楊洪高，馬 杰*，李 明，譚紹英，黃軍海*

（1. 上海理工大學(xué)，上海 200093；2. 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院 創(chuàng)新藥物與制藥工藝國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203）

線粒體是雙膜結(jié)合的亞細(xì)胞器，是細(xì)胞主要能量來源，在細(xì)胞生命過程中發(fā)揮重要作用。線粒體內(nèi)活性小分子（活性氧、硫、氮等）作為信號(hào)載體參與線粒體內(nèi)生物化學(xué)反應(yīng)，其濃度和時(shí)空分布能夠影響細(xì)胞乃至整個(gè)生命體性狀表現(xiàn)。因此，開展線粒體內(nèi)活性小分子的相關(guān)研究對(duì)揭示生命體活動(dòng)規(guī)律起著至關(guān)重要的作用。熒光探針與傳統(tǒng)方法（比色法、氣相色譜法等）相比具有時(shí)空分辨率高、可操作性強(qiáng)、選擇性高、成本低等顯著優(yōu)勢(shì)[1]，現(xiàn)已成為檢測(cè)線粒體內(nèi)各種相關(guān)活性物質(zhì)及其實(shí)時(shí)變化的重要手段之一。

通過結(jié)合靶向基團(tuán)設(shè)計(jì)了一系列靶向線粒體的熒光探針，目前，靶向基團(tuán)主要有三苯基磷（TPP）和季銨鹽陽離子兩種，兩者在線粒體膜電勢(shì)（150～180 mV）的驅(qū)動(dòng)下精準(zhǔn)進(jìn)入線粒體內(nèi)，但是，有機(jī)磷小分子具有良好的水溶性和生物相容性[2]，因此，基于TPP的線粒體靶向熒光探針的細(xì)胞通透性更好，選擇性更高，整體檢測(cè)性能更佳，成為了靶向線粒體熒光探針領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

本文為更好的認(rèn)識(shí)線粒體在細(xì)胞生命過程中扮演的角色，將根據(jù)線粒體中所檢測(cè)的活性物種類進(jìn)行梳理，重點(diǎn)分析了該類熒光探針的優(yōu)缺點(diǎn)，并提出總結(jié)與展望。

1 檢測(cè)活性氧的熒光檢測(cè)探針

活性氧（ROS）主要產(chǎn)生于細(xì)胞線粒體中，用于維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，并參與細(xì)胞內(nèi)各種生理代謝過程。異常含量的ROS將會(huì)引發(fā)各種疾病，準(zhǔn)確檢測(cè)線粒體中的ROS時(shí)空變化具有重要意義。線粒體內(nèi)ROS具有多樣性（如ClO-、H2O2、O2?-、NO等）、不穩(wěn)定性和高活性等特征，小分子熒光探針在某種程度上能有效克服上述困難，是檢測(cè)該類ROS的有力手段之一。

1.1 檢測(cè)ClO-的熒光檢測(cè)探針

ClO-是重要的活性氧之一，在線粒體中，由過氧化物酶催化氯離子和過氧化氫反應(yīng)產(chǎn)生[3]，在多種生理和病理過程中起著重要作用。因此，維持ClO-正常水平是維系細(xì)胞功能的必要條件，一旦超出正常濃度范圍就會(huì)引發(fā)各種疾病。

2014至2019 年，Yu和Zhang團(tuán)隊(duì)以羅丹明為母核，以TTP作為線粒體定位基團(tuán)分別合成熒光探針1、2、3、4。探針1[4]具有高選擇性和快速響應(yīng)，但其細(xì)胞毒性相對(duì)較大，限制了其生物應(yīng)用。探針2[5]與探針1相比，在生物體內(nèi)基本不受背景熒光影響，且具有較大的斯托克位移，熒光性能更佳。探針3[6]引入生物素作為腫瘤特異性基團(tuán)，具有良好的細(xì)胞膜通透性、線粒體實(shí)時(shí)傳感與成像、腫瘤細(xì)胞特異選擇性，具有較好應(yīng)用潛力。探針4[7]具有較大的雙光子（TP）截面（267 GM）和近紅外發(fā)射光譜，表現(xiàn)出優(yōu)異的低自熒光、光穩(wěn)定性、深部組織穿透（230 mm）等特性。2015年，Ma團(tuán)隊(duì)基于羅丹明硫內(nèi)酯構(gòu)建熒光探針5[8]，硫原子鎖定的螺環(huán)結(jié)構(gòu)開環(huán)后，生成共軛系統(tǒng)，熒光發(fā)射增強(qiáng)、響應(yīng)時(shí)間短、檢測(cè)限低，成功應(yīng)用于巨噬細(xì)胞中ClO-的檢測(cè)，具有實(shí)際應(yīng)用潛力。

