徐明暢，聞雙全，王莉，張文華，鄒輝，顧建紅，劉學忠，卞建春，劉宗平，袁燕*

(1.揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇 揚州 225009；2.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009)

鎘(cadmium, Cd)為一種重金屬元素，鎘對動物及人體危害較大，可引起呼吸系統(tǒng)、骨骼、泌尿系統(tǒng)、血液循環(huán)系統(tǒng)等的嚴重損傷。20世紀40年代以來，鎘隨著其他金屬的開采而釋放進入環(huán)境中，工業(yè)的發(fā)展也使鎘的排放量愈發(fā)增加[1]。直至現(xiàn)在，重金屬鎘在大氣、飲水、土壤等環(huán)境中的蓄積量劇增，加之其生物蓄積性強、蓄積時間持久的特性，導致鎘對人體及動物體的危害已成為令人棘手的問題。鎘對人畜機體的危害可通過其對各組織臟器的損傷來實現(xiàn)，其中包括對肝、腎、腦、睪丸、骨骼等的損傷作用。鎘進入機體后迅速分布于各組織臟器，其中絕大多數(shù)進入肝臟和腎臟[2]。腎臟是鎘慢性毒性的靶器官，鎘在腎臟中的半衰期最多能達到30年[3]。鎘能造成近端腎小管和腎小球的損傷，使其對尿液的重吸收下降，引起低分子量蛋白尿癥、氨基酸尿癥、碳酸氫鹽尿癥、糖尿病等[3]。體外試驗表明，鎘致使腎小管上皮細胞活性氧(ROS)水平升高，在體內大量聚積從而造成氧化損傷[4]。

葛根素(puerarin, Pur)又稱葛根黃素，為一種單體化合物，化學名為4,7-二羥基8-β-D吡喃葡萄糖醛基異黃酮，相對分子質量416。葛根素的藥理學應用包括抵抗心律失常、降血壓、舒張血管、增加腦血流量、保護神經細胞、改善血脂水平、治療糖尿病、降低眼壓和解酒等[5]。葛根素對腎臟具有保護效應，這體現(xiàn)在能降低過高的血糖[6]，改善腎小球濾過功能和代謝紊亂等[7]。目前有研究指出葛根素能降低鎘致腎上皮細胞和血清中的ROS升高，并提高機體抗氧化能力、減少腎臟內脂質過氧化的生成與蓄積，保護腎臟免受過氧化損傷[8]。然而，葛根素對于鎘造成的腎臟損傷的作用尚未闡明。因此，本試驗旨在通過體內試驗，研究鎘暴露對大鼠腎臟的毒性損傷作用和葛根素的保護效應，為臨床上葛根素防治鎘暴露引起的腎臟損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠36只，體重(70±5)g，由江蘇大學比較醫(yī)學中心提供。

1.2 主要試劑

葛根素(Sigma, USA)；醋酸鎘(CdAc2, 國產分析純)；羧甲基纖維素鈉(索萊寶科技有限公司)；丙二醛(MDA)、還原性谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；BCA蛋白質量濃度測定試劑盒(碧云天生物技術有限公司)；標準蛋白(新賽美生物科技有限公司)。

1.3 動物分組與處理

將36只SD雄性大鼠于安靜清潔干燥的室溫(22±2)℃環(huán)境中預飼養(yǎng)21 d，預飼養(yǎng)后稱重并將其隨機分為4組，分別為對照組(Con)、鎘組(Cd)、葛根素組(Pur)、鎘與葛根素共處理組(Cd+Pur)。葛根素組、鎘與葛根素共處理組每天灌胃葛根素200 mg/kg體重(用0.5%羧甲基纖維素鈉溶解)，其他組灌胃相同劑量的0.5%羧甲基纖維素鈉，灌胃14 d后，在灌胃的同時，鎘組、鎘與葛根素共處理組用50 mg/L鎘自由飲水。處理90 d后，稱重，每只大鼠按60 mg/kg體重的劑量肌肉注射戊巴比妥鈉麻醉，斷頸處死大鼠，分離完整腎臟。腎臟分離背膜，從腎臟剝離出皮質并剪碎，放入凍存管中，置-80 ℃冰箱，待用。

