馮升來，馬穩(wěn)霞，趙云花，涂藝馨，楊彩云，令利軍，王 楠，陳學(xué)林

(西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

精油是從植物的果實(shí)、葉、花和根中提取的揮發(fā)性液體，屬于植物的次生代謝產(chǎn)物[1]。植物精油具有很強(qiáng)的抗菌[2]、抗氧化[3]和殺蟲[4]等活性，對(duì)果蔬中常見微生物有較強(qiáng)的殺菌效果，主要通過破壞微生物的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁來影響基因表達(dá)、細(xì)胞呼吸作用和能量代謝等途徑，進(jìn)而抑制病原菌生長(zhǎng)甚至導(dǎo)致其死亡[5]。植物精油常用于抗氧化、消炎抗菌、農(nóng)作物病蟲害防治和果蔬采后保鮮等領(lǐng)域[6-8]。研究發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地、采摘時(shí)間和處理方式獲得的植物精油，其成分及抗氧化和抗菌活性有明顯差異[9-11]。茵陳蒿(Artemisiacapillaris)屬菊科蒿屬植物，半灌木狀草本，為我國(guó)傳統(tǒng)中草藥[12]。目前對(duì)茵陳蒿精油的研究主要集中在其成分分析[13]、抑菌活性[14]等方面，而關(guān)于茵陳蒿精油抑菌作用機(jī)理的研究尚未見報(bào)道。為此，本研究采用水蒸汽蒸餾法提取茵陳蒿精油，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行分析，并測(cè)定茵陳蒿精油的抗氧化能力及對(duì)病原菌的抑菌活性，采用掃描電鏡觀察茵陳蒿精油對(duì)枯草芽孢桿菌和白色念珠菌細(xì)胞壁的影響，初步探究茵陳蒿精油抑菌作用機(jī)理，為蒿屬植物精油開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)材料 茵陳蒿植株于2018年9月采自甘肅蘭州西北師范大學(xué)(36°06′32.5″N， 103°44′03.62″E)，全株陰干后置于水蒸汽蒸餾系統(tǒng)中蒸餾2～3 h，收集提取物，用無水硫酸鈉干燥后于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

病原細(xì)菌：大腸桿菌(Escherichiacoli，ATCC 25922)、 破傷風(fēng)桿菌(Nicolaieri’sbacillus，ATCC 19406)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis，CMCC 63501)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，CMCC 26003)、 銅綠假單胞桿菌(Pseudomonasaeruginosa，CMCC 10104)和熒光假單胞桿菌(Pseudomonasfluorescence，ATCC 13525),均由西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院B518實(shí)驗(yàn)室提供。

病原真菌：白色念珠菌(Canidiaalbicans，ATCC 10231)、黃瓜灰霉病菌(Botrytiscinerea)、辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)、黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichumcapsici)、小麥赤霉病菌(Fusahumgraminearum)、馬鈴薯立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)，均由西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院B518實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 儀器與設(shè)備 生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ULTRA Plus掃描電子顯微鏡，德國(guó)；U2800紫外分光光度計(jì)，上海昂拉儀器有限公司；BSC-1300ⅡA2生物安全柜，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司； Multiskan FC 型酶標(biāo)儀，賽默飛世爾(上海)儀器有限公司。

1.2 茵陳蒿精油的化學(xué)成分分析

色譜柱：毛細(xì)管柱為HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；原爐溫度設(shè)定為60 ℃保持1 min，11 ℃/min升溫至90 ℃保持2 min，2 ℃/min升溫至95 ℃保持1 min， 18 ℃/min升溫至180 ℃保持2 min， 2 ℃/min升溫至185 ℃保持1 min，13 ℃/min升溫至225 ℃保持2 min， 2 ℃/min升溫至270 ℃保持1 min。噴射器溫度保持在270 ℃。將1 μL茵陳蒿精油樣品(用己烷稀釋至1%)以1∶20的分流比注入。載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min。在相同操作條件下,使用同系列正構(gòu)烷烴(C5-C36)計(jì)算保留指數(shù)(RI)。采用保留指數(shù)(RI)值，以及NIST05和Wiley275文庫(kù)鑒定其化學(xué)成分，通過平均GC-FID峰面積獲得精油各個(gè)成分的相對(duì)含量[15]。

質(zhì)譜參數(shù): 電子轟擊(E1)離子源70 eV；離子源溫度230 ℃；接口溫度270 ℃；掃描范圍30.00～500.00m/z；延遲時(shí)間3 min；程序時(shí)間35.33 min[16]。

