高兆建，胡鑫強(qiáng)，宋玉林，丁飛鴻，趙宜峰，陳 騰,*

（1.徐州工程學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，江蘇 徐州 221018；2.長江桂柳食品睢寧有限公司，江蘇 徐州 221000）

普魯蘭酶（EC 3.2.1.41）是一類水解支鏈淀粉分支點(diǎn)中的α-1,6-糖苷鍵的淀粉脫支酶，因其能專一性水解普魯蘭糖（麥芽三糖以α-1,6-糖苷鍵連接起來的聚合物）而得名[1]。普魯蘭酶解開復(fù)雜結(jié)構(gòu)的支鏈淀粉，形成直鏈淀粉，提高淀粉利用效率從而降低淀粉加工能耗[2]，在淀粉相關(guān)的食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛。當(dāng)前，在葡萄糖、果糖、高濃度麥芽糖漿、抗性淀粉、啤酒生產(chǎn)中[3]，普魯蘭酶常與α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶或環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶聯(lián)合使用。普魯蘭酶除了在淀粉加工中的應(yīng)用外，在飼料加工、廢水處理[4]、藥物化學(xué)和烘焙工業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域也有巨大的應(yīng)用價(jià)值。近年來，普魯蘭酶的研究受到持續(xù)關(guān)注。

根據(jù)酶底物特異性和水解產(chǎn)物種類，普魯蘭糖水解酶分為普魯蘭酶（I型和II型）或者支鏈淀粉水解酶（III型和IV型）[5]。其中I型普魯蘭酶（EC3.2.1.41）只對普魯蘭糖中的α-1,6-糖苷鍵具有專一性水解作用，并且麥芽三糖是其唯一的水解產(chǎn)物。研究表明，I型普魯蘭酶與淀粉酶協(xié)同作用，能完全、快速地水解淀粉多糖[6]，在淀粉糖化工藝中可以使用較高濃度的淀粉乳，減少糖化酶用量，縮短糖化時(shí)間，減少異麥芽糖副產(chǎn)物形成，從而最終減少淀粉生產(chǎn)高果糖漿甜味劑過程中葡萄糖的產(chǎn)生[5]。在食品營養(yǎng)方面，食用經(jīng)I型普魯蘭酶制備的高抗性淀粉食品后，血糖和胰島素水平都會(huì)降低，并且抗性淀粉通過在腸道中的發(fā)酵能達(dá)到防止便秘和增加短鏈脂肪酸含量的效果[7]。普魯蘭酶作為一種重要的輔助酶，在淀粉粒的水解中起著重要的作用。據(jù)報(bào)道，淀粉水解中添加普魯蘭酶可以降低糊精含量，提高葡萄糖產(chǎn)率，從而提高淀粉原料發(fā)酵制備乙醇的轉(zhuǎn)化率[8]?，F(xiàn)階段，研究發(fā)現(xiàn)的普魯蘭酶主要適用于中溫中性條件，在較高溫度下穩(wěn)定性較差。但普魯蘭酶的應(yīng)用環(huán)境主要為高溫和酸性，目前多數(shù)普魯蘭酶無法在這種環(huán)境中長時(shí)間保持高活性，因此研究耐高溫I型普魯蘭酶對滿足市場需求具有重要意義。

從前期分離篩選的解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液中分離純化得到一種適合在酸性環(huán)境下使用的耐高溫I型普魯蘭酶。本研究主要對該酶的分離純化，分子質(zhì)量，酶學(xué)特性包括酸堿穩(wěn)定性、金屬離子化學(xué)試劑作用效果、底物水解專一性等方面詳細(xì)闡述，旨在為該酶的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

產(chǎn)普魯蘭酶菌株解淀粉芽孢桿菌HxP-21，分離自中國江蘇徐州云龍區(qū)面粉加工廠附近土壤。

1.1.2 試劑

普魯蘭多糖、支鏈淀粉、直鏈淀粉、α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、麥芽三糖、麥芽四糖 美國Sigma公司；可溶性淀粉、糯米淀粉 徐州市大潤發(fā)超市；Sephadex G-75、DEAE-Sepharose Fast Flow 美國Pharmacia公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量Marker 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

