吳冠瑾，閆福嶺，劉琛，張川，秦樹(shù)巧，馮靜靜，黑丹丹

1.河南大學(xué)附屬鄭州頤和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450047；2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 南京 210009；3.鄭州人民醫(yī)院感染管理辦公室，河南 鄭州 450000

腦卒中(cerebral stroke)是導(dǎo)致全球人類高死亡率和高致殘率的重要因素[1]。缺血性腦卒中(cerebral ischemic stroke)占腦卒中的80%以上。目前，對(duì)于缺血性卒中患者，主要的治療方式是通過(guò)阻塞性動(dòng)脈的溶栓和/或機(jī)械再通來(lái)盡早實(shí)行再灌注。然而，這些治療方式由于治療時(shí)間窗狹窄，出血風(fēng)險(xiǎn)等因素[2]，導(dǎo)致治療效果并不理想。因此，深入了解缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制，研發(fā)新的治療手段，具有重要的臨床意義。近年來(lái)，非編碼RNA(ncRNA)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常和病理狀態(tài)下均起著至關(guān)重要的作用[3-6]。環(huán)狀RNA(circRNA)是一種重要的非編碼RNA，其3'和5'末端之間具有共價(jià)鍵，從而形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)[7]，circRNA在人類細(xì)胞中高度保守并大量表達(dá)[8]。近年來(lái)的研究表明，短暫性腦局部缺血、氧氣-葡萄糖剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)均能促使神經(jīng)元細(xì)胞中circRNA表達(dá)譜發(fā)生顯著的改變[9]，但具體的調(diào)控機(jī)制還有待深入研究。本研究利用SH-SY5Y細(xì)胞建立OGD損傷模型，初步探討has_circ_0067923在OGD導(dǎo)致的SH-SY5Y細(xì)胞增殖及凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及試劑 SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。Cell Counting Kit-8試劑盒、Annexin V-FΙTC檢測(cè)試劑盒、胰酶細(xì)胞消化液(0.25%胰酶)、RΙPA細(xì)胞快速裂解液、BCA試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；MEM/F12培養(yǎng)基、無(wú)糖MEM/F12培養(yǎng)基、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑、胎牛血清、TRΙzol購(gòu)自美國(guó)Thermofisher；PrimeScript?RT Reagent Kit、TB Green Fast qPCR Mix購(gòu)自日本TaKaRa公司；PVDF膜、化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自美國(guó)Millipore公 司；Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3及GAPDH抗體購(gòu)自中國(guó)Proteintech公司；HRP酶標(biāo)抗兔二抗購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；引物及si-NC、si-has_circ_0067923序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器 MK3酶標(biāo)儀購(gòu)自芬蘭雷勃公司；Mini Protean 3 Cell電泳儀購(gòu)自美國(guó)BΙO-RAD公司；CFX-96熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)BΙO-RAD公司；Tanon-5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀購(gòu)自上海天能科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermofisher；NovoCyteTM流式細(xì)胞儀購(gòu)自Novo公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y細(xì)胞復(fù)蘇后，利用含有10%胎牛血清(FBS)的MEM/F12培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞黏合度達(dá)到90%以上的時(shí)候，按照1∶(2～3)的比例傳代，備用。

1.2.2 細(xì)胞分組 將SH-SY5Y細(xì)胞隨機(jī)分成Control組(正常培養(yǎng)基，常氧培養(yǎng))、OGD處理組；除Control組外，OGD(2 h)組、OGD(4 h)組、OGD(6 h)組均通過(guò)OGD處理不同時(shí)間點(diǎn)。檢測(cè)細(xì)胞的增殖、凋亡及has_circ_0067923表達(dá)變化。

1.2.3 SH-SY5Y細(xì)胞OGD模型構(gòu)建 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，按照1×104cells/mL的細(xì)胞量傳于6孔板，構(gòu)建OGD模型：首先棄去原有培養(yǎng)基后，利用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞3次，每孔加入無(wú)血清、無(wú)糖MEM培養(yǎng)基1.5 mL，置于37℃、5%CO2、94%N2、1%O2的三氣培養(yǎng)箱中進(jìn)行氧糖剝奪相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)后，取出細(xì)胞，換成正常培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，按照1×104cells/mL的細(xì)胞量傳于6孔板，參照轉(zhuǎn)染試劑盒操作說(shuō)明書(shū)，利用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑將si-has_circ_0067923及si-NC片段傳染SH-SY5Y細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，構(gòu)建OGD模型。其中si-has_circ_0067923序列和si-NC序列分別為5'-GCCACAGUGUUCCCUUGUGUA-3'、5'-AUUAUC UGGCUUAAAUUGCCA-3'。

