瞿業(yè)宏 ， 岳 城

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 新疆 烏魯木齊 830052)

馬梨形蟲病(Equine piroplasmosis)是寄生于馬屬動物的淋巴細胞和紅細胞內(nèi)的血液原蟲病。該病主要發(fā)生于熱帶和亞熱帶地區(qū)，在歐洲、非洲、亞洲等地均有發(fā)生[1]，我國甘肅、青海、新疆等是該病的高發(fā)地區(qū)[2]。病原分為馬泰勒蟲(Theileriaequi,T.equi)和駑巴貝斯蟲(Babesiacaballi,B.caballi)。馬泰勒蟲病的病原為馬泰勒蟲(舊名馬巴貝斯蟲)，其蟲體小于紅細胞半徑，呈圓形、逗點形等多種形態(tài)。該蟲體侵襲動物后破壞紅細胞，多表現(xiàn)為稽留熱、呼吸困難、貧血、黃疸等癥狀，如診治不及時，死亡率極高[3-5]。馬駑巴貝斯蟲病的病原為駑巴貝斯蟲，該病原由媒介蜱蟲(革蜱等)攜帶，攜帶有病原的蜱蟲叮咬后，駑巴貝斯蟲隨蜱蟲唾液進入馬屬動物血液內(nèi)，對馬屬動物造成嚴(yán)重的危害[6-7]，病畜多呈現(xiàn)貧血、消瘦、黃疸、流產(chǎn)等，嚴(yán)重時造成死亡[8]。

本試驗對新疆阿勒泰地區(qū)的富蘊縣、福?？h、哈巴河縣、清河縣4個地區(qū)隨機抽取放牧馬匹進行梨形蟲病的檢測，以了解該地區(qū)的疾病感染率，為今后的綜合防控提供部分參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 2 697份放牧馬抗凝血樣品，于2018—2019年采自新疆阿勒泰地區(qū)富蘊縣(756份)、福?？h(831份)、哈巴河縣(513份)、清河縣(597份)4個地區(qū)，每份采集5 mL的血液樣品至EDTA抗凝管，標(biāo)注采集地點與采集時間，-20 ℃保存。

1.2 DNA提取 取馬全血200 μL，用DNA提取試劑盒進行全血DNA提取，-20 ℃保存，備用。

1.3 試劑與試劑盒 DNA marker，購自 TaKaRa 公司；2×EasyTaqPCR SuperMix，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA提取試劑盒，購自天根生化科技有限公司。

1.4 PCR引物的設(shè)計與合成 根據(jù)文獻[9-10]中馬泰勒蟲18S rRNA 基因序列與駑巴貝斯蟲BC48基因序列設(shè)計引物。PCR擴增體系：馬泰勒蟲：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min；馬駑巴貝斯蟲：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 產(chǎn)物的回收及序列測定 將PCR擴增結(jié)果為陽性的產(chǎn)物進行基因目的片段純化后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，利用BLAST在線軟件進行同源性分析。

2 結(jié)果

2.1 馬泰勒蟲18S rRNA 基因及馬駑巴貝斯蟲BC48 基因的PCR檢測 共采集到2 697份馬匹血液，分別進行馬泰勒蟲及馬駑巴貝斯蟲引物擴增后，共有246份馬血DNA擴增出馬泰勒蟲目的片段，約531 bp，大小符合預(yù)測值(圖1)；經(jīng)測序比對，確認(rèn)為馬泰勒蟲。共有271份馬血DNA擴增出馬駑巴貝斯蟲目的片段，約452 bp(圖2)；經(jīng)測序比對，確認(rèn)為馬駑巴貝斯蟲。

圖1 馬泰勒蟲PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of T. equiM：DNA marker 2 000； 1：陰性對照； 2：陽性對照； 3～9：樣品的PCR產(chǎn)物M：DNA marker 2 000； 1：Negative control； 2：Positive control； 3-9：PCR product of the sample

圖2 馬駑巴貝斯蟲PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of B. caballiM：DNA marker 2 000； 1～8：樣品的PCR產(chǎn)物； 9：陽性對照； 10：陰性對照M：DNA marker 2 000； 1-8：PCR product of the sample； 9：Positive control； 10：Negative control

2.2 馬泰勒蟲18S rRNA及馬駑巴貝斯蟲BC48基因序列分析 本試驗通過對結(jié)果進行馬泰勒蟲18S rRNA 及馬駑巴貝斯蟲BC48基因序列測序，BLAST進行相似性檢索，分別與馬泰勒蟲18S rRNA(531 bp)及馬駑巴貝斯蟲BC48(452 bp)基因序列(GenBank登錄號分別為：LC431546.1、MN629354.1)的核苷酸一致性為99%、99%，為所需目的片段。