液體種子培養(yǎng)基：糯米淀粉2 g/100 mL，蛋白胨0.5 g/100 mL，酵母提取物0.4 g/100 mL，KH2PO40.05 g/100 mL，NaCl 0.1 g/100 mL，MgSO4·7H2O 0.01 g/100 mL，pH 6.5，121 ℃滅菌15 min。

液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：糯米淀粉2.0 g/100 mL，蛋白胨1.0 g/100 mL，酵母提取物0.5 g/100 mL，KH2PO40.05 g/100 mL，(NH4)2SO40.05 g/100 mL，MgSO4·7H2O 0.02 g/100 mL，pH 6.5，121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；KTA Explorer 10型蛋白質(zhì)純化系統(tǒng) 美國GE公司；3K30型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；SW-CJ-ZFD型雙人單面超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；Cascada LS型超純水系統(tǒng) 美國Pall公司。

1.3 方法

1.3.1 解淀粉芽孢桿菌HxP-21普魯蘭酶（PulBa）的發(fā)酵制備

液體種子培養(yǎng)：將斜面生長的菌株接入50 mL液體種子培養(yǎng)基，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，42 ℃培養(yǎng)18～24 h至對數(shù)生長期，以6%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)。

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)：培養(yǎng)溫度45 ℃，裝液量250 mL的三角瓶60 mL，發(fā)酵時(shí)間60 h。

1.3.2 酶活力的測定

參照Long Jie等[9]的方法并稍作修改。以普魯蘭糖為底物測定PulBa活性，2 g普魯蘭糖溶于100 mL乙酸鈉緩沖液（20 mmol/L，pH 4.5），制備普魯蘭糖溶液。取200 μL酶液加入到200 μL的普魯蘭糖溶液中，50 ℃水浴30 min，添加400 μL二硝基水楊酸試劑，并在水中煮沸5 min，冰水浴中迅速冷卻。加去離子水使最終反應(yīng)體積4 mL。紫外分光光度計(jì)記錄540 nm波長處的吸光度。1 個(gè)單位的普魯蘭酶活力定義為在50 ℃條件下1 min內(nèi)水解底物產(chǎn)生1 μmol還原糖的量。

1.3.3 PulBa的分離純化

1.3.3.1 硫酸銨分級沉淀

發(fā)酵結(jié)束后的培養(yǎng)液10 000 r/min、4 ℃離心15 min，菌體與發(fā)酵液分離，保留的上清液即為粗酶液。向粗酶液中逐漸加入固體硫酸銨達(dá)到40%飽和度，4 ℃攪拌過夜，按上述離心后取上清液按照90%的飽和度添加硫酸銨，過夜鹽析后，10 000 r/min、4 ℃離心15 min，收集蛋白質(zhì)沉淀，并將其重懸于適量的20 mmol/L、pH 6.0的磷酸鹽緩沖溶液中，并充分透析。

1.3.3.2 DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析

將完全透析后的粗酶液上樣于pH 6.0、20 mmol/L磷酸緩沖液平衡過的DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱中，相同緩沖液洗柱至吸收線平行，再以含0～0.9 mol/L NaCl的同一緩沖液洗脫，流速0.8 mL/min，每管收集2 mL，平板打孔法測定洗脫峰酶活力并合并PulBa活性組分。

1.3.3.3 Sephadex G-75葡聚糖凝膠層析

以20 mmol/L、pH 6.0的磷酸緩沖液充分平衡層析柱（80 cm×1.5 cm），2 mL經(jīng)離子交換層析收集并濃縮的有效活性組分上樣，相同緩沖液洗脫，流速1 mL/min，收集各洗脫蛋白峰，平板水解圈法測定酶活力，確定有效層析峰。

1.3.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）與酶譜分析

使用SDS-PAGE測定純化效果及PulBa分子質(zhì)量，10%分離膠，5%濃縮膠。低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白作為參照?？捡R斯亮藍(lán)G250法測定蛋白質(zhì)含量。PulBa的酶譜測定參照Lu Zhenghui等[10]的方法并稍微改動(dòng)，10 g/100 mL的分離膠中加入0.5 g/100 mL的普魯蘭糖，電泳結(jié)束后，凝膠去離子水浸泡洗滌后浸泡于50 mmol/L的乙酸鈉緩沖溶液（pH 4.5），50 ℃孵育2 h，再覆蓋盧革氏碘液，顯色條帶與考馬斯亮藍(lán)染色條帶對照。

1.3.5 酶學(xué)性質(zhì)分析

1.3.5.1 酶的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性

將酶液適當(dāng)稀釋后與等量50 mmol/L的乙酸鈉緩沖溶液（pH 4.5）混合，在30～90 ℃測定酶活力，確定最適反應(yīng)溫度。將等量酶液分別于40～80 ℃條件下孵育2 h，每隔0.5 h測定一次酶活力，以最高酶活力為100%，測定不同溫度下酶穩(wěn)定性。

1.3.5.2 酶的最適pH值及穩(wěn)定性

使用pH 3.0～8.0的緩沖液（pH 3.0的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液、pH 3.0～6.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液、pH 6.0～7.5的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液、pH 8.0的Tris-HCl緩沖液）與適當(dāng)稀釋后的等量酶液混合，50 ℃反應(yīng)測定酶活力，確定最適反應(yīng)pH值。將等量酶液于pH 3.0～8.0、4 ℃條件下，孵育6 h，測定酶活力，檢驗(yàn)此種酶的pH值穩(wěn)定性。

1.3.5.3 金屬離子及化學(xué)試劑對酶活力的影響

將不同無機(jī)鹽溶液（NaCl、NaNO3、KCl、LiCl、ZnCl2、Cu Cl2、NiCl2、MgCl2、CaCl2、BaCl2、MnCl2、FeCl2、CoCl2、PbCl2，濃度為5 mmol/L）與等量PulBa溶液混合，按1.3.2節(jié)方法測定酶活力，設(shè)不加金屬離子組為對照組，測定金屬離子對PulBa活力的影響。

不同化學(xué)試劑乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium，EDTA-2Na）、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、尿素、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、β-巰基乙醇、二硫代蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）與PulBa等量混合，按1.3.2節(jié)方法測定酶活力，設(shè)不加化學(xué)試劑組為對照組，測定不同化學(xué)試劑對PulBa活力的影響。

1.3.5.4 酶的反應(yīng)底物特異性與動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測定

以普魯蘭糖、馬鈴薯支鏈淀粉、玉米支鏈淀粉、可溶性淀粉、α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、直鏈淀粉為底物，按照1.3.2節(jié)方法測定酶活力。動(dòng)力學(xué)參數(shù)測定參照前期研究[11]的方法并有所改動(dòng)。分別以普魯蘭糖、馬鈴薯支鏈淀粉、玉米支鏈淀粉、可溶性淀粉為底物（0.2～1.2 mg/mL），20 mmol/L乙酸鈉緩沖液（pH 4.5）體系，50 ℃測定不同底物濃度時(shí)的反應(yīng)速度。用Lineweaver-Burk法作圖，得到動(dòng)力學(xué)曲線，繪制雙倒數(shù)曲線，求出酶的Km、Vmax。

1.3.5.5 普魯蘭糖水解產(chǎn)物薄層層析

以20 mmol/L的乙酸鈉緩沖溶液（pH 4.5）配制0.5 g/100 mL的普魯蘭糖溶液，以麥芽四糖、麥芽三糖、麥芽二糖和葡萄糖構(gòu)成的混合糖液作為標(biāo)準(zhǔn)樣，將2 mL分離產(chǎn)物與2 mL的普魯蘭糖溶液混合，在50 ℃下反應(yīng)6 h，將反應(yīng)產(chǎn)物上樣到硅膠板上，以正丁醇、乙醇和水（5∶3∶2，V/V）混合溶液為展開劑，展開后以含10%濃硫酸的乙醇溶液噴灑層析板，再在120 ℃烘箱烘中烘烤至顯色。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

2 結(jié)果與分析

2.1 PulBa分離純化

2.1.1 DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析

經(jīng)硫酸銨分級鹽析、透析后的粗酶液進(jìn)一步離子交換層析，洗脫曲線如圖1所示，得到5 個(gè)洗脫峰，其中3號(hào)洗脫峰較大，平板水解圈法定性檢測顯示3號(hào)洗脫峰有酶活力，1、2、4、5號(hào)峰為雜蛋白。PulBa活性主要出現(xiàn)在18～24管，對應(yīng)NaCl洗脫濃度0.15～0.40 mol/L。合并有活性的收集管分析檢測，總蛋白為17.2 mg，總活力為760.2 U，比活力為44.2 U/mg，純化倍數(shù)5.2 倍。

圖1 DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析Fig.1 Elution profile of PulBa byDEAE-Sepharose Fast Flow ionexchange chromatography

2.1.2 Sephadex G-75凝膠過濾層析

洗脫曲線如圖2所示，柱層析得到3 個(gè)大洗脫峰和1 個(gè)小峰?；钚詸z測平板顯示3號(hào)峰（100～120 min）有酶活力，其他為雜蛋白峰。各純化步驟情況如表1所示，最終獲得的純化PulBa酶液總蛋白3.5 mg，總活力為617.7 U，比活力為176.5 U/mg，純化倍數(shù)達(dá)到20.8 倍，回收率53.2%。純化效果顯著，比活力明顯提高，說明分離純化的介質(zhì)和方法正確、高效。目前文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)了不同的純化方法，Lu Zhenghui等[10]利用鎳柱分離獲得重組大腸桿菌表達(dá)的普魯蘭酶，回收率為52.8%，比活力270 U/mg；Wei Wei等[12]純化的I型普魯蘭酶比活力44.7 U/mg；Aty等[13]等從Bacillus subtilisMF467279純化的普魯蘭酶比活力19.7 U/mg；Li Xiaoxiao等[14]從B.subtilisstr.168中分離純化的普魯蘭酶比活力136.06 U/mg。本研究建立的分離純化PulBa的方法，比大多報(bào)道的比活力高，并且在酶的回收率、純化倍數(shù)方面也具有優(yōu)勢，可為不同普魯蘭酶的分離純化提供參考。

圖2 Sephadex G-75凝膠過濾層析Fig.2 Elution profile of PulBa by Sephadex G-75 gel filtration chromatography

表1 解淀粉芽孢桿菌HxP-21 PulBa的分離純化Table 1Summary of the purification procedure of PulBafrom B.amyloliquefaciens HxP-21