2013年，Peng團(tuán)隊(duì)以肟為響應(yīng)基團(tuán)合成熒光探針6[9]，獨(dú)特的異構(gòu)化結(jié)構(gòu)（C=N）作為熒光探針開關(guān)，該探針在數(shù)十秒內(nèi)可實(shí)現(xiàn)對(duì)ClO-響應(yīng)，在實(shí)時(shí)檢測(cè)方面具有較好的應(yīng)用前景。2015、2018年，Wang和Hua團(tuán)隊(duì)分別合成比率型熒光探針7[10]、8[11]，探針7是第一個(gè)檢測(cè)線粒體中ClO-的比率型熒光探針，其共軛結(jié)構(gòu)減少而發(fā)生藍(lán)移，成功應(yīng)用于活體老鼠內(nèi)源性ClO-的檢測(cè)（圖2），探針8引入烷基鏈等特殊結(jié)構(gòu)，其溶解度和水溶性有所提高，在檢測(cè)過程中，探針7、8均具有較大的斯托克位移和肉眼可見的熒光變化。

圖2 探針6、8的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，及探針7的識(shí)別機(jī)理和裸鼠熒光圖像，探針7注射濃度（50 μL×20 μmol /L），分別孵育0、5、10、15、20、30、45和60 min所得圖像[7]

2015、2016年，Chang和Kin團(tuán)隊(duì)分別合成TP熒光探針9[12]、10[13]。探針9是首個(gè)靶向線粒體ClO-的TP熒光探針，存在一個(gè)典型的“推拉”（胺酮）結(jié)構(gòu)，具有優(yōu)異的光物理特性，在500 nm處的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)約670倍，成功應(yīng)用于發(fā)炎小鼠模型中的巨噬細(xì)胞，在炎癥組織中能夠觀察到巨噬細(xì)胞中探針9發(fā)出較強(qiáng)的綠色熒光，通過巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD11b對(duì)組織切片進(jìn)行免疫染色進(jìn)一步證實(shí)（紅色）。探針10以咪唑啉-2-硫酮為ClO-響應(yīng)位點(diǎn)，響應(yīng)后的產(chǎn)物具有很好的水溶性和穩(wěn)定性，在HeLa細(xì)胞的共染色實(shí)驗(yàn)中顯示出較大的皮爾遜共定位系數(shù)（0.83）。2019年，Wang團(tuán)隊(duì)以香豆素為骨架合成熒光探針11[12]，C-O鍵作為ClO-的識(shí)別受體，表現(xiàn)出優(yōu)異的熒光性能。

圖3 探針9～11的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1.2 檢測(cè)H2O2的熒光檢測(cè)探針

過氧化氫（H2O2）是氧代謝的重要產(chǎn)物，主要產(chǎn)生于線粒體中，與人類許多疾病密切相關(guān)[13-15]，與細(xì)胞存活、生長、分化和維持息息相關(guān)[18-19]。

芳基硼酸鹽是典型的H2O2響應(yīng)基團(tuán)，與H2O2高特異性反應(yīng)生成苯酚，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)線粒體內(nèi)H2O2的檢測(cè)。2012年，Kim團(tuán)隊(duì)合成第一個(gè)靶向線粒體H2O2的比率型熒光探針12[20]，硼酸酯裂解可引發(fā)氨基甲酸酯鍵的裂解，從而釋放出更多的電子富集體，并伴隨明顯的藍(lán)黃色熒光發(fā)射，能夠在不受其它相關(guān)物干擾的情況下對(duì)活細(xì)胞和活組織中線粒體H2O2實(shí)時(shí)成像（圖4），但其響應(yīng)時(shí)間過長。

圖4 探針12的識(shí)別機(jī)理及細(xì)胞熒光成像，（a）探針12的TMP線粒體熒光成像，（b）線粒體紅色熒光染料的 OPM熒光成像，（c）共定位熒光成像[18]

