斯婷　　陸瀅　　唐善浩　　裴仁治

[摘要] 目的 分析抑制素β-A（INHBA）在急性髓系白血病（AML）中的表達，并應(yīng)用生物信息學技術(shù)探索及預(yù)測INHBA在AML中的生物學功能。 方法 收集2015年1月至2018年12月我院連續(xù)收治的AML患者骨髓標本120例及來源于造血干細胞移植供者的健康成人骨髓標本15例，采用細胞免疫組化、Western Blot、qRT-PCR等方法檢測INHBA在AML不同細胞系及AML患者與正常成人中的表達水平;利用STRING數(shù)據(jù)庫及KEGG富集分析構(gòu)建INHBA蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)并預(yù)測其功能。 結(jié)果 INHBA在AML細胞系（Kasumi-1、KG-1及THP-1）中均有表達;qRT-PCR驗證了INHBA在AML中的表達水平均值高于正常對照（0.718 vs 0.377），差異無統(tǒng)計學意義（P=0.286）;蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)互作分析顯示，與INHBA互作得分在0.90 以上的17個蛋白，從高到低分別為FSTL3、ACVR2A、ACVR2B、ACVR1B、ACVR1C、ACVR1、ACVRL1、INHA、ENG、SMAD2、SMAD3、INHBB、SMAD4、IGSF1、FSHB、CGA、FKBP1A;KEGG富集分析顯示，INHBA及其互作蛋白主要功能富集于TGF-β信號通路與BMP/Smad信號通路。結(jié)論 INHBA在AML中高表達，可能通過調(diào)控TGF-β與BMP/Smad信號通路參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

[關(guān)鍵詞] INHBA;急性髓系白血病;功能預(yù)測;生物信息

[中圖分類號] R551? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）09-0044-04

Expression and function prediction of INHBA in acute myeloid leukemia

SI Ting? ?LU Ying? ?TANG Shanhao? ?PEI Renzhi

Department of Hematology， the Affiliated People's Hospital of Ningbo University， Ningbo? ?315040， China

[Abstract] Objective To analyze the expression of inhibin β-A （INHBA） in acute myeloid leukemia（AML）， and to explore and predict the biological function of INHBA in AML by applying bioinformatics technology. Methods A total of 120 bone marrow specimens from AML patients in our hospital from January 2015 to December 2018，and 15 healthy adult bone marrow specimens from hematopoietic stem cell transplantation donors were selected. The expression level of INHBA in different AML cell lines， AML patients， and normal adults were detected by cellular immunohistochemistry，Western Blot，and qRT-PCR. STRING database and KEGG enrichment analysis were used to construct INHBA protein interaction network and predict its function. Results INHBA was expressed in AML cell lines（Kasumi-1， KG-1， and THP-1）. The expression level of INHBA in AML was higher than that of the normal control verified by qRT-PCR （0.718 vs 0.377）. The difference between the two groups was no statistically significant（P=0.286）. Protein network interaction analysis showed that 17 proteins with an interaction score above 0.90 with INHBA， from high to low， were FSTL3， ACVR2A， ACVR2B， ACVR1B， ACVR1C， ACVR1， ACVRL1， INHA， ENG， SMAD2， SMAD3， INHBB， SMAD4， IGSF1， FSHB， CGA， FKBP1A. KEGG enrichment analysis showed that the main functions of INHBA and its interacting proteins were enriched in the TGF-β signaling pathway and BMP/Smad signaling pathway. Conclusion INHBA is highly expressed in AML， which may be involved in the occurrence and development of tumors by regulating TGF-β and BMP/Smad signaling pathways.

