凌芳，郝科興，陳慧慧，龍德智，王靜，胡廣東

(石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832000)

胚胎附植是妊娠成功的關(guān)鍵步驟,在早期胚胎附植階段，子宮內(nèi)膜會(huì)經(jīng)歷一系列結(jié)構(gòu)和功能的變化，從而建立最佳的子宮內(nèi)環(huán)境允許胚胎植入[1]。此過(guò)程也稱子宮內(nèi)膜蛻膜化，子宮內(nèi)膜蛻膜化的實(shí)質(zhì)是子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的增殖和凋亡過(guò)程[2-3]。為了更好地研究這一過(guò)程中母體子宮內(nèi)膜變化的相關(guān)機(jī)制，需要可靠的細(xì)胞模型，而在體外分離培養(yǎng)原代子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞是解決此問題的有效手段。

近年來(lái)，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞體外分離培養(yǎng)方法建立的相關(guān)研究在不同動(dòng)物上均獲得成功，包括人[4]、小鼠[5]、家兔[6]、牛[7]、山羊[8]等，涉及細(xì)胞分離培養(yǎng)的方法有組織培養(yǎng)法和酶消化法。然而，在實(shí)際操作過(guò)程中，利用上述方法分離獲得的細(xì)胞均為子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的混合細(xì)胞，難以完全分離純化。因此，本研究采用組織塊培養(yǎng)法獲得原代綿羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，再通過(guò)胰酶差時(shí)消化法獲得純化的原代細(xì)胞，并分別對(duì)其進(jìn)行免疫熒光鑒定，以期建立一種綿羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞獲取方法及分離純化方法，為更好地研究綿羊胚胎附植過(guò)程提供可靠的細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

綿羊子宮采自新疆石河子市牛羊定點(diǎn)屠宰場(chǎng)，動(dòng)物經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的健康檢疫流程，符合試驗(yàn)要求。

1.2 試劑

胎牛血清(FBS)、DMEM/F12 培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶購(gòu)自Gibco；20×PBS購(gòu)自上海生工；青-鏈霉素購(gòu)自HyClone；鼠抗角蛋白18(CK18)單克隆抗體購(gòu)自Abcam；兔抗波形蛋白抗體購(gòu)自博士德；DAPI購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；羅丹明標(biāo)記山羊抗兔二抗購(gòu)自中杉金橋；山羊抗鼠綠色熒光二抗購(gòu)自賽默飛。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 組織塊培養(yǎng)法獲得原代細(xì)胞

用含5%雙抗的PBS沖洗從屠宰場(chǎng)采得的綿羊子宮3～5遍，在無(wú)菌條件下剪取子宮角后2/3處置于一次性培養(yǎng)皿中，將子宮角縱向切開后展開，露出位于子宮腔面的子宮阜并用眼科剪剪下子宮阜。含5%雙抗的PBS沖洗剪下的子宮阜3～5遍。將子宮阜用鑷子夾入2 mL的EP管中，用剪刀將子宮阜剪碎成1 mm3小塊，加1.5 mL PBS到管中，將組織吹打混勻后1 500 r/min離心5 min，棄PBS，重復(fù)3次。

用移液槍吸取500 μL剪碎的組織塊接種于6孔板中，加入2 mL 完全培養(yǎng)基(DMEM/F12、10%FBS、1%雙抗)置于37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以后每隔3 d換1次液。