1.4 病理切片制作與HE染色

將分離的完整腎臟在固定液中浸泡24 h，取出后用手術刀進行切割，使用脫水機梯度酒精脫水、二甲苯透明，石蠟浸泡并包埋。用切片機切片后滴加30%酒精，后移入40 ℃恒溫水浴使其完全展開，再貼附于載玻片上，并經烤片機烘干。經二甲苯脫蠟、蒸餾水漂洗后，分別用蘇木素染色、鹽酸酒精分色、自來水沖洗、氨水返藍、伊紅染色、酒精脫色脫水、二甲苯透明，最后用中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察(日本尼康公司)。

1.5 測定氧化損傷相關指標

測定腎臟皮質內GSH、MDA含量和GSH-Px、SOD、CAT活性，根據(jù)南京建成生物工程研究所檢測試劑盒的說明書進行操作。

1.6 數(shù)據(jù)分析

運用數(shù)據(jù)分析軟件SPSS 24.0對檢測結果進行顯著性t檢驗和單因素方差(ANOVA)統(tǒng)計分析，結果以“平均數(shù)±標準差”表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 腎臟病理組織學觀察

對照組(圖1A)和葛根素組(圖1B)大鼠腎組織染色均勻，腎小球形態(tài)結構未見明顯異常；鎘組(圖1C)大鼠腎組織可見較多腎小管上皮細胞顆粒變性(黑色箭頭)，胞質疏松淡染，可見刷狀緣脫落(藍色箭頭)，少數(shù)血管周圍可見較多炎性細胞浸潤(紅色箭頭)；與鎘組相比，鎘與葛根素共處理組(圖1D)病變有所減輕，腎小球形態(tài)結構未見明顯異常，局部可見少量腎小管上皮細胞顆粒變性(黑色箭頭)、胞質疏松淡染、刷狀緣脫落(藍色箭頭)。

A. Con組；B. Pur組；C. Cd組；D. (Cd+Pur)組

2.2 鎘與葛根素對大鼠腎臟皮質內MDA含量的影響

如圖2所示，與對照組相比，鎘組腎皮質中MDA含量極顯著升高(P<0.01)；與鎘組相比，鎘與葛根素共處理組MDA含量極顯著降低(P<0.01)；對照組、葛根素組與共處理組之間MDA含量無顯著差異(P>0.05)。

2.3 鎘與葛根素對大鼠腎臟皮質內SOD活性的影響

如圖3所示，與對照組相比，鎘組腎皮質SOD活性顯著降低(P<0.05)；與鎘組相比，鎘與葛根素共處理組SOD活性顯著升高(P<0.05)；對照組、葛根素組與共處理組之間SOD活性無顯著差異(P>0.05)。

注：大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)，小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。下同

圖3 大鼠腎皮質中SOD活性變化

2.4 鎘與葛根素對大鼠腎臟皮質內CAT活性的影響

如圖4所示，與對照組相比，鎘組腎皮質中CAT活性顯著降低(P<0.05)；與鎘組相比，鎘與葛根素共處理組CAT活性顯著升高(P<0.05)；對照組、葛根素組與共處理組之間CAT活性無顯著差異(P>0.05)。

圖4 大鼠腎皮質中CAT活性變化

2.5 鎘與葛根素對大鼠腎臟皮質內GSH-Px活性的影響

如圖5所示，與對照組相比，鎘組腎皮質中GSH-Px活性極顯著降低(P<0.01)；與鎘組相比，鎘與葛根素共處理組GSH-Px活性極顯著升高(P<0.01)；對照組、葛根素組與共處理組之間GSH-Px活性無顯著差異(P>0.05)。

