陳 良 , 鄧 煒 , 陳 告 , 王水蓮 , 朱國華 , 邱小燕
(1.懷化市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 , 湖南 懷化 418000 ; 2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 , 湖南 長沙 410000 ; 3.懷化學(xué)院生物與食品工程學(xué)院 , 湖南 懷化 418000)
豬大腸埃希菌病是由致病性大腸埃希菌(Escherichiacoli)引起的豬的一種細(xì)菌性傳染病,廣泛存在于世界各地,給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重?fù)p失[1],常引起仔豬白痢、仔豬黃痢和仔豬水腫等疾病。治療該病的藥物主要為抗菌類藥物,但是藥物長期不合理的使用,使得大腸埃希菌耐藥程度和多重耐藥性問題愈發(fā)突出[2-6],并且大腸埃希菌血清型復(fù)雜,交叉免疫保護(hù)力不高,免疫效果不理想,導(dǎo)致其防治日益嚴(yán)峻,形勢不容樂觀[7-8]。
為了掌握湖南省懷化地區(qū)中小規(guī)模養(yǎng)豬場的大腸埃希菌耐藥現(xiàn)狀,建立該區(qū)域針對性的防治措施,本試驗(yàn)在轄區(qū)20個中小規(guī)模養(yǎng)殖戶采集120份樣品,依托本單位畜牧實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行藥敏試驗(yàn)和耐藥基因檢測。為指導(dǎo)該地區(qū)養(yǎng)殖戶針對該病正確防治和相關(guān)獸藥監(jiān)管提供參考。
1.1 試驗(yàn)材料
1.1.1 試驗(yàn)菌株 試驗(yàn)用大腸埃希菌分離自2019年3—7月從懷化地區(qū)的溆浦縣、中方縣、洪江區(qū)、鶴城區(qū)、洪江地區(qū)、芷江縣、新晃縣、辰溪縣、麻陽縣和會同縣10個縣(地區(qū)、區(qū))內(nèi)的20個中小規(guī)模養(yǎng)豬場采集的120份糞便拭子。
1.1.2 主要試劑及藥敏紙片 麥康凱瓊脂、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、TSA營養(yǎng)瓊脂粉、MH瓊脂培養(yǎng)基,均購自青島海博生物有限公司;2×TaqMaster Mix、DL2 000 DNA marker,均購自天根生化科技(北京)有限公司;引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成;10種藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司,藥敏紙片及濃度分別為:紅霉素(15 μg/片)、諾氟沙星(10 μg/片)、環(huán)丙沙星(5 μg/片)、復(fù)方新諾明(25 μg/片)、氯霉素(30 μg/片)、青霉素(10 U/片)、氨芐西林(10 μg/片)、頭孢唑啉(30 μg/片)、丁胺卡那霉素(30 μg/片)、慶大霉素(10 μg/片)。
1.2 大腸埃希菌的分離鑒定
1.2.1 樣品采集與初步分離鑒定 采用直腸拭子法采集樣品,放入盛有0.9%生理鹽水的EP管中,冷藏運(yùn)輸。將采集的樣品無菌操作劃線于麥康凱培養(yǎng)基上,37 ℃ 培養(yǎng)18~24 h后,將圓形、光滑、隆起、濕潤、紅色疑似菌落在伊紅美蘭培養(yǎng)基上37 ℃再培養(yǎng)18~24 h,然后選取紫黑色帶有金屬光澤疑似大腸埃希菌,用革蘭染色法進(jìn)行染色和鏡檢。根據(jù)觀察結(jié)果,將其純化培養(yǎng),4 ℃冷藏備用。
1.2.2 PCR擴(kuò)增檢測 參照文獻(xiàn)[9-11]提取大腸埃希菌DNA。16S rRNA通用引物序列為F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′,以提取的細(xì)菌DNA為模版,反應(yīng)體系為25 μL:DNA模版1 μL、上下游引物各1 μL、2×TaqMaster Mix 12.5 μL,加ddH2O補(bǔ)足至25 μL。 PCR反應(yīng)條件為35個循環(huán),預(yù)變性94 ℃ 5 min, 進(jìn)入循環(huán)94 ℃ 50 s,58 ℃ 50 s,72 ℃ 50 s,72 ℃延伸10 min,4 ℃保存或?qū)CR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將含有目的片段的凝膠回收送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序,將測序結(jié)果與GenBank中大腸埃希菌參考基因進(jìn)行比對。