1.3.2 差時(shí)消化法分離純化細(xì)胞

原代細(xì)胞生長(zhǎng)匯合達(dá)80%～90%時(shí)，移棄培養(yǎng)液，PBS洗2次，向6孔板中每孔加入0.25%胰蛋白酶溶液1 mL，消化90 s，然后將6孔板置于倒置顯微鏡下觀察，待多數(shù)基質(zhì)細(xì)胞變圓，脫落成游離細(xì)胞時(shí)，立即棄胰酶，加入2 mL完全培養(yǎng)基，終止消化。用槍頭輕輕吹打板底部細(xì)胞后將細(xì)胞懸液移入2 mL EP管，1 500 r/min離心5 min收集基質(zhì)細(xì)胞，加入1 mL PBS吹打洗滌，1 500 r/min離心5 min后收集細(xì)胞，再加2 mL完全培養(yǎng)基吹打混勻后接種到另一6孔板中。然后加2 mL完全培養(yǎng)基沖洗2次未脫落的上皮細(xì)胞混勻后繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)約2 d，期間每隔24 h于倒置顯微鏡下觀察一次細(xì)胞形態(tài)，若還有梭形成束的基質(zhì)細(xì)胞，則再重復(fù)一次胰酶差時(shí)消化，重復(fù)1～2次即可得到較純的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞。

1.3.3 免疫熒光法鑒定細(xì)胞

將6孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)，以每孔1×104個(gè)的密度接種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，用PBS洗滌，然后每孔加500 μL 4%多聚甲醛固定，室溫固定10 min，棄多聚甲醛，用PBS沖洗3次，每次5 min。加200 μL 0.5% TritonX-100通透15 min，PBS 沖洗3次，每次5 min。每孔加200 μL 1% BSA封閉液，室溫下孵育 30 min。棄上清，PBS洗3次，上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞分別滴加鼠抗CK18一抗(1/100稀釋)和兔抗波形蛋白一抗(1/30稀釋)，并分別滴加PBS(做陰性對(duì)照)覆蓋細(xì)胞標(biāo)本，4 ℃過(guò)夜。一抗孵育完成后用 PBS 沖洗3次，每次5 min，滴加與一抗相對(duì)應(yīng)的稀釋后的二抗工作液，37 ℃避光溫育30 min。然后用PBS沖洗3次，每次5 min，5 μg/mL DAPI核染3 min，PBS清洗3次，然后在熒光倒置顯微鏡下觀察，拍照。

2 結(jié)果

2.1 組織塊培養(yǎng)獲得原代細(xì)胞

顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，組織塊培養(yǎng)第3天開始有細(xì)胞從組織塊爬出(圖1a)，5～6 d時(shí)單層細(xì)胞鋪開，呈梭形細(xì)胞和鋪路石狀，2種細(xì)胞交織在一起(圖1b)。7～8 d時(shí)細(xì)胞長(zhǎng)至90%，適合傳代(圖1c)，若不傳代，細(xì)胞會(huì)重疊生長(zhǎng)導(dǎo)致部分細(xì)胞空泡化從而死亡懸浮。

2.2 差時(shí)消化分離純化綿羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞

組織塊培養(yǎng)法獲得的原代細(xì)胞包括呈梭形的基質(zhì)細(xì)胞與鋪路石狀上皮細(xì)胞，且表現(xiàn)混合生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，經(jīng)2～3次0.25%胰蛋白酶差時(shí)消化(圖 2a、2b)，獲得較純的綿羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞(圖 2c、2d)。

a. 組織塊培養(yǎng)第3天有細(xì)胞爬出；b. 第6天組織塊間上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞交匯生長(zhǎng)；c. 第8天細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)板開始出現(xiàn)細(xì)胞空泡化

a,b. 胰蛋白酶消化中，細(xì)胞變圓脫落過(guò)程；c. 純化后得到的基質(zhì)細(xì)胞；d. 2～3次差時(shí)消化得到的上皮細(xì)胞

2.3 免疫熒光鑒定

免疫熒光結(jié)果顯示，綿羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞呈角蛋白染色陽(yáng)性(圖3a、3b、3c)，波形蛋白染色陰性(圖3d、3e、3f)，陽(yáng)性率大于95%；陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)染為綠色熒光，核藍(lán)染，陰性對(duì)照細(xì)胞不著色?；|(zhì)細(xì)胞呈波形蛋白染色陽(yáng)性(圖4a、4b、4c)，角蛋白染色陰性(圖4d、4e、4f)，陽(yáng)性率大于95%；陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)染為紅色熒光，核藍(lán)染，陰性對(duì)照細(xì)胞不著色。