圖5 大鼠腎皮質中GSH-Px活性變化

2.6 鎘與葛根素對大鼠腎臟皮質內GSH含量的影響

如圖6所示，與對照組相比，鎘組腎皮質中GSH含量極顯著升高(P<0.01)；與鎘組相比，鎘與葛根素共處理組GSH含量顯著降低(P<0.05)；對照組、葛根素組與共處理組之間GSH含量無顯著差異(P>0.05)。

圖6 大鼠腎皮質中GSH含量變化

3 討論

鎘為環(huán)境中常見的重金屬之一，可造成環(huán)境的污染，并進一步引起動物和人的健康問題。鎘對各組織器官均有不同程度的毒性作用，其中，腎臟可能為最敏感和重要的器官之一[9]。為了模擬“環(huán)境暴露”與“職業(yè)暴露”的鎘污染狀況，有學者分別以5 mg/L 和50 mg/L鎘飲水濃度建立了大鼠模型[10-11]。此外，研究表明50 mg/L鎘自由飲水能造成大鼠大腦、肝臟、睪丸等部位的毒性損傷[12-14]。因此本試驗選用50 mg/L鎘自由飲水的方式探究鎘對腎臟的毒性損傷作用。本試驗中腎臟病理切片結果顯示，鎘組部分腎小管上皮細胞出現(xiàn)顆粒變性，胞質疏松淡染，核淡染，微絨毛圍成的刷狀緣部分脫落，少數(shù)血管周圍可見多種炎性細胞浸潤，說明重金屬鎘造成了腎臟一定程度的病理損傷。

氧化應激為鎘腎臟毒性的重要機制之一，且為鎘致腎臟損傷的主要原因[15]。脂質過氧化為氧化應激產生的活性氧自由基與生物膜上的多不飽和脂肪酸發(fā)生氧化反應，生成具有毒性的過氧化物的過程，其產生的二級產物包含多種醛酸，MDA包括在內，且為整個過程中致突變性最強的一個[16]，故為氧化應激和脂質過氧化過程的重要生物標志。本試驗中，鎘組MDA相比于對照組，含量極顯著升高，表明鎘造成了腎臟皮質的氧化應激和脂質過氧化。

葛根素為一種由豆科植物野葛、甘葛的根中提取出來的中藥材，中醫(yī)認為其有升陽、活血、通絡的作用，因此對人體心腦血管系統(tǒng)有很多積極影響。葛根素藥理作用強、安全范圍廣，現(xiàn)已在臨床被廣泛運用，包括在糖尿病早期降低疾病對腎功能的損害[26]。研究表明，200 mg/kg葛根素能有效逆轉各種原因導致的大鼠各臟器病理損傷[27-28]，因此本研究選用此劑量用以探究葛根素對鎘造成腎臟毒性損傷的保護作用。本研究的病理切片結果顯示，葛根素緩解了鎘造成的腎臟病理損傷：腎上皮細胞見有少量顆粒變性，刷狀緣脫落程度不大，未見明顯的炎性細胞浸潤。許多研究發(fā)現(xiàn)葛根素能降低不同原因所致的腎臟氧化損傷，如鋁造成的脂質過氧化作用[29]、腎臟組織細胞缺血再灌注引起的氧化應激[30]等。龍夢菲等[8]研究發(fā)現(xiàn)葛根素能降低鎘造成的血清中MDA含量的升高和SOD、總抗氧化能力(T-AOC)活性的下降。本研究發(fā)現(xiàn)，葛根素能抑制鎘引起的腎皮質中MDA、GSH含量升高，GSH-Px、SOD和CAT活性降低，說明天然抗氧化劑葛根素能在一定程度上減輕重金屬鎘對腎臟造成的氧化應激，提高機體的抗應激水平。

綜上，本研究表明，鎘暴露能導致腎臟發(fā)生一定的病理變化，并能引起腎皮質中MDA、GSH含量升高，SOD、CAT和 GSH-Px活性降低，導致腎臟氧化損傷；葛根素對鎘造成的腎臟毒性具有一定的保護作用。