1.2.5 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) OGD造模，換成正常培養(yǎng)基在常氧下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，按照試劑盒操作說(shuō)明，每孔加入10μL CCK-8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育0.5 h，用酶標(biāo)儀(450 nm)檢測(cè)各組細(xì)胞的吸光值(OD值)。

1.2.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè) OGD造模，換成正常培養(yǎng)基在常氧下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，按照試劑盒操作說(shuō)明，加入5μLAnnexin V-FΙTC及10μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育10～20 min，隨后置于冰浴中，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，NovoExpressTM分析軟件進(jìn)行分析。

1.2.7 qRT-PCR檢測(cè) 收集細(xì)胞，TRΙzol裂解提取RNA，PrimeScriptTMRT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄程cDNA后進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)程序：95℃，3 min；95℃，5 s；59℃，10 s；72℃，25 s；39 cycles；65℃，5 s；95℃，50 s。以GAPDH為內(nèi)參，利用2-ΔΔCT計(jì)算has_circ_0067923相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.2.8 has_circ_0067923結(jié)構(gòu)及表達(dá)位置分析 利用circPrimer1.2分析has_circ_0067923的結(jié)構(gòu)。采用Rnase R處理SH-SY5Y細(xì)胞后，收集細(xì)胞，Trizol法提取RNA，PrimeScriptTMRT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄程cDNA后，qRT-PCR檢測(cè)has_circ_0067923表達(dá)。內(nèi)參選用GAPDH、U6及18S(引物序列見(jiàn)表1)。

1.2.9 Western blot檢測(cè) 收集細(xì)胞，RΙPA裂解后，冰上孵育20 min后，4℃、10 000×g離心3～5 min，取上清，BCA定量后，按照每孔20μg蛋白量上樣，SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)膜，分別以兔抗Bax(1∶800)、Bcl-2(1∶1 000)、CleavedCaspase-3(1∶800)及GAPDH(1∶10 000)，4℃、孵育過(guò)夜后，TBST漂洗3次，加入HRP酶標(biāo)抗兔二抗。加入ECL發(fā)光液膜置于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀中掃描，通過(guò)TANON GΙS軟件讀取相關(guān)條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，采用GraphPad Prism6.0作圖。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間數(shù)據(jù)的比較采用One-way ANOVA分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OGD抑制SH-SY5Y細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡 OGD處理不同時(shí)間后，SH-SY5Y細(xì)胞活力均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖1A。Annexin V-FΙTC/PΙ檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)：Control組細(xì)胞凋亡率為(5.19±0.19)%、OGD(2 h)細(xì)胞凋亡率為(16.45±1.57)%、OGD(4 h)細(xì)胞凋亡率為(26.62±1.56)%、OGD(6 h)細(xì)胞凋亡率為(33.13±2.39)%，OGD顯著促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡(P＜0.05)，見(jiàn)圖1B～1F。

2.2 OGD促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞中has_circ_0067923表達(dá) circPrimer1.2分析發(fā)現(xiàn)，has_circ_0067923位于3號(hào)染色體，親本基因?yàn)镻RKCΙ(protein kinase Ciota)，其大小為278 bp(圖2A)。qRT-PCR檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，隨著OGD時(shí)間的延長(zhǎng)，has_circ_0067923表達(dá)顯著升高(P＜0.05)，見(jiàn)圖2B。qRT-PCR檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，has_circ_0067923主要存在于細(xì)胞質(zhì)中(圖2C、2D)。

圖1 OGD處理后，SH-SY5Y細(xì)胞增殖及凋亡檢測(cè)

圖2 qRT-PCR檢測(cè)has_circ_0067923的表達(dá)及定位

2.3 has_circ_0067923促進(jìn)OGD對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的損傷 特異性抑制has_circ_0067923的表達(dá)后，通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：與OGD組比較，si-has_circ_0067923顯著促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞的增殖(P＜0.05)(圖3A)；Control組細(xì)胞凋亡率為(5.81±0.79)%、OGD組細(xì)胞凋亡率為(18.41±0.69)%、si-NC組細(xì)胞凋亡率為(18.59±1.40)%、si-has_circ_0067923組細(xì)胞凋亡率為(27.44±1.79)%，與OGD組比較，si-has_circ_0067923組顯著抑制OGD引起的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡(P＜0.05)。說(shuō)明OGD促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖的作用與has_circ_0067923的表達(dá)相關(guān)(圖3B～3F)。

圖3 has_circ_0067923抑制后，細(xì)胞增殖及凋亡檢測(cè)