1.3 藥敏試驗(yàn) 采用K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法對分離菌株進(jìn)行10種常用抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)[12]。將分離菌株分別接種于營養(yǎng)肉湯,37 ℃ 培養(yǎng)18 h,用生理鹽水調(diào)節(jié)菌液至0.5麥?zhǔn)蠞岫?含菌量1×108CFU/mL),然后量取100 μL菌液,用涂布棒在MH瓊脂培養(yǎng)基均勻涂布,待干后,在培養(yǎng)基上分別將藥敏紙片均勻粘貼,37 ℃ 培養(yǎng)16~18 h。結(jié)果參照《抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》2012版[13-14]進(jìn)行判定。
1.4 耐藥基因擴(kuò)增 參考相關(guān)文獻(xiàn)[15-16]擴(kuò)增大壞內(nèi)酯類(emB、emC、emF)、磺胺類(Sul1、Sul2)、氨基糖苷類[aadA1、aac(3′)-Ⅱa]和酰胺醇類floR共4類8種耐藥基因,引物信息見表1,引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。以提取的細(xì)菌DNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25 μL:模版1 μL、上下游引物各1 μL、2×TaqMaster Mix 12.5 μL,加ddH2O 補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)條件為35個循環(huán),預(yù)變性95 ℃ 5 min,進(jìn)入循環(huán)94 ℃ 50 s,按各引物Tm值退火50 s,72 ℃ 50 s,72 ℃ 延伸10 min,結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
表1 耐藥基因引物信息Table 1 The primers of PCR for antibiotic genes
2.1 菌株初步鑒定 從120個糞便拭子中分離86株疑似大腸埃希菌,其在麥康凱培養(yǎng)基中表現(xiàn)為邊緣光滑整齊、分布均勻的粉紅色、扁圓形的菌落;伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基表現(xiàn)為大小一致、具有金屬光澤的黑色菌落。經(jīng)革蘭染色后在顯微鏡下觀察為革蘭陰性菌,單個或成對存在,有菌毛、無芽胞,兩端鈍圓的粗短桿菌。
2.2 PCR鑒定 用16S rRNA的通用引物對86株分離菌株進(jìn)行PCR檢測,其片段大小為1 474 bp目的條帶,產(chǎn)物的測序結(jié)果與GenBank中大腸埃希菌參考基因序列同源性為99%,進(jìn)一步驗(yàn)證本試驗(yàn)分離菌株為大腸埃希菌,部分菌株P(guān)CR結(jié)果見圖1。
圖1 大腸埃希菌16S rRNA PCR鑒定Fig.1 16S rRNA PCR identification of Escherichia coliM:DL2 000 DNA marker; N:陰性對照; 1~10:分離菌株M:DL2 000 DNA marker; N:Negative control; 1-10:Isolated strains
2.3 藥敏試驗(yàn) 將分離鑒定出的86株豬源大腸埃希菌進(jìn)行7類10種抗菌藥物的敏感試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果表明,該批次分離的大腸埃希菌對參試的部分抗生素藥物耐藥率高,如紅霉素、復(fù)方新諾明分別為93.02%、86.05%,但丁胺卡那霉素敏感率最高,為86.05%,中敏率介于4.65%~32.56%,見表2。
表2 藥物敏感性試驗(yàn)Table 2 Drugs sensitivity test
2.4 耐藥基因檢測 對86株分離菌株進(jìn)行了4類8種耐藥基因檢測,8種耐藥基因[aadA1、aac(3′)-Ⅱa、floR、Sul1、Sul2、emB、emC、emF]電泳檢測和抽樣測序結(jié)果顯示,擴(kuò)增的片段大小與預(yù)期基本一致,且電泳檢測結(jié)果顯示,各基因陰性對照成立。耐藥基因檢出率顯示,Sul2的檢出率最高,為86.05%,其他依次為emF、floR、emB、aac(3′)-Ⅱa、aadA1、Sul1和emC,見表3。
表3 86株豬源大腸埃希菌耐藥基因檢出率Table 3 The drug resistance genes detection rate of 86 Escherichia coli strains isolated from swine