2.1.3 SDS-PAGE分析

經(jīng)柱層析后的活性樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖3所示。經(jīng)離子交換層析去除大量雜蛋白及色素，但SDS-PAGE仍顯示含有較多雜蛋白。經(jīng)兩次柱層析后的樣品泳道2顯示單一條帶，表明純化后組分基本達(dá)到電泳純水平，與標(biāo)準(zhǔn)蛋白對照其分子質(zhì)量約為51.2 kDa。還原與非還原SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，PulBa在還原與非還原條件下均為同樣分子質(zhì)量大小的單一條帶，表明酶中不存在二硫鍵，初步推測PulBa單亞基蛋白。非還原SDS-PAGE后凝膠經(jīng)孵育酶解，盧革氏碘液染色顯示單一活性條帶（圖3泳道3），位置與考馬斯亮藍(lán)染色條帶一致，說明經(jīng)兩次柱層析純化的樣品泳道2單一條帶為PulBa酶蛋白。其分子質(zhì)量與報(bào)道的其他普魯蘭酶相比偏小，如Song Wan等[15]報(bào)道的B.naganoensisJNB-1基因重組表達(dá)的酶分子質(zhì)量為100 kDa，Wang Yue等[16]報(bào)道的重組芽孢桿菌產(chǎn)物分子質(zhì)量為101 kDa，Zeng Yan等[17]報(bào)道的14 種不同基因來源的重組菌株的產(chǎn)物的分子質(zhì)量都處在100～121 kDa之間，Li Xiaoxiao等[14]報(bào)道的枯草芽孢桿菌STR的PulA基因重組酶分子質(zhì)量83 kDa。但與Wu Huaiwei等[18]報(bào)道的源于Thermus thermophilusHB27基因重組表達(dá)的普魯蘭酶分子質(zhì)量（52 kDa）非常接近，而比吳永等[19]報(bào)道的巨大芽孢桿菌P6普魯蘭酶（分子質(zhì)量為43 kDa）大。

圖3 PulBa純化步驟SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analyses of PulBa at different purification steps

2.2 酶學(xué)性質(zhì)分析

2.2.1 酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性

如圖4所示，在30～90 ℃范圍內(nèi)酶活力差異顯著，酶最適作用溫度55 ℃，但45～70 ℃之間酶活力都在55 U/mL以上，說明PulBa適合高溫反應(yīng)，即使溫度達(dá)到80 ℃時(shí)，仍具有高于40 U/mL的活力。不同來源的普魯蘭酶最適作用溫度差異較大，Wei Wei等[12]報(bào)道的重組普魯蘭酶40 ℃；孫利鵬等[20]研究的耐熱普魯蘭酶75 ℃，但超過80 ℃后酶活力立刻下降，85 ℃時(shí)酶活力不足50%；Zareian等[21]研究的普魯蘭酶65 ℃，80 ℃時(shí)酶活力下降至約40%；王鳳寰等[22]報(bào)道的普魯蘭酶與PulBa相似，其最適溫度為55 ℃，但在高于60 ℃后，酶活力迅速下降，65 ℃時(shí)只有8.75%的酶活力。與文獻(xiàn)相比，顯著差異在于PulBa在較廣的溫度范圍內(nèi)（45～70 ℃）保持高活力，而文獻(xiàn)報(bào)道的往往溫度稍微波動(dòng)，酶活力則迅速下降[23]。實(shí)際應(yīng)用中，PulBa對酶解工藝要求不必過于苛刻，在寬泛的溫度范圍內(nèi)都可達(dá)到好的酶解效果。如圖5所示，酶熱穩(wěn)定性較好，40～70 ℃隨著時(shí)間延長，酶活力下降緩慢，保溫120 min后40、50、60 ℃和70 ℃對應(yīng)相對酶活力仍保持100%、96%、91%和83%。80 ℃保溫60 min還保持75%。國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道了不同來源酶的熱穩(wěn)定性情況，Wu Huawei等[18]研究的熱穩(wěn)定普魯蘭酶70 ℃處理60 min后，保留了約70%的活性；Long Jie等[9]報(bào)道的非固定化的普魯蘭酶60 ℃保溫120 min殘余酶活力低于70%；Lu Zhenghui等[10]報(bào)道的B.pseudofirmus703普魯蘭酶45 ℃以下穩(wěn)定，50 ℃時(shí)則迅速失活；Wei Wei等[12]研究的B.cereusNws-bc5 I型普魯蘭酶50 ℃保溫60 min殘余酶活力僅有約40%。PulBa有較好的熱穩(wěn)定性優(yōu)勢。

圖4 PulBa的最適反應(yīng)溫度Fig.4 Optimal reaction temperature of PulBa

圖5 溫度對PulBa穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of temperature on the stability of PulBa