[Key words] INHBA; Acute myeloid leukemia; Function prediction; Biological information

抑制素β-A（Inhibinβ-A，INHBA）是轉(zhuǎn)化生長因子β（Transforming growth factor β， TGF-β）超家族的一個配體[1]，多項研究發(fā)現(xiàn)，INHBA在肺腺癌、食管鱗狀細胞癌、胃癌、結(jié)腸癌、膀胱上皮癌等腫瘤組織中高表達，且其高表達與患者預(yù)后不良相關(guān)[2-6]，提示INHBA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及演進中具有重要意義。本研究團隊在前期研究檢測了初發(fā)急性髓系白血?。ˋcute myeloid leukemia，AML）患者骨髓單個核細胞（Mononuclear cells，MNCs）中INHBA基因的表達水平，結(jié)果顯示首次發(fā)現(xiàn)INHBA高表達的患者治療反應(yīng)差、總體生存率低，INHBA高表達是AML患者預(yù)后不良的獨立危險因素[7]。但目前INHBA在AML中的作用機制尚未揭示，其可能生物學功能尚未明確。因此，本研究將進一步研究INHBA在AML中蛋白及基因水平上的表達，且進一步用生物信息學方法預(yù)測INHBA在AML中的生物學功能，為探討INHBA在AML中的作用機制提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料

選取2015年1月至 2018年12月于寧波大學醫(yī)學院附屬鄞州人民醫(yī)院收治的120例初診未治療的AML患者。診斷均符合 WHO（2008）MICM分型診斷標準[8]，且除外急性早幼粒細胞白血病患者，所有初診患者在診斷時留取骨髓標本5 mL。另外留取15例行異基因造血干細胞移植的健康供者骨髓標本作為對照組，隨后用Ficoll密度梯度離心法分離骨髓MNCs。以上所有患者均簽署知情同意書，并獲寧波大學醫(yī)學院附屬鄞州人民醫(yī)院醫(yī)學臨床倫理委員會批準備案。

1.2試劑及儀器

INHBA單克隆抗體、羊抗鼠二抗購于美國Santa Cruz Biotechnology公司，DAB試劑盒購于北京中杉金橋公司，Trizol試劑購于上海Invitrogen公司，RevertAid cDNA Synthesis Kit試劑購于上海Thermo Scientific公司，PCR儀LightCycler 480Ⅱ購于上海羅氏公司。

1.3 免疫組織化學

分析INHBA在AML患者及正常成人骨髓MNCs中的蛋白表達水平，參照Tan等[9]在研究中所用的免疫組織化學實驗方法。將Ficoll分離所得MNCs涂片于載玻片上，在10%中性緩沖福爾馬林溶液中固定1 min后，用濃度為1∶100的一抗INHBA孵育，隨后用PBS洗滌，繼續(xù)用帶生物標記的二抗孵育后用DAB IHC 檢測試劑盒顯色，顯色后圖像使用奧林巴斯顯微鏡觀察獲取?？贵w陽性判斷標準：INHBA蛋白陽性表達定位于細胞胞質(zhì)內(nèi)，以>20%的細胞染色為棕黃色判定為陽性。

1.4 蛋白免疫印跡（Western Blot）實驗

檢測INHBA在AML細胞系（Kasumi-1、KG-1及THP-1）中的表達，以β-actin作為內(nèi)參。收集處于指數(shù)增長期的AML細胞，加入蛋白裂解液抽提離心提取總蛋白，BCA法測定總蛋白水平，等量上樣后經(jīng)SDS-PAGE轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用鼠抗人INHBA單克隆抗體（孵育濃度1∶1000）進行Western Blot雜交，化學發(fā)光試劑檢測目的條帶。

1.5 實時定量熒光PCR（qRT-PCR）實驗

用Trizol試劑從骨髓MNCs中提取總RNA，用RevertAid cDNA Synthesis Kit試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板擴增INHBA基因，INHBA cDNA的正向引物和反向引物分別為5-CATTG CTCCCTCTGGCTATCAT-3，5-GCACACAGCACGAT TTGAGGTT-3。以TBP基因作為內(nèi)參物。使用SYBR Green PCR Master Mix在LightCycler 480Ⅱ系統(tǒng)上進行。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的組間均數(shù)比較采用t檢驗，非正態(tài)分布采用Kruskal-Wallis H檢驗，兩組及兩組以上率的比較采用χ2檢驗和Fisher確切概率檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