1.3 茵陳蒿精油抗氧化活性測(cè)定

參考文獻(xiàn)[17]的方法，采用DPPH測(cè)定茵陳蒿精油的抗氧化活性。將50 μL 2.5，5，7.5，10，12.5和15 μL/mL的茵陳蒿精油與5 mL DPPH乙醇溶液(0.004%)混合，避光室溫放置30 min后，在517 nm處測(cè)定樣品的吸光值。以乙醇和DPPH溶液空白樣品作為陰性對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)3次。用下式計(jì)算DPPH的清除率(A)：

式中:A0為乙醇和DPPH溶液吸光值；A1為樣品溶液吸光值。

1.4 茵陳蒿精油抑菌活性測(cè)定

1.4.1 瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定抑菌圈直徑 取5 mL無菌LB液體培養(yǎng)基，加入100 μL菌懸液，放入搖床中培養(yǎng)24 h備用；使用無菌水沖洗病原菌孢子，收集備用。在無菌條件下，吸取菌懸液和病原菌孢子懸浮液各100 μL，均勻涂抹在LB和PDA培養(yǎng)基中，取直徑為6 mm濾紙片放置于含菌瓊脂平板中央，然后向?yàn)V紙片上滴加5 μL茵陳蒿精油，以無菌水作為對(duì)照，培養(yǎng)皿封口培養(yǎng)24 h后測(cè)量抑菌圈大小[18]。抑菌圈試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)為：抑菌圈直徑>13 mm，病原菌對(duì)精油敏感；抑菌圈直徑9～13 mm，病原菌對(duì)精油中度敏感；抑菌圈直徑6～9 mm，病原菌對(duì)精油低度敏感；抑菌圈直徑<6 mm，病原菌對(duì)精油不敏感。

1.4.2 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度值的測(cè)定 采用微量稀釋法[19]測(cè)定茵陳蒿精油的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)。將培養(yǎng)24 h新鮮活化的菌懸液，用無菌水稀釋至106CFU/mL備用。使用LB液體培養(yǎng)基制備茵陳蒿精油稀釋液320 μL/mL，在96微孔板上制備精油連續(xù)稀釋液，取100 μL菌懸液(106CFU/mL)加入精油稀釋液中，每個(gè)孔板中200 μL，將96微孔板置于37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察試驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)樣品均為細(xì)菌。以不添加精油的LB液體培養(yǎng)基為對(duì)照，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

參照MIC測(cè)定結(jié)果，首先觀察孔板中有無可見菌株生長(zhǎng)，將所有無菌株生長(zhǎng)對(duì)應(yīng)孔板中的菌株移至新鮮LB培養(yǎng)基中，在37 ℃下培養(yǎng)24 h，無菌株生長(zhǎng)孔板中精油濃度判定為MBC，重新生長(zhǎng)菌落的精油濃度為MIC。

1.4.3 毒力分析 采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定茵陳蒿精油對(duì)6種病原真菌的毒力。取培養(yǎng)7 d后直徑為6 mm的病原菌菌餅接種于新鮮PDA培養(yǎng)基上，用1%土溫-80將茵陳蒿精油稀釋成5個(gè)濃度梯度(1.25，2.50，5.0，10.0，20.0 μL/mL)滴加至6 mm濾紙片上，以無菌水為對(duì)照，放置28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,計(jì)算抑制率，通過SPSS分析計(jì)算毒力回歸方程(y=ax+b)、相關(guān)系數(shù)、95%置信區(qū)間和EC50，以EC50表示茵陳蒿精油對(duì)病原真菌菌絲生長(zhǎng)抑制作用強(qiáng)弱[20]。

抑制率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑)×100%。

1.5 茵陳蒿精油對(duì)菌體細(xì)胞壁影響的電鏡觀察

參考Diao等[21]的電鏡樣品制備方法并稍作修改：離心收集活化菌種，用0.2 mol/L PBS(pH 7.2)重懸，再用茵陳蒿精油的MIC、MBC值相對(duì)應(yīng)的濃度處理細(xì)菌3～4 h，對(duì)照組為等量的無菌水處理，用2.5%戊二醛固定2～4 h，PBS清洗3次后用乙醇梯度脫水，脫水后的菌體置于錫箔紙上鍍金進(jìn)行鏡檢。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的顯著性差異檢驗(yàn)和方差分析，采用Origin 9.6作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 茵陳蒿精油的化學(xué)成分

茵陳蒿精油的化學(xué)成分見表1。由表1可知，茵陳蒿精油共分離鑒定出24種化合物，其中烯類化合物種類最多，其次是醇類化合物。精油主要化學(xué)成分為蒿酮(37.59%)、乙酸丁酯(22.75%)和桉葉油醇(11.34%)，酯類、醇類、烯類和酮類化合物分別占23.51%,17.49%,16.59%和40.81%，可見精油中主要成分是酮類化合物。

表1 茵陳蒿精油的化學(xué)成分Table 1 Chemical composition of essential oil from Artemisia capillaris

2.2 茵陳蒿精油的抗氧化活性

由圖1可以看出，茵陳蒿精油對(duì)DPPH自由基清除能力較強(qiáng)，且隨著茵陳蒿精油濃度的增大，DPPH自由基清除能力越顯著，抗氧化能力越強(qiáng)。當(dāng)茵陳蒿精油濃度為15 μL/mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到90%以上；當(dāng)茵陳蒿精油濃度為2.5 μL/mL時(shí)，DPPH自由基清除率在50%以上。

圖1 茵陳蒿精油對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.1 Scavenging effect of essential oil from Artemisia capillaris on DPPH radical

2.3 茵陳蒿精油的抑菌活性

2.3.1 茵陳蒿精油對(duì)病原菌的抑菌效果 茵陳蒿精油對(duì)供試病原菌的抑菌效果見表2。由表2可知，茵陳蒿精油對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、馬鈴薯立枯絲核菌、小麥赤霉病菌、黃瓜枯萎病菌、辣椒炭疽病菌敏感；對(duì)大腸桿菌、破傷風(fēng)桿菌、辣椒疫霉病菌、黃瓜灰霉病菌中度敏感；對(duì)銅綠假單胞桿菌、熒光假單胞桿菌不敏感。因此茵陳蒿精油具有良好的抑菌效果。

表2 茵陳蒿精油對(duì)病原菌的抑菌效果Table 2 Bacteriostatic effect of essential oil from Artemisia capillaris on pathogenic bacteria

2.3.2 茵陳蒿精油對(duì)病原細(xì)菌的MIC和MBC 茵陳蒿精油對(duì)病原細(xì)菌的MIC、MBC結(jié)果見表3。由表3可知，茵陳蒿精油對(duì)白色念珠菌和枯草芽孢桿菌有最小的抑菌濃度，MIC均為2.5 μL/mL；對(duì)枯草芽孢桿菌有最小殺菌濃度，MBC為5 μL/mL。對(duì)大腸桿菌有最大的殺菌濃度，為150 μL/mL。說明茵陳蒿精油對(duì)枯草芽孢桿菌具有較好的抑制作用，對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞桿菌和熒光假單胞桿菌抑菌效果較差。

表3 茵陳蒿精油對(duì)供試病原細(xì)菌的MIC和MBCTable 3 MIC and MBC of essential oil from Artemisia capillaris on tested pathogenic bacteria

2.3.3 茵陳蒿精油對(duì)病原真菌的毒力測(cè)定結(jié)果 由于精油濃度及方法的不同，精油對(duì)菌絲和孢子萌發(fā)的抑制效果有所差異。由表4可知，茵陳蒿精油對(duì)小麥赤霉病菌、黃瓜灰霉病菌、辣椒炭疽病菌、辣椒疫霉病菌、黃瓜枯萎病菌、馬鈴薯立枯絲核菌的EC50差異顯著，其中小麥赤霉病菌和黃瓜枯萎病菌對(duì)精油最為敏感，EC50分別是3.371和5.898 μL/mL；毒力效果最小的是黃瓜灰霉病菌，EC50為10.942μL/mL；對(duì)辣椒炭疽病菌、辣椒疫霉病菌的毒力敏感度相近，EC50分別為8.090和8.241 μL/mL?？梢娨痍愝锞涂捎糜谛←湷嗝共【忘S瓜枯萎病菌的防治，對(duì)黃瓜灰霉病菌防治效果較差。

表4 茵陳蒿精油對(duì)病原真菌的毒力測(cè)定結(jié)果Table 4 Toxicity of essential oil from Artemisia capillaris to pathogenic fungi

2.4 茵陳蒿精油對(duì)病原菌菌體細(xì)胞壁的影響

根據(jù)以上茵陳蒿精油抑菌活性測(cè)定結(jié)果可知，茵陳蒿精油對(duì)枯草芽孢桿菌和白色念珠菌的抑菌活性明顯，因此選用枯草芽孢桿菌和白色念珠菌作為代表菌株，用掃描電鏡(SEM)觀察茵陳蒿精油對(duì)2株菌體細(xì)胞壁的影響。

