)計算公式:

質(zhì)?？截悢?shù)/(copies·mL-1)=

其中，M. 質(zhì)粒分子量+插入片段分子量；W. 660 Da/bp

1.5 熒光定量PCR檢測SPLUNC1 mRNA的表達

依照1.3.2中反轉(zhuǎn)錄體系所得cDNA進行熒光定量PCR，熒光定量反應(yīng)條件和反應(yīng)體系參照1.4.3，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系計算得到cDNA的起始拷貝數(shù)。每個待測樣品各設(shè)3個重復(fù)，熒光定量反應(yīng)結(jié)束后自動生成擴增曲線、溶解曲線及Ct值。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS26.0軟件中One-way ANOV分析2組羊9個組織器官(各組織樣本量為5份)中SPLUNC1基因mRNA絕對表達量的差異，試驗數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 總RNA檢測

利用Nanodrop One核酸蛋白檢測儀測定RNA純度及濃度，OD260/OD280檢測結(jié)果在1.9～2.0之間，說明RNA純度較高，1%瓊脂糖凝膠結(jié)果18S及28S條帶清晰，樣品完整性好。各項指標(biāo)均符合要求，可以進行后續(xù)試驗。凝膠電泳檢測結(jié)果見圖1。

2.2 絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品制備

SPLUNC1基因擴增片段在748 bp附近有條帶，與預(yù)計長度相符(圖2);陽性菌液PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，在748 bp左右有較亮的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(圖3)。選取陽性菌提取質(zhì)粒，測阿勒泰羊質(zhì)粒濃度為140 ng/μL，薩福克羊質(zhì)粒濃度為131 ng/μL，根據(jù)其拷貝數(shù)計算公式得出其拷貝數(shù)分別為1.71×1014、1.6×1020copies/mL。質(zhì)粒倍比稀釋后進行熒光定量PCR擴增，生成SPLUNC1基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線。阿勒泰羊標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=-3.394 7x+45.532(y：Ct值，x：起始拷貝數(shù))，擴增效率E=97%，回歸系數(shù)R2=-0.999 0(圖4)。薩?？搜驑?biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.292 1x+42.776，擴增效率E=101%，回歸系數(shù)R2=-0.998 9(圖5)。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)品濃度在10倍梯度稀釋后，起始模板濃度與CT值之間具有良好線性關(guān)系。溶解曲線(圖6、7)峰值單一，PCR產(chǎn)物Tm值相對集中，說明引物具有較好的特異性，PCR過程中無非特異性擴增，擴增產(chǎn)物無二聚體出現(xiàn)。結(jié)果表明，本研究建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線能夠準(zhǔn)確反映目的基因片段的擴增。

1～2. 樣品總RNA

M. DNA Marker DL2000 Plus；1～4. SPLUNC1基因

M. DNA Marker DL2000 Plus；1～10.陽性菌液

圖4 阿勒泰羊SPLUNC1基因熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5 多胎薩?？搜騍PLUNC1基因熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖6 阿勒泰羊SPLUNC1基因標(biāo)準(zhǔn)品熒光定量PCR溶解曲線

圖7 多胎薩?？搜騍PLUNC1基因標(biāo)準(zhǔn)品熒光定量PCR溶解曲線

2.3 綿羊各組織SPLUNC1基因mRNA表達

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線中Ct值與基因拷貝數(shù)的關(guān)系，換算出SPLUNC1基因在總RNA中的絕對表達量。阿勒泰羊與多胎薩?？搜蚓鶠闅夤苤蠸PLUNC1基因表達量最高，拷貝數(shù)均值分別為9.201×106copies/μg(表1)和1.772×105copies/μg(表2)，顯著高于其他各組織(P<0.05)。阿勒泰羊各組織中SPLUNC1基因表達量均顯著高于多胎薩?？搜?P<0.01)，見圖8。

表1 阿勒泰羊各組織中SPLUNC1基因表達×105 copies·μg-1

表2 薩?？搜蚋鹘M織中SPLUNC1基因表達×104copies·μg-1

注：**差異極顯著(P<0.01)

3 討論

呼吸系統(tǒng)是機體與外界環(huán)境接觸最密切、最頻繁的開放系統(tǒng)[14]。在機體汲取氧氣的過程中，空氣中的微生物、過敏原、有害氣體都能刺激對機體引發(fā)各種疾病。存在于呼吸道表面的免疫分子成為保護機體的重要因素。近幾年有關(guān)SPLUNC1在抗呼吸道感染上的研究方興未艾[15]。Sayeed等[16]研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)條件下，SPLUNC1可以抑制銅綠假單胞菌生長。Ahmad等[17]通過對野生型小鼠和SPLUNC1基因敲除型小鼠同時感染伯克霍爾德菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SPLUNC1基因缺失的小鼠肺部的細菌負荷增加，說明SPLUNC1蛋白可以減輕呼吸道伯克霍爾德菌感染的負擔(dān)。以上均能說明SPLUNC1蛋白具有抗菌抗微生物感染的功效。目前有關(guān)SPLUNC1基因在綿羊上的定位還未有研究，陶岳等[18]對綿羊的肺臟及其他臟器組織進行支原體分離鑒定發(fā)現(xiàn)，綿羊肺炎支原體感染機體后在心臟、肝臟、脾臟等器官內(nèi)也能分離出病原，說明肺臟不是綿羊肺炎支原體感染的唯一靶器官。周厚德等[19]發(fā)現(xiàn)SPLUNC1蛋白在人胚胎的眼和脂肪組織中也存在表達。本文旨在研究該基因在綿羊體內(nèi)定位，為探究該基因在呼吸器官外的臟器組織中的抗病原微生物及其他功能奠定基礎(chǔ)。

SPLUNC1基因的表達量一定程度上間接反映機體的天然免疫水平。為了明確綿羊SPLUNC1表達的特異性，試驗運用實時熒光定量PCR的方法構(gòu)建了綿羊SPLUNC1基因組織表達譜。結(jié)果顯示，SPLUNC1基因在阿勒泰羊和多胎薩?？搜虻?個組織器官中均有表達，其中阿勒泰羊氣管表達量是皮膚表達量的377倍，該結(jié)果與SPLUNC1基因在人上的分布特點具有相似性[13]。此外，研究結(jié)果還顯示SPLUNC1在綿羊瘤胃中有微弱的表達量，這在王爽等[20]的研究中得到了印證，他們利用原位雜交的方法對人體37種組織進行細胞學(xué)定位發(fā)現(xiàn)，胃固有層中的壁細胞中存在SPLUNC1的表達，說明該基因在消化系統(tǒng)胃等器官中存在更深的生物學(xué)功能有待探究。SPLUNC1的差異表達揭示了該基因在各器官中可能均發(fā)揮一定的功能。

在養(yǎng)羊生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，多胎薩?？搜?qū)d羊支原體肺炎的感染率遠遠高于阿勒泰羊(待報道)。這與本研究顯示阿勒泰羊的SPLUNC1基因表達量均顯著高于多胎薩福克羊的結(jié)果相一致。SPLUNC1基因?qū)d羊抗病力的影響及其在免疫調(diào)控上的作用值得進一步研究。