1.7 STRING蛋白網(wǎng)絡(luò)分析（https：//string-db. org/）

應(yīng)用生物信息學在線分析工具STRING分析INHBA 的上下游調(diào)控蛋白及其與蛋白間的相關(guān)作用關(guān)系。檢索條件：①Protein Name：INHBA; ②Organism：Homo-sapiens。并對INHBA進行KEGG 分析，得到功能富集分析和信號通路分析數(shù)據(jù)。校正 P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 INHBA在AML不同細胞系中的表達

在AML的三個不同細胞系（Kasumi-1、KG-1及THP-1）中，采用免疫組化及Western Blot的方法檢測INHBA蛋白的表達，結(jié)果顯示，INHBA在上述三個細胞系中均有較高的表達，且免疫組化結(jié)果在光鏡下顯示，INHBA蛋白表達定位于AML細胞的胞質(zhì)內(nèi)（封三圖6）。免疫組化結(jié)果與Western Blot結(jié)果具有一致性。

2.2 INHBA在AML患者及正常成人骨髓MNCs中的表達

收集120例成人初發(fā)AML患者骨髓MNCs及15例正常成人骨髓MNCs，qRT-PCR檢測INHBA基因的表達水平，結(jié)果顯示，在AML患者中其表達水平高于對照組，兩組INHBA基因平均拷貝數(shù)分別為0.718、0.377，但其差異無統(tǒng)計學意義（P=0.286）。

2.3 INHBA在細胞中的功能預(yù)測

利用STING 網(wǎng)站進行INHBA的蛋白互作分析，得到相應(yīng)的蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖（圖2A），相互作用節(jié)點數(shù)共有21個，篩出與INHBA具有較高互作作用的蛋白，互作得分在0.90 以上的17個蛋白，從高到低分別是FSTL3、ACVR2A、ACVR2B、ACVR1B、ACVR1C、ACVR1、ACVRL1、INHA、ENG、SMAD2、SMAD3、INHBB、SMAD4、IGSF1、FSHB、CGA、FKBP1A（圖2B）。其中SMAD2、SMAD3、SMAD4屬于SMAD蛋白超家族，SMAD4蛋白是BMP/Smad通路中的關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導因子。

此外，進一步通過KEGG富集分析結(jié)果顯示，INHBA及其互作蛋白主要功能富集于TGF-β信號通路與BMP/Smad信號通路，且其生物學過程（Biological process，BP）主要富集于通路中限制性調(diào)節(jié)因子SMAD蛋白磷酸化的正向調(diào)節(jié)，分子功能（Molecular function，MF）富集于SMAD蛋白的結(jié)合與激活，細胞成分（Cellular component，CC）富集于形成SMAD蛋白復合物。

3 討論

INHBA蛋白是TGF-β超家族的一個配體，有9個半胱氨酸殘基結(jié)構(gòu)，定位于細胞胞質(zhì)內(nèi)，人INHBA基因位于7號染色體p15-p13上。INHBA亞基以二硫鍵聚合而成的二聚體抑制素A（Activin A）具有多種不同的生物學功能，在早期胚胎形成過程中能促進胚胎細胞的分化[10]，Activin A的長期暴露會促進癌細胞的生長、增強腫瘤的侵襲性以及抑制細胞凋亡[11- 12]。

多個研究報道，INHBA在多種不同的實體腫瘤中高表達，且其表達水平與疾病預(yù)后不良相關(guān)，包括多種消化道腫瘤，如胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、食管腺癌等[2-3，13-15]，以及泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤，包括膀胱上皮細胞癌、卵巢癌等[4，16]。在慢性粒細胞白血?。–ML）中，有研究報道，INHBA在CML疾病的不同時期（慢性期、加速期、急變期）均異常高表達，尤其是急變期，且高表達INHBA的這部分CML患者對絡(luò)氨酸激酶抑制劑的治療反應(yīng)更差[17-18];在彌漫大B細胞淋巴瘤中，INHBA起到抑制腫瘤細胞生長的作用[19]。