2016年，Li團(tuán)隊(duì)以咔唑?yàn)槟阁w合成熒光探針13[21]，在深度為105 μm處，可長時(shí)間檢測(cè)活細(xì)胞和組織中H2O2，成像質(zhì)量極佳。2018年，Dai團(tuán)隊(duì)以萘酰亞胺為母體合成熒光探針14[22]，在543 nm處有強(qiáng)烈的熒光發(fā)射，具有較好的水溶性和低細(xì)胞毒性，有望實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞中H2O2的檢測(cè)。2019年，Zhao團(tuán)隊(duì)基于雙淬滅概念合成熒光探針15[23]，芳基硼酸鹽驅(qū)動(dòng)內(nèi)酰胺的形成，同時(shí)，鄰位猝滅劑的引入使得能量從熒光團(tuán)轉(zhuǎn)移到猝滅劑，實(shí)現(xiàn)對(duì)熒光基團(tuán)雙淬滅，在H2O2存在的條件下，內(nèi)酰胺環(huán)打開，淬滅劑釋放，熒光基團(tuán)重新發(fā)出強(qiáng)烈的熒光，該探針成功應(yīng)用于癌細(xì)胞線粒體中H2O2的檢測(cè)，為熒光探針設(shè)計(jì)提供一種新的思路。

圖5 探針13～15的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1.3 檢測(cè)O2?-的熒光檢測(cè)探針

在線粒體環(huán)境中，超氧陰離子（O2?-）會(huì)迅速轉(zhuǎn)化為H2O2，進(jìn)而形成其它的ROS，其濃度可以從側(cè)面反映ROS水平[24]。Tang團(tuán)隊(duì)合成了TP熒光探針16[25]、17[26]，探針16是第一個(gè)檢測(cè)O2?-的TP反應(yīng)型熒光探針，與O2?-發(fā)生脫氫反應(yīng)后，其共軛體系延長，放出較強(qiáng)熒光，成功應(yīng)用于小鼠體內(nèi)O2?-的檢測(cè)，并且該探針具有良好的光穩(wěn)定性（圖6）。探針17是一種可逆TP熒光探針，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)能夠同時(shí)對(duì)O2?-和pH響應(yīng)，且有高的時(shí)間分辨率和較小的背景熒光干擾。2016年，Zhang團(tuán)隊(duì)以萘酰亞胺為母體合成熒光探針18[27]，9-甲基蒽作為熒光淬滅劑和O2?-捕獲劑，該探針首次成功應(yīng)用于光動(dòng)力治療（PDT）過程中活細(xì)胞和組織中O2?-的熒光成像，有望成為研究線粒體PDT過程中O2?-生成的有力工具。

圖6 探針16的識(shí)別機(jī)理和光穩(wěn)定熒光成像[23]，及探針17、18的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1.4 檢測(cè)NO的熒光檢測(cè)探針

一氧化氮（NO）是一種信使分子，在各種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用，內(nèi)源性NO在心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等生理系統(tǒng)中介導(dǎo)多種生理過程[28]，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)線粒體中NO對(duì)化學(xué)、生物學(xué)研究具有重要意義。

2013年，Jin團(tuán)隊(duì)研制出第一個(gè)靶向線粒體中NO的“off-on”型熒光探針19[29]，該探針的響應(yīng)與NO促使鄰苯二胺氧化有關(guān)，檢測(cè)過程中出現(xiàn)肉眼可見的強(qiáng)烈洋紅色熒光，且在10 nm至50 nm范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)，該探針成功應(yīng)用于人乳腺癌MCF-7細(xì)胞線粒體中NO的成像（圖7）。2017年，He團(tuán)隊(duì)引入NO識(shí)別基團(tuán)二氫吡啶合成熒光探針20[30]，用于檢測(cè)活細(xì)胞、組織和生物體內(nèi)線粒體NO的變化，該探針不受其它活性氧、氮的干擾，有望成為評(píng)價(jià)生物內(nèi)NO水平的有效工具。

圖7 探針19的識(shí)別機(jī)理和線粒體共定位熒光成像[27]，及探針20的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2 檢測(cè)還原性物質(zhì)的熒光檢測(cè)探針

在線粒體中，存在另一種與ROS同等重要的物質(zhì)―平衡ROS的還原性物質(zhì)（H2S、硫醇、SCN-、谷胱甘肽等）。為了更好的了解線粒體內(nèi)氧化還原過程，還原性小分子熒光探針的研究具有同等重要的意義。

2.1 檢測(cè)H2S的熒光檢測(cè)探針

硫化氫（H2S）作為公認(rèn)的第三類內(nèi)源性氣體傳遞物質(zhì)，在生物系統(tǒng)中具有不可替代的作用。2013年，Kim團(tuán)隊(duì)合成第一個(gè)檢測(cè)線粒體H2S的含磷TP熒光探針21[31]，該探針以疊氮基為響應(yīng)位點(diǎn)，在H2S存在下，該探針熒光發(fā)生紅移（圖8a），且容易進(jìn)入細(xì)胞，受其它活性物質(zhì)（活性硫、氧、氮）的干擾較小，可用于測(cè)量DJ-1缺陷型星形膠質(zhì)細(xì)胞和腦切片中內(nèi)源性H2S水平（圖8b）。

