陳 健，劉木華，2，袁海超，2，黃雙根，2，趙進(jìn)輝，2*，徐 寧，王 婷，胡 圍

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院 江西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)裝備重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院 江西省果蔬采后處理關(guān)鍵技術(shù)及質(zhì)量安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江西 南昌330045）

1 引言

自1929年Fleming［1］發(fā)現(xiàn)第1劑抗生素（青霉素）以來(lái)，抗生素得到了快速發(fā)展和應(yīng)用，不僅用于治療人類的各類感染性疾病，而且也用于解決家禽養(yǎng)殖中存在的疫病防治問(wèn)題。然而，在家禽養(yǎng)殖中使用抗生素是一把雙刃劍，因?yàn)榭股貢?huì)殘留在家禽中，人類食用這種家禽后抗生素會(huì)導(dǎo)致各種副作用，例如破壞人體的腸道菌群，轉(zhuