孫懷艷，楊曉丹，張夢翔，程耀堂

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科，合肥 230061；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥劑科，合肥 230061)

腦動(dòng)脈硬化(CEA)是由于腦血流量減少發(fā)生的彌漫性動(dòng)脈硬化，常發(fā)于中老年人，主要表現(xiàn)為神經(jīng)衰弱、頸動(dòng)脈粥樣硬化(AS)和眼底動(dòng)脈硬化[1]。臨床主要采用降血脂藥物、擴(kuò)張血管藥物、介入治療和對癥治療等治療CEA，但仍存在部分患者治療效果并不理想[2]。研究顯示[3]，CEA的發(fā)病機(jī)制可能與血管內(nèi)皮損傷、脂質(zhì)代謝障礙和高血壓等密切相關(guān)。三七皂苷R1(NR1)是從三七的根及根莖中提取的有效活性成分，具有止血定痛、活血化瘀的功效[4]以及抗炎、抗氧化、降血脂、降血壓等藥理學(xué)作用，可抑制AS的形成[5]。本研究探索了NR1對CEA大鼠腦組織損傷和血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)功能的影響及可能的機(jī)制，以期指導(dǎo)臨床治療CEA。

1 儀器與材料

1.1儀器 HX-Ⅱ型小動(dòng)物血壓測量計(jì)，北京明信通生物科技有限公司；7600型全自動(dòng)生化分析儀，日本HITACHI公司。

1.2試藥 三七皂苷R1(NR1)對照品，上海源葉生物科技有限公司；辛伐他汀(批號(hào)A19042301)，浙江京新藥業(yè)有限公司；內(nèi)皮素-1(ET-1)檢測試劑盒，上海晶抗生物工程有限公司；一氧化氮(NO)檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔二抗，丹麥DAKO公司；兔抗鼠P-p38MAPK、p38MAPK、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)抗體，均購自美國Santa Cruz公司。

1.3動(dòng)物 雄性SPF級(jí)SD大鼠65只，體質(zhì)量為(200±20) g，由安徽實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室，室溫控制在25 ℃，所有大鼠均自由飲食飲水。

2 方法

2.1造模及給藥 所有大鼠預(yù)飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取10只作為對照組，剩余55只大鼠采用雙腎雙夾法復(fù)制腎性高血壓CEA模型[6]，先行雙側(cè)腎主動(dòng)脈狹窄手術(shù)復(fù)制腎性高血壓模型，術(shù)后1周給予高脂乳劑10 mL·kg-1，每日1次，連續(xù)灌胃14周，制備CEA模型，造模后大鼠出現(xiàn)血壓、血脂升高，且腦中動(dòng)脈出現(xiàn)動(dòng)脈硬化斑塊為造模成功，共50只大鼠造模成功；對照組只行雙側(cè)腎動(dòng)脈分離術(shù)，飼喂常規(guī)飼料。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、NR1高、中、低劑量組和辛伐他汀組，各10只。造模后NR1高、中、低劑量組分別灌胃NR1 100、50、25 mg·kg-1·d-1，每日1次；辛伐他汀組灌胃辛伐他汀2.5 mg·kg-1·d-1，連續(xù)給藥4周；模型組和對照組大鼠均灌胃等體積生理鹽水。

2.2各組大鼠血清相關(guān)指標(biāo)的檢測 治療后，采用小動(dòng)物血壓測量儀通過套尾法測定收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)和平均動(dòng)脈壓(MAP)。分離腹主動(dòng)脈血液，以3 500 r·min-1離心10 min，采用生化分析儀檢測血清膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)及低密度脂蛋白(LDL-C)的水平。

2.3HE染色觀察腦中動(dòng)脈組織的病理變化 處死大鼠，迅速分離大鼠腦中動(dòng)脈，用生理鹽水沖洗后，加入質(zhì)量濃度為40 g·L-1的多聚甲醛進(jìn)行固定，常規(guī)脫水、透明、包埋、切片、HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠腦組織的病理變化，每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野拍照。

2.4腦組織NO和ET-1水平檢測 取大鼠腦皮質(zhì)及海馬組織，勻漿，參考試劑盒說明書采用硝酸還原酶法測定腦組織中NO水平，參考試劑盒說明書采用放射免疫直接測定法檢測腦組織中ET-1水平。