2.4.1 對(duì)枯草芽孢桿菌細(xì)胞壁的影響 茵陳蒿精油對(duì)枯草芽孢桿菌細(xì)胞壁的影響見圖2。對(duì)照枯草芽孢桿菌菌體形態(tài)呈典型桿棒狀，菌體完整，無菌體內(nèi)容物外滲 (圖2-A)；用MIC和MBC值對(duì)應(yīng)的精油濃度分別處理枯草芽孢桿菌4 h后，枯草芽孢桿菌細(xì)胞表面出現(xiàn)大量褶皺，表面粗糙，細(xì)胞壁不完整，內(nèi)容物滲出，通透性增強(qiáng)，菌體破碎(圖2-B-C)。茵陳蒿精油濃度越大，對(duì)枯草芽孢桿菌菌體細(xì)胞的破壞力越強(qiáng)，用茵陳蒿精油處理枯草芽孢桿菌時(shí)，可能會(huì)使其菌體細(xì)胞壁上產(chǎn)生孔洞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物滲出，影響菌體基因表達(dá)、能量代謝等途徑，從而導(dǎo)致枯草芽孢桿菌細(xì)胞衰竭(圖2-B-C)。

A.對(duì)照；B.MIC值對(duì)應(yīng)精油處理；C.MBC值對(duì)應(yīng)精油處理A.Control;B.MIC essential oil treatment;C.MBC essential oil treatment 圖2 茵陳蒿精油對(duì)枯草芽孢桿菌細(xì)胞壁的影響(×(119.07×103))Fig.2 Effect of essential oil from Artemisia capillaris on cell wall of Bacillus subtilis (×(119.07×103))

2.4.2 對(duì)白色念珠菌細(xì)胞壁的影響 茵陳蒿精油對(duì)白色念珠菌細(xì)胞壁的影響見圖3。對(duì)照白色念珠菌菌體呈典型的圓球狀，表面光潔平整，菌體完整，無菌體內(nèi)容物外滲(圖3-A)。用MIC和MBC值對(duì)應(yīng)的精油濃度處理白色念珠菌4 h后，白色念珠菌表面出現(xiàn)褶皺，細(xì)胞壁不完整，內(nèi)容物滲出，菌體破裂；精油濃度越大，對(duì)白色念珠菌菌體的影響越大。用茵陳蒿精油處理白色念珠菌時(shí)，會(huì)導(dǎo)致白色念珠菌菌體細(xì)胞壁上形成孔洞，其細(xì)胞內(nèi)容物質(zhì)滲出，從而使白色念珠菌菌株死亡。

3 討 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，從茵陳蒿精油中分離鑒定的化合物有24種，占精油總量的100%，其主要物質(zhì)為蒿酮(37.59%)、乙酸丁酯(22.75%)和桉葉油醇(11.34%)。周宇杰[22]研究發(fā)現(xiàn)，茵陳蒿精油中化合物成分主要為倍半萜和單萜兩大類，這與本試驗(yàn)結(jié)果相吻合；趙娜娜等[23]研究發(fā)現(xiàn)，從茵陳蒿植株中提取的主要物質(zhì)為大根香葉烯D(16.16%)、氧化石竹烯(10.42%)、石竹烯(8.70%)、α-畢橙茄醇(7.03%)、依蘭油醇(4.83%)5種，占已鑒定出化學(xué)成分的47.14%；楊書斌等[24]研究表明,不同時(shí)期茵陳蒿花蕾的主要成分為茵陳二炔(31.4%)、β-石竹萜烯(21.64%)、β-香葉烯(8.84%)、d-檸檬烯(6.03%)和少量單萜烯類化合物，這與本研究提取的茵陳蒿精油主要成分有較大差異。這可能是受到茵陳蒿的產(chǎn)地[25]、部位[26]、季節(jié)不同，導(dǎo)致其化學(xué)組成有差異。茵陳蒿精油相對(duì)于當(dāng)歸、迷迭香、丁香、艾葉[24]等植物精油具有良好的抗氧化活性。

曾琳等[27]研究表明，粗榧精油對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC為0.6～0.8 mg/mL；艾蒿精油對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC為5 μL/mL[28]。本研究結(jié)果表明，茵陳蒿精油對(duì)白色念珠菌和枯草芽孢桿菌的MIC和MBC值均較小，說明這2種菌體對(duì)茵陳蒿精油較其他菌株敏感。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，茵陳蒿精油可使這2種菌體細(xì)胞壁和孢子皺縮，從而導(dǎo)致細(xì)胞壁通透性增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)容物滲出，而且精油濃度越大，對(duì)菌體細(xì)胞壁破壞越強(qiáng)，甚至?xí)l(fā)生自身溶解跡象[29]。