本試驗(yàn)對成功分離和鑒定出的86株Escherichiacoli開展的7類10種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn),結(jié)果顯示,分離菌株對部分抗菌藥物的耐藥性嚴(yán)重,其中紅霉素耐藥率最高,為93.02%;復(fù)方新諾明、青霉素、氨芐西林和氯霉素耐藥率也比較嚴(yán)重,介于72.09%~86.05%;諾氟沙星、環(huán)丙沙星、頭孢唑啉的耐藥率在13.95%~32.56%;但對丁胺卡那霉素耐藥率最低,為4.65%,該結(jié)果與其他動物源Esche-richiacoli的部分耐藥率有所差異,這可能與地域、菌株來源、動物種類、藥物使用習(xí)慣等藥物使用背景等因素有關(guān)。戰(zhàn)曉微[17]開展了47株大腸埃希菌中檢出產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶29株對四環(huán)素、環(huán)丙沙星、慶大霉素耐藥性試驗(yàn),其耐藥菌株檢出率分別70.21%、20.27%、14.89%;吳立婷[18]對揚(yáng)州地區(qū)臨床分離獲得的226株寵物源大腸埃希菌菌株進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn),其耐藥檢出率分別為慶大霉素28.32%、氨芐西林72.12%、氯霉素為32.30%;葛晨玲等[15]對廣西豬源大腸埃希菌進(jìn)行31種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn),結(jié)果顯示,對青霉素、磺胺甲惡唑、慶大霉素等耐藥性均高達(dá)87.10%;張莉莉等[19]對122株奶牛乳房炎大腸埃希菌的分離菌株進(jìn)行青霉素藥敏試驗(yàn),其耐藥率高達(dá)99.19%。值得注意的是,氯霉素在本試驗(yàn)中的耐藥率是吳立婷[18]試驗(yàn)結(jié)果的2.2倍,提示在日常的用藥過程中盡量避免使用酰胺醇類藥物。同時,所有參試的藥物中敏率居于4.65%~32.56%,可能長期使用同類藥物或短時期內(nèi)高頻率的使用同類藥物。為此,在本地區(qū)的畜牧生產(chǎn)應(yīng)避免使用紅霉素和青霉素,并盡量少使用復(fù)方新諾明、氨芐西林和氯霉素等耐藥性較強(qiáng)或敏感性低的藥物,應(yīng)合理用藥、輪換用藥。
耐藥基因檢測結(jié)果表明,懷化地區(qū)中小型養(yǎng)豬場耐藥基因檢出率整體水平較高,其中Sul2、emF、floR相對較高,其檢出率分別為86.05%、84.49%、82.50%;其次為耐藥基因aac(3′)-Ⅱa、emB、aadA1、Sul1和emC,依次為72.09%、67.44%、59.30%和52.32%;而emC的檢出率最低,為38.37%。這與在對本地區(qū)養(yǎng)殖戶實(shí)地走訪中了解到的情況基本相符,當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖戶常使用磺胺類、酰胺醇類和大環(huán)內(nèi)酯類藥物,可能的原因是此類藥物價格便宜、療效較好、抗菌譜廣,作為藥物或飼料添加劑深受養(yǎng)殖戶青睞。該試驗(yàn)結(jié)果與其他動物源Escherichiacoli部分結(jié)果存在差異,特別是耐藥基因floR、sul2遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他研究結(jié)果。湯景元等[20]開展氨基糖苷類的耐藥基因aadA1的檢測,檢出率為65.89%;張炳亮等[21]對洛陽地區(qū)氨基糖苷類的耐藥基因aac(3′)-Ⅱa進(jìn)行檢測,檢出率為88.20%;馬超[11]對寧夏地區(qū)抗生素類藥物的耐藥基因Sul1、Sul2、aac(3′)-Ⅱa、aadA1進(jìn)行檢測,檢出率分別為31.8%、37.4%、27.1%、19.3%;索朗斯珠等[22]對西藏6個不同地區(qū)的200株牦牛源大腸埃希菌耐藥基因檢測,其中floR、Sul1、Sul2檢出率分別為25%、7%、7%。本試驗(yàn)中,多數(shù)病原菌株的耐藥率與基因檢出率情況大致相同,但是氨基糖苷類結(jié)果差距較大,可能存在下面幾點(diǎn)原因:(1)本試驗(yàn)所檢測的氨基糖苷類的耐藥基因偏少,沒有對其他可能的耐藥基因進(jìn)行檢測;(2)目前已知氨基糖苷類耐藥機(jī)制有3種,可能是由于其他或新的非耐藥基因介導(dǎo)機(jī)制造成耐藥表型與耐藥基因的符合率存在較大差異;(3)樣品采集的局限性,如樣品量、動物的年齡、用藥習(xí)慣、樣品保存條件等,導(dǎo)致大腸埃希菌遺傳背景多樣化,導(dǎo)致的耐藥基因檢出率與耐藥率不符。
懷化地區(qū)中小型規(guī)模養(yǎng)豬場的大腸埃希菌對紅霉素、復(fù)方新諾明和青霉素耐藥嚴(yán)重,磺胺類藥物的耐藥基因Sul2檢出率為86.05%。建議本地區(qū)養(yǎng)殖戶對致病性大腸埃希菌所引發(fā)的疾病進(jìn)行防治時應(yīng)首選氟喹諾酮類、氨基糖苷類藥物。