a.上皮細(xì)胞核染；b. 上皮細(xì)胞角蛋白鑒定；c. 上皮細(xì)胞核染和角蛋白合成圖；d. 上皮細(xì)胞核染；e.上皮細(xì)胞波形蛋白對(duì)照；f. 上皮細(xì)胞核染和波形蛋白對(duì)照合成圖

a.基質(zhì)細(xì)胞核染；b. 基質(zhì)細(xì)胞波形蛋白鑒定；c. 基質(zhì)細(xì)胞核染和波形蛋白合成圖；d. 基質(zhì)細(xì)胞核染；e. 基質(zhì)細(xì)胞角蛋白對(duì)照；f. 基質(zhì)細(xì)胞核染和角蛋白對(duì)照合成圖

3 討論

子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞是在體外研究胚胎附植所必需的細(xì)胞模型，分離和純化生物功能完整的原代細(xì)胞是開展相關(guān)研究的前提條件。本研究利用組織塊培養(yǎng)法結(jié)合胰酶差時(shí)消化法成功獲得了純度較高的綿羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞。

常用的原代子宮內(nèi)膜細(xì)胞分離培養(yǎng)的方法包括組織塊培養(yǎng)法和酶消化法，不同動(dòng)物子宮內(nèi)膜組織存在差異，為分離活性較高的原代細(xì)胞，需對(duì)細(xì)胞分離培養(yǎng)方法進(jìn)行優(yōu)化[9-14]。有研究發(fā)現(xiàn)膠原酶消化作用溫和，但由于消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)且膠原酶價(jià)格昂貴[15-16]，導(dǎo)致其使用成本較高。與膠原酶消化法相比，組織塊培養(yǎng)法操作簡(jiǎn)便，細(xì)胞分離效率較高，成本較低，是原代細(xì)胞分離培養(yǎng)的首選方式。常用的組織塊培養(yǎng)法在操作過(guò)程中以手術(shù)鑷子和剪刀剝離子宮外層和脂肪，獲得薄膜狀子宮內(nèi)膜功能層，然后取子宮角，縱向剪開后去除外層脂肪、肌肉等組織，取最內(nèi)層半透明狀膜上皮分離細(xì)胞[17-18]，此過(guò)程較為繁瑣，不易推廣。因此，本研究對(duì)原有程序進(jìn)行優(yōu)化，選擇將子宮角縱向剪開后剪下子宮阜，再將子宮阜剪碎后分離細(xì)胞，獲得大量活性較好的綿羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞。

為研究子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞在胚胎附植過(guò)程中的不同作用，需對(duì)2種細(xì)胞分別進(jìn)行純化。常用純化方法包括篩網(wǎng)過(guò)濾及貼壁純化法、差時(shí)消化法和差速貼壁法。有研究采用細(xì)胞過(guò)濾網(wǎng)的方式成功得到純化的上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞[19]，但此方法操作過(guò)程中，由于消化液黏性大而使過(guò)篩網(wǎng)過(guò)度損耗導(dǎo)致細(xì)胞純化率不高，且易發(fā)生細(xì)胞污染。因此，本研究根據(jù)上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受程度不同[20]，而采用胰酶差時(shí)消化法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純化。奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞純化過(guò)程中，胰酶消化1 min時(shí)基質(zhì)細(xì)胞開始變圓，10 min后全部脫落，此時(shí)上皮細(xì)胞開始變圓[21]。而本研究發(fā)現(xiàn)，胰酶消化時(shí)，綿羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞約90 s開始變圓，2 min后全部脫落，而上皮細(xì)胞則需要6 min開始變圓，這可能是由于動(dòng)物品種不同造成的差異。純化的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，分別利用2種細(xì)胞特異性表達(dá)蛋白角蛋白18和波形蛋白抗體進(jìn)行免疫熒光鑒定，結(jié)果呈陽(yáng)性，且純度在95%以上，表明利用胰酶差時(shí)消化法可有效獲得純度較高的綿羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞。

綜上，本研究成功分離并純化了綿羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，為綿羊早期胚胎附植機(jī)理的研究提供了體外細(xì)胞模型。