2.2.2 酶的最適反應(yīng)pH值及pH值穩(wěn)定性

如圖6所示，最高酶活力出現(xiàn)在pH 4.5，在pH 3～6表現(xiàn)出較高酶活性，均高于60 U/mL。但pH值高于6.0時(shí)，隨pH值升高酶活力急劇下降。pH 8.0時(shí)的酶活力僅為20 U/mL，說明PulBa更適合酸性環(huán)境。與PulBa相似的還有Roy等[24]報(bào)道的II型普魯蘭酶最適pH值為5.0，在pH 4.5～5.6時(shí)有較高活性；Kahar等[25]報(bào)道的嗜熱芽孢桿菌普魯蘭酶最適pH 6.0；Odibo等[26]報(bào)道的嗜熱放線菌普魯蘭酶最佳反應(yīng)pH 5.0；Zhang Huanxin等[27]報(bào)道的最適反應(yīng)pH 5.0。目前報(bào)道的大多數(shù)普魯蘭酶的最適pH值集中在5.0～9.0[10,12,18,28-29]內(nèi)。由圖6 pH值穩(wěn)定性曲線可以看出，在pH 3.0～7.0的范圍中，處理6 h后酶活力都維持60 U/mL以上，說明在這些pH值條件下長時(shí)間處理對酶活力產(chǎn)生的影響極小，適合于長時(shí)間的使用。而在pH 7.0～8.0殘余酶活力下降明顯，但依舊能達(dá)到45 U/mL。Liu Jingjing等[30]報(bào)道的Paenibacillus barengoltzii基因異源表達(dá)的普魯蘭酶，不同pH值條件下30 min后酶活力在80%左右。Xu Qingrui等[31]所報(bào)道的來自Paenibacillussp.SSG-1的普魯蘭酶在pH 6～7范圍酶活力較穩(wěn)定，但超出以上范圍酶活力損失嚴(yán)重。

圖6 PulBa的最適pH值及其pH值穩(wěn)定性Fig.6 Optimal reaction pH and pH stability of PulBa

2.2.3 不同金屬離子和化學(xué)試劑對酶活力的影響

表2 金屬離子和化學(xué)試劑對PulBa活性的影響Table 2Effect of various metal ions and chemical reagents on PulBa activity