2.5Western Blot法測定腦組織中p38MAPK信號(hào)通路蛋白的表達(dá) 取大鼠腦皮質(zhì)及海馬組織，勻漿，加入1 mL細(xì)胞裂解液，以12 000 r·min-1離心5 min，取上清液，置于-20 ℃冰箱中保存，采用二喹啉甲酸試劑盒進(jìn)行蛋白定量，取50 μg提取的總蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜，加質(zhì)量濃度為50 g·L-1的脫脂牛奶封閉2 h，采用洗膜緩沖液(TBST)洗膜30 min，加入一抗p38MAPK、P-p38MAPK、eNOS、iNOS(1∶500)，以β-actin(1∶500)為內(nèi)參，于4 ℃下孵育過夜，TBST洗膜30 min，并加HRP標(biāo)記的二抗(1∶1 000)，37 ℃下孵育2 h，采用電化學(xué)發(fā)光顯影，采用Image J圖像分析系統(tǒng)分析蛋白相對表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1NR1對CEA大鼠腦中動(dòng)脈損傷的影響 見圖1。由圖1可知，對照組大鼠腦中動(dòng)脈組織細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，未見明顯病變；模型組和NR1低劑量組大鼠腦中動(dòng)脈壁明顯增厚，內(nèi)皮細(xì)胞向管腔內(nèi)突出，中層平滑肌細(xì)胞增生；NR1中、高劑量組和辛伐他汀組大鼠腦中動(dòng)脈病理變化明顯減輕，且隨著劑量的增加，病變呈減輕趨勢。

圖1 各組大鼠主動(dòng)脈的病理變化(HE，×200)

3.2NR1對CEA大鼠血壓的影響 見表1。由表1可知，模型組大鼠SBP、DBP和MAP水平明顯高于對照組(P<0.05)；NR1中、高劑量組和辛伐他汀組大鼠SBP、DBP和MAP水平明顯低于模型組(P<0.05)，且隨著NR1劑量的增加，各指標(biāo)水平變化愈加明顯(P<0.05)。

表1 NR1對CEA大鼠血壓的影響

3.3NR1對CEA大鼠血脂的影響 見表2。由表2可知，與對照組比較，模型組大鼠TG、TC和LDL-C水平均明顯升高(P<0.05)，HDL-C水平明顯下降(P<0.05)；與模型組比較，NR1中、高劑量組和辛伐他汀組大鼠TG、TC和LDL-C水平明顯降低(P<0.05)，HDL-C水平明顯升高(P<0.05)，且隨著NR1劑量的增加，各指標(biāo)水平變化愈加明顯(P<0.05)。

表2 NR1對CEA大鼠血脂的影響

3.4NR1對CEA大鼠腦組織NO和ET-1水平的影響 見表3。由表3可知，模型組大鼠腦組織NO和ET-1水平明顯高于對照組(P<0.05)；NR1中、高劑量組和辛伐他汀組大鼠腦組織ET-1水平明顯低于模型組(P<0.05)，且隨著NR1劑量的增加，各指標(biāo)水平變化愈加明顯(P<0.05)。

表3 NR1對CEA大鼠NO和ET-1水平的影響

3.5NR1對CEA大鼠p38MAPK信號(hào)通路的影響 見圖2和表4。

圖2 NR1對CEA大鼠p38MAPK信號(hào)通路的影響

由圖2和表4可知，模型組和NR1中、高劑量組組大鼠腦組織P-p38MAPK/p38MAPK和iNOS的蛋白表達(dá)明顯高于對照組(P<0.05)，eNOS的蛋白表達(dá)明顯低于對照組(P<0.05)；NR1中、高劑量組和辛伐他汀組P-p38MAPK/p38MAPK和iNOS的蛋白表達(dá)明顯低于模型組(P<0.05)，eNOS的蛋白表達(dá)明顯高于模型組(P<0.05)，且隨著NR1劑量的增加，各指標(biāo)變化愈加明顯(P<0.05)。

表4 NR1對CEA大鼠p38MAPK信號(hào)通路的影響

4 討論

CEA以腦AS為主，隨著病情的發(fā)展，可引起缺血性腦血管病，影響患者預(yù)后。CEA的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與進(jìn)行性脂質(zhì)沉積、高血壓和VEC損傷等有關(guān)[7]。研究顯示[8]，高血壓及高血脂是CEA形成的主要危險(xiǎn)因素，長期的高血壓和高血脂狀態(tài)可影響VEC功能，誘導(dǎo)動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，引起腦血管管腔狹窄阻塞，影響腦局部組織血流量減少，引起腦組織缺血缺氧壞死，臨床常采用高血壓聯(lián)合高血脂法制備大鼠CEA模型。辛伐他汀是目前常用的降脂藥，可有效延緩CEA的形成[9]。NR1是從中藥三七中提取的有效活性成分，具有降血壓、調(diào)脂和抗氧化等多種作用，可延緩AS形成，但其具體作用機(jī)制尚不明確[10]。因此，本研究探討了NR1對CEA大鼠腦動(dòng)脈組織損傷的作用及機(jī)制，以期指導(dǎo)臨床治療。