2.3 馬梨形蟲感染情況分析 阿勒泰地區(qū)共計采集馬血2 697份，感染馬梨形蟲病樣品為504份，總感染率為18.69%；馬泰勒蟲感染246份，陽性率為9.12%，馬駑巴貝斯蟲感染271份，感染率為10.05%，其中，混合感染13份。哈巴河縣感染率最高，為30.80%；其他地區(qū)分別為富蘊縣17.86%、福?？h11.6%、清河縣19.10%。經(jīng)SPSS 20.0分析，各地間馬梨形蟲感染率差異顯著(P<0.05)，見表1。

表1 馬梨形蟲病感染情況調(diào)查Table 1 Investigation on the infection of equine piroplasmosis

2.4 不同年齡段馬感染梨形蟲病感染情況分析 通過分析不同年齡段感染馬梨形蟲病的結(jié)果顯示，馬泰勒蟲的感染數(shù)據(jù)中，X≥6年齡組感染率較高，為10.26%(90/877)，而馬駑巴貝斯蟲在2≤X<6年齡組感染率較高，為11.45%(105/917)，混合感染中，X<2 年齡組感染率最高，為0.66%(6/903)。各年齡組的總感染率分別為X<2年齡組15.50%(140/903)、2≤X< 6年齡組20.72%(190/917)、X≥6 年齡組19.84%(174/877)。經(jīng)SPSS 20.0分析，不同年齡段馬梨形蟲感染率差異顯著(P<0.05)，見表2。

表2 不同年齡段馬梨形蟲病感染情況調(diào)查Table 2 Investigation on the infection of equine piroplasmosis at different age stages

2.5 不同放牧季節(jié)馬梨形蟲病感染情況分析 通過分析不同季節(jié)感染馬梨形蟲病的結(jié)果顯示，馬泰勒蟲的春季與秋季感染分別為11.97%(191/1 595)、4.99%(55/1 102)，馬駑巴貝斯蟲的春季與秋季感染分別為13.73%(219/1 595)、4.72%(52/1 102)，春秋季總感染率分別為25.20%(402/1 595)、9.26%(102/1 102)，春季感染明顯高于秋季感染。經(jīng)SPSS 20.0分析，不同放牧季節(jié)馬梨形蟲感染率差異顯著(P<0.05)，見表3。

表3 不同放牧季節(jié)馬梨形蟲病感染情況調(diào)查Table 3 Investigation on the infection of equine piroplasmosis in different grazing seasons

3 討論

近年來，馬梨形蟲病的發(fā)病率不斷上升，嚴(yán)重阻礙了各地馬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前，常規(guī)的診斷技術(shù)主要包括臨床診斷和血涂片染色鏡檢、ELISA、LAMP及PCR等，不同方法的應(yīng)用可隨當(dāng)?shù)貤l件、樣品的采集等靈活改變[11-13]。其中，PCR方法具有高敏感性和強特異性，尤其適用一些臨床癥狀不明顯的隱性感染病例。因此，本次調(diào)查采用PCR方法對阿勒泰4個地區(qū)的放牧馬進行檢測，以期對該地區(qū)感染有初步的了解，為今后的防治工作提供一定的參考。

馬梨形蟲病各地區(qū)的發(fā)病略有不同，馬駑巴貝斯蟲的感染區(qū)域涵蓋了歐洲、南非及中東大陸地區(qū)的許多國家，在我國的感染率中吉林省為3.79%～42.4%，廣州市為5.4%，而新疆感染率為2.2%～38.7%[7，14-15]。有部分人認(rèn)為馬泰勒蟲的分布比駑巴貝斯蟲更為廣泛[16]。調(diào)查顯示，感染率不等，吉林省為12.50%、延邊市為26.09%、哈爾濱市為64.62%，新疆為8.33%～36.21%[17-18]。在本試驗中，通過對陽性樣品測序分析，經(jīng)BLAST比對，所測樣品為駑巴貝斯蟲及馬泰勒蟲感染。試驗得出馬梨形蟲病感染率為18.69%；其中，馬泰勒蟲感染率為9.12%，馬駑巴貝斯蟲感染率為10.05%，混合感染率為0.48%。不同年齡段馬梨形蟲感染情況差異顯著(P<0.05)，不同放牧季節(jié)馬梨形蟲感染率差異顯著(P<0.05)，春季感染明顯高于秋季感染。該病的傳播和流行具有顯著的季節(jié)性，可能和當(dāng)?shù)孛浇轵珙惖姆植济芮邢嚓P(guān)；阿勒泰地區(qū)地貌類型復(fù)雜多樣，草場豐富，使得當(dāng)?shù)伛R匹受到蜱蟲的侵害，尤其是春季溫度上升，蜱蟲活動頻繁，導(dǎo)致春季病情高發(fā)。所以，預(yù)防該病的重點是滅蜱，從根源上阻止梨形蟲病的傳播。