圖8 探針21的識(shí)別機(jī)理和熒光成像，（a）熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化（1 mol/L探針21與100 mol/L Na2S作用），（b）切片后培養(yǎng)7天，以穩(wěn)定切片應(yīng)力對(duì)組織的影響，測(cè)量H2S的產(chǎn)生[29]

2016年，Lee團(tuán)隊(duì)以7-硝基-1,2,3-苯并惡唑（NBD）胺作為H2S響應(yīng)基團(tuán)合成熒光探針22[32]，H2S誘導(dǎo)NBD胺鍵硫解后可獲得顯著的熒光off-on，成功用于細(xì)胞內(nèi)成像，可進(jìn)一步用于研究生命系統(tǒng)中H2S的生物學(xué)功能和病理作用。2017年，Hua團(tuán)隊(duì)以苝（NP）為熒光基團(tuán)，硝基為反應(yīng)位點(diǎn)合成熒光探針23[33]，柔性烷基鏈和大分子基團(tuán)的引入，有效地提高該探針的溶解度、選擇性和穩(wěn)定性，使其更易應(yīng)用于生物體系的檢測(cè)。2018年，Kim團(tuán)隊(duì)報(bào)道了TP比率熒光探針24[34]，芳基硫代酯具有較高的電子親核性，在H2S存在的條件下，氨基甲酸酯連接基團(tuán)被移除，內(nèi)部電荷轉(zhuǎn)移（ICT）的抑制被解除，熒光由綠轉(zhuǎn)黃，發(fā)生紅移。同年，Min團(tuán)隊(duì)基于受激拉曼散射成像技術(shù)合成熒光探針25[35]，以疊氮化單元作為反應(yīng)位點(diǎn)，可通過SRS顯微鏡觀察活細(xì)胞中的H2S，具有很好的響應(yīng)，這種方法具有普遍應(yīng)用于生物系統(tǒng)中其它重要生物分子檢測(cè)的潛力，此外，未來有望實(shí)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)不同小分子物質(zhì)的超多路傳感。

圖9 探針22～25的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2.2 檢測(cè)RSH的熒光檢測(cè)探針

為了解硫醇（RSH）在生物學(xué)中的作用，在組織和有機(jī)體水平上監(jiān)測(cè)RSH是至關(guān)重要的。2011年，Cho團(tuán)隊(duì)合成第一個(gè)檢測(cè)RSH含磷的TP比值熒光探針26[36]，該探針在生物系統(tǒng)內(nèi)對(duì)pH不敏感，具有顯著的雙光子截面，熒光變化明顯（藍(lán)轉(zhuǎn)黃），可在90～190 μm深度的細(xì)胞組織中實(shí)現(xiàn)線粒體中RSH水平可視化（圖10）。

圖1 探針1～5的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

圖10 探針26的識(shí)別機(jī)理和小鼠海馬切片的熒光成像，（a和d）以CA1、CA3為亮場的明場圖像，（b和e）為 用NEM處理前后的TMP圖像，（c和f）為（b）和（e）中紅色框的放大圖像，深度為120 mm[34]

2012年，Kim團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)合成熒光探針27[37]，該探針以二硫鍵作為硫醇還蛋白的識(shí)別基團(tuán)，當(dāng)與硫醇還蛋白作用后，發(fā)射出強(qiáng)烈的綠色熒光（λem＝540 nm），檢測(cè)限可達(dá) 50 nmol/L。2013年，Ahn團(tuán)隊(duì)合成熒光探針28[38]，該探針由硫醇介導(dǎo)芳基磺酰疊氮化物向磺胺類物質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而實(shí)現(xiàn)熒光的發(fā)射，可應(yīng)用于檢測(cè)所有生物硫醇。

圖11 探針27、28的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

表1 線粒體熒光探針的性能

3 總結(jié)與展望

小分子靶向線粒體熒光探針在近十年取得長足的進(jìn)展，是傳統(tǒng)檢測(cè)手段的有益補(bǔ)充。含磷有機(jī)小分子熒光探針雖然應(yīng)用廣泛，但也存在諸多不足，首先，其穩(wěn)定性有待提高，有機(jī)磷容易被氧化，熒光探針容易被生物體內(nèi)的活性氧淬滅，其次，對(duì)于靶向線粒體的熒光探針通常依賴于線粒體膜電勢(shì)，攜帶正電荷的TPP基團(tuán)進(jìn)入勢(shì)必會(huì)影響正常的電勢(shì)差，最終一定程度上會(huì)影響線粒體的正常生物學(xué)功能。因此開發(fā)電中性線粒體熒光探針具有重要意義。