而為了探討INHBA在AML中的臨床意義，本研究團隊在前期工作中檢測了INHBA在成人初發(fā)AML患者MNCs中的表達，并分析其表達水平與患者臨床特點、治療反應(yīng)及預(yù)后間的關(guān)系。結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)INHBA的異常表達與AML患者的預(yù)后不良相關(guān)。在臨床特點方面，高表達INHBA與AML患者高齡（>60歲）、染色體不良核型、合并貧血及FLT3-ITD基因陽性等相關(guān);在治療反應(yīng)及遠期療效方面，高表達INHBA的這部分患者有著較差的臨床預(yù)后，誘導治療反應(yīng)差、早期死亡率高、完全緩解率低、復發(fā)率高、總體生存率低。且進一步多因素分析發(fā)現(xiàn)，INHBA可能為AML預(yù)后不良的獨立危險因素[7]。因此INHBA可能為與AML預(yù)后不良相關(guān)的分子標志物，但目前INHBA高表達影響AML患者預(yù)后的原因及其在AML發(fā)生發(fā)展中作用的內(nèi)在機制尚未揭示。

本研究首先檢測了INHBA在AML初治患者及正常成人骨髓MNCs中的表達水平，AML患者的INHBA表達要高于正常成人，但因?qū)φ战M樣本量較少，兩組樣本量差距較大，兩組間未見明顯差異。但此結(jié)果與前期已發(fā)表的實驗結(jié)果一致，側(cè)面證實INHBA在AML中可能促進腫瘤進展，也為后續(xù)進一步實驗提供理論基礎(chǔ)，可在此基礎(chǔ)上擴大樣本量進一步研究。其次，本研究在蛋白質(zhì)水平上采用免疫組化及Western Blot兩種方法驗證了INHBA在AML不同細胞系中的表達，在蛋白質(zhì)水平上證實了INHBA在AML中的表達。另外，通過STRING分析INHBA在蛋白網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中的作用，結(jié)果顯示INHBA可能與FSTL3、ACVR2A、ACVR2B、ACVR1B、ACVR1C、ACVR1、ACVRL1、INHA、ENG、SMAD2、SMAD3、INHBB、SMAD4、IGSF1、FSHB、CGA、FKBP1A蛋白相互作用，進一步用KEGG富集分析INHBA及其互作蛋白的主要功能，顯示主要富集于TGF-β信號通路與BMP/Smad信號通路，且其BP、MF、CC等富集于SMAD蛋白家族的互相結(jié)合、活化、磷酸化等功能的正負調(diào)節(jié)，為INHBA在AML中的表達調(diào)控研究提供了基本研究方向。

在利用數(shù)據(jù)庫預(yù)測INHBA互作蛋白及相應(yīng)生物學功能時，發(fā)現(xiàn)INHBA可能通過調(diào)控BMP/Samd通路來發(fā)揮作用，BMP/Smad通路是BMP信號通路活化的一個經(jīng)典方式，在多種骨病及惡性腫瘤中表達失調(diào)[20]，且該信號通路在造血干細胞（Haemopoietic stem cells，HSCs）自我更新中發(fā)揮重要作用[18， 21]。細胞自我更新能力是HSCs無限增殖的重要原因之一。最新研究表明，白血病干細胞的自我更新機制依賴于BMP、TGF-β配體蛋白在骨髓微環(huán)境中的級聯(lián)演化[17，22]。結(jié)合上述分析，提示INHBA在AML中可能參與調(diào)節(jié)白血病干細胞的增殖、分化等過程，從而促進腫瘤發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究通過對AML中INHBA表達的分析，以及利用數(shù)據(jù)庫及網(wǎng)頁在線分析工具分析與INHBA相互作用的蛋白，INHBA可能通過調(diào)控TGF-β信號通路與BMP/Smad信號通路參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，為進一步研究INHBA在AML中的作用機制提供了研究方向和理論依據(jù)。

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（收稿日期：2020-07-31）