如表1所示，為確定酸根離子Cl－是否對酶活力產(chǎn)生影響，以NaNO3作對照，結(jié)果顯示NaCl和NaNO3對酶活力均有較弱的激活作用，兩者無明顯區(qū)別，表明酸根離子Cl－和NO3－對酶活力沒有影響。在金屬離子中，Na+和K+對酶略有激活作用；激活作用最為顯著的是Mg2+和Ca2+，在低濃度1 mmol/L和高濃度10 mmol/L時(shí)激活作用均偏弱，當(dāng)濃度5 mmol/L時(shí)，相對酶活力分別提高至127.6%和131.9%。很多普魯蘭酶活力需要Ca2+激活并維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[32]。Shewanella arctica來源的I型普魯蘭酶Pul13A[33]、B.cereusNws-bc5來源的普魯蘭酶PulBC[26]都是Ca2+依賴型的普魯蘭酶。據(jù)報(bào)道Klebsiella pnumoniae普魯蘭酶的晶體結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)了5 個(gè)鈣結(jié)合位點(diǎn)[34]，認(rèn)為Ca2+通過與這些結(jié)構(gòu)與的界面附近的水分子或氨基酸殘基相互作用而協(xié)調(diào)八面體的幾何形狀，因此可能有助于提高酶的熱穩(wěn)定性；Li+、Ba2+和Cu2+對酶活力沒有顯著作用，而Wu Huawei等[18]報(bào)道的Thermus thermophilusHB27耐熱型普魯蘭酶則被Cu2+完全抑制；Zn2+、Ni2+、Mn2+、Fe2+和Co2+對酶活力產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制作用，這與Wei Wei等[12]報(bào)道的I型普魯蘭酶受到Ni2+、Mn2+抑制相似；其中Pb2+和Hg2+有最強(qiáng)的抑制作用，酶活力完全喪失，可能因?yàn)槠渑cPulBa半胱氨酸殘基上的巰基反應(yīng)從而破壞酶的三級結(jié)構(gòu)，使其完全失去酶活力。所有測試的化學(xué)試劑都對酶活力產(chǎn)生抑制作用，其中EDTA、β-巰基乙醇和DTT的抑制作用非常強(qiáng)烈，殘余酶活力僅不到40%；SDS和Tween 80抑制作用較弱，殘余酶活力都在85%以上，但Elleuche報(bào)道[33]的普魯蘭酶在0.35 mol/L SDS存在時(shí)能顯著激活酶活力達(dá)139%；尿素和CTAB抑制作用中等，處理后殘余酶活力分別在62.3%和73.5%，陽離子試劑CTAB可能結(jié)合在酶的催化活性中心帶負(fù)電荷的氨基酸殘基[33]；EDTA抑制PulBa活性，可能是EDTA作為金屬螯合劑，結(jié)合走了PulBa結(jié)構(gòu)中所需要的金屬離子導(dǎo)致PulBa活力的降低，進(jìn)一步說明PulBa是Mg2+或Ca2+依賴型金屬酶；DTT和β-巰基乙醇都能夠嚴(yán)重抑制PulBa活力，說明在酶的結(jié)構(gòu)中存在著大量的二硫鍵用于構(gòu)建蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，這兩種修飾劑能夠破壞已經(jīng)形成的二硫鍵，從而導(dǎo)致了蛋白質(zhì)酶活力的降低，但Elleuche等[33]報(bào)道的Shewanella arcticaI型普魯蘭酶DTT反而可使酶活力提高至150%。以上特性同報(bào)道的普魯蘭酶對比發(fā)現(xiàn)有些酶特性相類似，而很多金屬離子和化學(xué)試劑對酶的作用效果有較大差異，說明PulBa存在結(jié)構(gòu)上的特異性，導(dǎo)致出現(xiàn)各種金屬離子和化學(xué)試劑存在時(shí)，酶活力存在顯著的差別現(xiàn)象。

2.2.4 底物特異性分析

如表3所示，底物為普魯蘭糖時(shí)，PulBa有最高活力，米氏常數(shù)Km為1.34 mg/mL，最大反應(yīng)速率Vmax為24.6 μmol/（min·mg）；以馬鈴薯支鏈淀粉和玉米支鏈淀粉為底物，相對酶活力約在40%，對應(yīng)Km分別為6.54、6.10 mg/mL，Vmax分別為9.5、10.7 μmol/（min·mg）；當(dāng)?shù)孜餅榭扇苄缘矸刍蛱窃瓡r(shí)，酶活力相近，約20%，對應(yīng)Km分別為7.9、8.3 mg/mL，Vmax分別為5.1、4.5 μmol/（min·mg）。α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精和直鏈淀粉則完全沒有酶活力。說明PulBa專一性水解α-1,6-糖苷鍵，而對α-1,4-糖苷鍵無水解活性，屬于I型普魯蘭酶。通常，I型普魯蘭酶對分子結(jié)構(gòu)中存在α-1,6-糖苷鍵的多糖如普魯蘭糖、支鏈淀粉、糖原等有廣泛的底物特異性[30]，而PulBa對普魯蘭糖表現(xiàn)出嚴(yán)格的底物特異性，對支鏈淀粉活性、糖原活性很弱，對其他底物無水解活性。推測PulBa是一種新型的普魯蘭酶，其結(jié)構(gòu)和報(bào)道的存在差異。PulBa以普魯蘭糖為底物Km與Lu Zhenghui[10]、Wei Wei[12]等報(bào)道的I型普魯蘭酶一致；但比Talekar[35]（Km3.54 mg/mL）、Singh[36]等（Km4.4 mg/mL）報(bào)道的相比偏小，說明PulBa對普魯蘭糖有更強(qiáng)的親和性；但相比于來源于B.subtilis（Km0.032 mg/mL）[37]、B.pseudofirmus703（Km0.31 mg/mL）[10]、B.cereusNws-bc5（Km0.45 mg/mL）[12]等菌株的Km值較大。

