徐 甲，尤 昆，尹春燕

（江蘇正大清江制藥有限公司，江蘇 南京210033）

艾拉莫德在合成過程中使用了甲醇、乙醇、異丙醇和鹽酸，有可能產(chǎn)生氯甲烷、氯乙烷和2-氯丙烷這類潛在基因毒雜質(zhì)。根據(jù)已有臨床前研究發(fā)現(xiàn)這類雜質(zhì)的DNA烷基化作用會(huì)導(dǎo)致誘變效應(yīng)、致癌效應(yīng)和致畸效應(yīng)，參考ICH M7，按照TTC法計(jì)算。按照ICH規(guī)定連續(xù)服用10年，則該類雜質(zhì)的人體攝入量每人每天不能超過10 μg/天，艾拉莫德最大日服用量為50 mg，計(jì)算可知，艾拉莫德原料藥中的氯甲烷、氯乙烷和2-氯丙烷限度不得超過200 ppm。

目前關(guān)于艾拉莫德含量和有關(guān)物質(zhì)已有報(bào)道，但未見艾拉莫德中氯甲烷、氯乙烷、2-氯丙烷的相關(guān)研究。在現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道中，氯甲烷和氯乙烷的研究文獻(xiàn)較多，2-氯丙烷研究的文獻(xiàn)較少，未見氯甲烷、氯乙烷、2-氯丙烷同時(shí)檢出的研究報(bào)道。

本文建立了氣相色譜檢測(cè)本品中潛在基因毒雜質(zhì)的方法，并進(jìn)行了相應(yīng)的方法學(xué)驗(yàn)證，該方法簡(jiǎn)便快速，可為艾拉莫德的質(zhì)量?jī)?yōu)化提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器與試藥

Agilent 7890B氣相色譜儀（帶7697A頂空進(jìn)樣器）；梅特勒電子天平XS205R。

氯甲烷購(gòu)自梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司（批號(hào)：2RYZE-MO，純度5.7%）；氯乙烷購(gòu)自梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司（批號(hào)：MZYGG-CE，純度15%）；2-氯丙烷購(gòu)自阿達(dá)瑪斯試劑有限公司（批號(hào)：P12220-80，純度99%）；二甲基亞砜購(gòu)自Scharlau（GC級(jí)）；艾拉莫德原料由江蘇正大清江制藥有限公司提供。

1.2 色譜條件

以6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷為固定液的毛細(xì)管柱為色譜柱[如DB-624（30 m×0.32 mm×1.8 μm）或性能與之相當(dāng)?shù)纳V柱]；升溫程序：初始50℃，維持2 min，以20℃/min升至180℃，維持5 min；進(jìn)樣口溫度：200℃；分流比：10∶1；FID檢測(cè)器；檢測(cè)器溫度：200℃；載氣：高純氮?dú)?；恒流模式?.0 mL/min；頂空瓶平衡溫度：80℃；頂空瓶平衡時(shí)間：30 min；進(jìn)樣體積：1 mL；外標(biāo)法定量。

1.3 溶液制備

1.3.1 空白溶液

二甲基亞砜。

1.3.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液

分別取氯甲烷、氯乙烷、2-氯丙烷各適量，精密稱定，用DMSO溶解并稀釋至刻度，作為儲(chǔ)備液 （C＝0.4 mg/mL）。

1.3.3 對(duì)照品溶液

精密量取上述貯備液各5 mL，同置于100 mL量瓶中，加二甲基亞砜稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液。（C＝20 μg/mL）。

1.3.4 供試品溶液

取樣品適量（約0.5 g），精密稱定，置頂空瓶中，加5 mL DMSO，密封瓶口，加熱使溶解，搖勻，作為供試品溶液。

1.3.5 供試品（加標(biāo)）溶液

取樣品適量（約0.5 g），精密稱定，置頂空瓶中，加5 mL對(duì)照品溶液，密封瓶口，加熱使溶解，搖勻，作為供試品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶劑和濃度的選擇

氯甲烷、氯乙烷、2-氯丙烷在甲醇、乙腈和DMSO中可溶，在水中幾乎不溶，而艾拉莫德在DMSO中溶解度較好，故選擇DMSO作為溶劑。按照ICH規(guī)定連續(xù)服用10年，則該類雜質(zhì)的人體攝入量每人每天不能超過10 μg/天，艾拉莫德最大日服用量為50 mg，計(jì)算可知，艾拉莫德原料藥中的氯甲烷、氯乙烷和2-氯丙烷限度不得超過200 ppm。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)樣品濃度為0.1 g/mL時(shí)，響應(yīng)較好。