2.4 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bad、Bcl-2及Cleaved Caspase-3的表達(dá) Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：與Control組比較，Bad及Cleaved Caspase-3的表達(dá)量在OGD組、si-NC組、si-has_circ_0067923組中的表達(dá)量均顯著升高(P＜0.05)；與OGD組比較，has_circ_0067923的表達(dá)被抑制后，Bad、Cleaved Caspase-3的表達(dá)量均顯著降低(P＜0.05)。Bcl-2在OGD組、si-NC組、si-has_circ_0067923組中的表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)；與OGD組比較，has_circ_0067923的表達(dá)被抑制后，Bcl-2的表達(dá)量被顯著升高(P＜0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4 Westernblot檢測(cè)Bad、Bcl-2及Cleaved Caspase-3的表達(dá)

3 討論

腦卒中是引起人類死亡的重要原因之一[1]。近年來(lái)，中國(guó)腦卒中的患病率處于上升趨勢(shì)，特別是在農(nóng)村地區(qū)[1]。腦卒中的年齡標(biāo)準(zhǔn)化的患病率，發(fā)病率和死亡率分別為1 114.8/100 000、246.8/100 000和114.8/100 000[10-11]。腦卒中主要是由于流向大腦的血液不足導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡，并出現(xiàn)諸如運(yùn)動(dòng)功能障礙、語(yǔ)言表達(dá)能力障礙或失明等癥狀[11]。缺血性腦卒中是其主要表現(xiàn)形式，最終導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞腫脹和凋亡[12]。CricRNA是基因組重要組成部分，其表達(dá)的改變與多種病理、生理過(guò)程及疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[13]。本研究我們檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，在SH-SY5Y細(xì)胞OGD損傷中，has_circ_0067923的表達(dá)顯著升高，抑制其表達(dá)后，能夠降低OGD處理對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖及凋亡的影響，暗示has_circ_0067923可能參與缺血性腦卒中的發(fā)生。

CircRNA是一類在真核動(dòng)物體內(nèi)廣泛表達(dá)的內(nèi)源性非編碼RNA，來(lái)源廣。目前研究發(fā)現(xiàn)的CircRNA大部分是由外顯子反向剪切形成，在人類疾病發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能[13]。CricRNA可控制親本基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)環(huán)狀翻譯，促進(jìn)mRNA的選擇性剪接和發(fā)揮miRNA海綿等作用[14]。CircRNA的表達(dá)改變參與腫瘤、心肌肥大、動(dòng)脈粥樣硬化和神經(jīng)退行性疾病等疾病的發(fā)生[15-19]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中大鼠大腦皮層中14 236個(gè)CricRNA的表達(dá)水平發(fā)生改變，參與缺血性腦組織的損傷[20]。本研究通過(guò)利用SH-SY5Y細(xì)胞建立體外缺血性卒中損傷的OGD模型，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：隨著OGD處理時(shí)間的延長(zhǎng)，has_circ_0067923的表達(dá)量逐漸升高，細(xì)胞增殖能力被抑制，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；抑制has_circ_0067923表達(dá)后，能夠逆轉(zhuǎn)OGD處理對(duì)細(xì)胞的損傷作用，暗示has_circ_0067923參與OGD處理對(duì)SH-SY5Y神經(jīng)元細(xì)胞的損傷。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種方式，主要受基因及細(xì)胞生存的環(huán)境因素所控制。Caspase-3是促凋亡蛋白家族Caspase家族重要的成員之一。在細(xì)胞中，Caspase大多是以酶原的形式所存在的，但當(dāng)它被激活后能夠通過(guò)活化自身及其他相關(guān)的Caspase酶原，啟動(dòng)會(huì)相關(guān)蛋白酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程，從而放大凋亡的信號(hào)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。活化的Caspase3蛋白能夠降解細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中的重要蛋白，從而使之失去活性，最終導(dǎo)致凋亡的發(fā)生?？沟蛲龅鞍譈cl-2可通過(guò)阻止促凋亡蛋白bad介導(dǎo)的促凋亡因子的釋放而抑制細(xì)胞凋亡[21]。與既往研究類似，本研究發(fā)現(xiàn)OGD處理促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞Caspase-3及Bad的表達(dá)、降低Bcl-2蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[22-23]。抑制has_circ_0067923的表達(dá)后，能夠逆轉(zhuǎn)OGD處理對(duì)Caspase-3、Bad及Bcl-2表達(dá)的影響。初步說(shuō)明has_circ_0067923可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡參與OGD處理對(duì)SH-SY5Y神經(jīng)元細(xì)胞的損傷。

綜上所述，本研究初步說(shuō)明，has_circ_0067923的表達(dá)異常，參與OGD處理對(duì)SH-SY5Y神經(jīng)元細(xì)胞的損傷，促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖；抑制has_circ_0067923表達(dá)后，能夠緩解氧糖剝奪對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞損傷。但has_circ_0067923調(diào)控OGD處理對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞損傷的具體作用機(jī)制，有待更深入研究。