表3 普魯蘭酶底物特異性分析Table 3Substrate specificity of the purified PulBa

為了確定PulBa對底物普魯蘭糖的水解產(chǎn)物情況，通過薄層層析分析水解產(chǎn)物。由圖7看出，泳道2酶液與普魯蘭糖溶液反應(yīng)后的產(chǎn)物為單一的麥芽三糖，無葡萄糖、麥芽糖和麥芽四糖存在。與泳道3對比發(fā)現(xiàn)，若有未被水解的普魯蘭糖則會(huì)留在點(diǎn)樣處，泳道2上樣處無底物顯示，說明泳道2中上樣普魯蘭糖被完全水解。因普魯蘭糖完全由α-1,4-糖苷鍵連接的麥芽三糖重復(fù)單位經(jīng)α-1,6-糖苷鍵聚合而成的直鏈狀多糖，PulBa能專一性水解α-1,6-糖苷鍵，而對α-1,4-糖苷鍵無水解活性，所以PulBa對底物經(jīng)過充分水解后得到唯一產(chǎn)物為麥芽三糖。PulBa對α-1,6-糖苷鍵的專一水解特性使其在應(yīng)用方面具有諸多優(yōu)勢，在淀粉水解方面可與糖化酶一起使用，徹底水解淀粉支鏈，提高淀粉的糖化效率由液化淀粉漿來生產(chǎn)高葡萄糖漿和高麥芽糖漿。還可水解液化淀粉中的α-1,6-D-糖苷鍵而產(chǎn)生包含α-1,4-D-葡萄糖鍵的直鏈多聚糖。

圖7 普魯蘭糖水解產(chǎn)物的薄層層析Fig.7 TLC analysis of the hydrolysate of pullulan by the purified PulBa

3 結(jié) 論

本研究以前期分離篩選的解淀粉芽孢桿菌HxP-21為菌種，發(fā)酵后，通過一系列的分離純化步驟獲得了電泳純的PulBa。經(jīng)純化比活力達(dá)到176.5 U/mg，回收率53.2%，純化倍數(shù)20.8，整體純化效率高。PulBa分子質(zhì)量與文獻(xiàn)報(bào)道的有較大區(qū)別。PulBa在酸性條件及較高溫度下催化活力強(qiáng)，55 ℃、pH 4.5催化活力最高。在較高的溫度范圍及寬泛的酸性條件下PulBa表現(xiàn)出較強(qiáng)的穩(wěn)定性。不同的金屬離子、化學(xué)試劑對PulBa的激活或抑制作用與報(bào)道的普魯蘭酶相比，某些作用效果有相似性，但在很多方面存在顯著差異。底物特異性研究表明PulBa是典型的I型普魯蘭酶，但在底物專一性方面又和多數(shù)報(bào)道的I型普魯蘭酶不完全相同?？偟膩碚f，PulBa在分子質(zhì)量、酸堿穩(wěn)定性、最適酶解條件、理化性質(zhì)及底物專一性方面表現(xiàn)出獨(dú)特的性質(zhì)。尤其在熱穩(wěn)定性方面PulBa優(yōu)勢更為突出（80 ℃保溫60 min酶活力還保持75%），是典型的熱穩(wěn)定性普魯蘭酶。PulBa有望應(yīng)用于一些特定高溫酸性環(huán)境的淀粉加工中或者微生物發(fā)酵、生物能源、垃圾降解等具有特殊生產(chǎn)環(huán)境的領(lǐng)域。