2.2 色譜條件的選擇

根據(jù)氯甲烷、氯乙烷、2-氯丙烷的性質(zhì)，本試驗(yàn)采用常用的中等極性分析柱DB-624色譜柱（固定相為6%氰丙基苯-94%二甲基硅氧烷），最高使用溫度可達(dá)300℃，具有極低的柱流失。通過不同流速（1.0、2.0、3.0 mL/min）考察，確定了流速為每分鐘1.0 mL；通過對(duì)起始柱溫（35、40、45℃）考察，確認(rèn)了起始柱溫為40℃，采用程序升溫；考察了不同的頂空平衡溫度及平衡時(shí)間，最終確定了色譜條件。試驗(yàn)結(jié)果表明各目標(biāo)分析物的峰形尖銳，分離度較好。具體見圖1。

圖1 對(duì)照品溶液

2.3 專屬性

分別按“1.3”配制專屬性-空白溶劑（DMSO）、專屬性-對(duì)照品溶液（20 μg/mL）、專屬性-供試品溶液、專屬性-供試品（加標(biāo)）溶液。按“1.2”項(xiàng)下分析方法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示溶劑DMSO和供試品溶液不影響氯甲烷、氯乙烷、2-氯丙烷的檢測(cè)；該方法專屬性良好。

2.4 檢測(cè)限及定量限

取“1.3.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋，根據(jù)信噪比S/N＝3計(jì)算檢出限；根據(jù)信噪比S/N＝10計(jì)算定量限；按“1.2”項(xiàng)下分析方法測(cè)定，測(cè)得氯甲烷的定量限濃度為2 μg/kg；氯乙烷的定量限濃度為2 μg/kg；2-氯丙烷的定量限濃度為2 μg/kg；氯甲烷的檢出限為0.67 μg/kg；氯乙烷的檢出限為0.5 μg/kg；2-氯丙烷的檢出限為0.67 μg/kg；表明本方法的靈敏度較好。

2.5 線性試驗(yàn)

取“1.3.2”項(xiàng)下的氯甲烷、氯乙烷、2-氯丙烷對(duì)照品儲(chǔ)備液稀釋制成每1 mL約含氯甲烷、氯乙烷、2-氯丙烷5、10、16、20、24、30、40 μg的溶液，照上述“1.2”分析方法分別測(cè)定。以待測(cè)物濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，待測(cè)物峰面積為縱坐標(biāo)，按最小二乘法進(jìn)行線性回歸。得到氯甲烷在5～39.97 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，y＝0.138 4x＋0.026 0；（r＝0.999 1，n＝7）；氯乙烷在5.04～40.33 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好；y＝0.162 3x－0.000 3（r＝0.999 2，n＝7）；2-氯丙烷在5.11～40.88 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好；y＝0.189 1x－0.028 3（r＝0.999 2，n＝7）；表明各溶劑在5～40 μg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

按“1.3”項(xiàng)下制備對(duì)照品溶液、供試品溶液和供試品（加標(biāo)）溶液，供試品（加標(biāo)）溶液制備6份。按“1.2”分析方法測(cè)定，結(jié)果6份供試品溶液中氯甲烷、氯乙烷和2-氯丙烷回收率的RSD分別為1.8%、1.7%和1.9%，表明本測(cè)定方法的重復(fù)性良好。

2.7 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

按照“1.3.5”分別配制含各溶劑80%、100%、120%的供試品（加標(biāo)）溶液，各配制3份。采用“1.2”分析方法測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果表明，各溶劑加標(biāo)回收率均在85%～110%之間，方法的準(zhǔn)確度良好，結(jié)果如表 1～3所示。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（氯甲烷）

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果（氯乙烷）

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果（2-氯丙烷）

2.8 樣品測(cè)定

取三批艾拉莫德樣品，按“1.3”項(xiàng)下制備對(duì)照品溶液和供試品溶液，按“1.2”項(xiàng)下分析方法測(cè)定。結(jié)果如表4所示，三批樣品中氯甲烷、氯乙烷、2-氯丙烷均未檢出。

表4 氯甲烷、氯乙烷和2-氯丙烷測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

本文以氯甲烷、氯乙烷、2-氯丙烷為研究對(duì)象，建立了艾拉莫德樣品中潛在基因毒雜質(zhì)氯甲烷、氯乙烷、2-氯丙烷含量的氣相分析方法。該方法具有專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確快速，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，符合定量分析要求。本方法可用于實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)化生產(chǎn)質(zhì)量控制分析。