本研究中，CEA大鼠腦中動(dòng)脈存在明顯損傷，動(dòng)脈壁明顯增厚，經(jīng)NR1干預(yù)后，可明顯減輕CEA大鼠腦中動(dòng)脈組織的病理變化，降低腦中動(dòng)脈壁厚度，抑制血管平滑肌增殖，還可降低血壓，降低TG、TC和LDL-C水平，升高HDL-C水平，且隨著濃度升高，各指標(biāo)差異變化更顯著，提示NR1可能呈濃度依賴性地改善AS大鼠的血壓和血脂水平，抑制血管平滑肌增殖。Yao L等[11]研究顯示，長期高血壓可使動(dòng)脈管壁增厚，形成硬化斑塊。高血脂是影響CEA發(fā)生和進(jìn)展的主要危險(xiǎn)因素，血脂中的主要成分是TG和TC，LDL-C是運(yùn)輸內(nèi)源性TC到肝外組織的主要載體，HDL-C可將肝外組織中的TC轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟組織中，進(jìn)行代謝，從而降低機(jī)體的血脂水平[12]。Fernández-Friera L等[13]研究顯示，血脂水平與VEC損傷密切相關(guān)，LDL-C進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞后可誘導(dǎo)細(xì)胞氧化，促進(jìn)活性氧(ROS)的產(chǎn)生，形成氧化修飾低密度脂蛋白(ox-LDL-C)，加重VEC氧化損傷，促進(jìn)CEA的形成，提示NR1可能通過機(jī)體的血壓和血脂水平，減輕血管VEC的氧化應(yīng)激損傷。

本研究中，NR1干預(yù)可降低CEA大鼠腦組織ET-1和NO水平，且隨著濃度升高，各指標(biāo)差異變化更顯著。ET-1和NO是一組由VEC分泌的細(xì)胞因子，可共同作用調(diào)節(jié)血管的收縮功能，其中NO可通過多種途徑抑制ET-1的分泌，擴(kuò)張血管，抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖，還可清除機(jī)體過多的氧自由基，減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[14]。ET-1是一種強(qiáng)力的血管收縮因子，可通過抑制eNOS的表達(dá)而抑制NO的合成，促進(jìn)血管平滑肌增殖，誘導(dǎo)動(dòng)脈血管壁增厚，促進(jìn)CEA的形成[15]。NO主要由一氧化氮合成酶(NOS)合成，包括神經(jīng)元型NOS、iNOS和eNOS。研究顯示，eNOS可合成并分泌少量的NO，從而抑制收縮因子ET-1的分泌，抑制血管平滑肌增殖，活化的iNOS可合成并分泌大量的NO和過氧化物，激活組織細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)VEC的氧化應(yīng)激損傷[16]。李春曉等[17]研究發(fā)現(xiàn)，NO和ET-1水平異常升高可反映腦組織的VEC功能，誘導(dǎo)組織損傷，提示NR1可通過調(diào)節(jié)腦組織NO和ET-1水平變化，保護(hù)VEC功能。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路包括3條途徑，細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)通路、c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路及p38MAPK通路。近年來研究顯示[18]，p38MAPK信號(hào)通路被磷酸化激活后，可調(diào)節(jié)下游iNOS和eNOS的表達(dá)，參與調(diào)節(jié)VEC功能。本研究中，NR1干預(yù)可降低CEA大鼠腦組織p38的磷酸化，促進(jìn)eNOS的蛋白表達(dá)，抑制iNOS的蛋白表達(dá)。孫慧琳等[19]研究顯示，胰高血糖素樣肽1可抑制p38MAPK的磷酸化，促進(jìn)eNOS的蛋白表達(dá)，減輕VEC的氧化損傷，延緩糖尿病大鼠AS的形成。錢風(fēng)華等[20]研究顯示，p38MAPK抑制劑可抑制iNOS的蛋白表達(dá)，改善膿毒癥大鼠的心肌損傷，提示NR1可能通過抑制p38MAPK的磷酸化，上調(diào)eNOS的蛋白表達(dá)，下調(diào)iNOS的蛋白表達(dá)及NO和ET-1水平，改善VEC功能。

綜上所述，NR1可通過抑制CEA大鼠p38MAPK的磷酸化，調(diào)節(jié)eNOS、iNOS的蛋白表達(dá)及NO、ET-1水平，降低血壓和血脂水平，改善VEC功能，延緩CEA發(fā)展。但本研究尚處于探索階段，其具體機(jī)制還需進(jìn)一步驗(yàn)證。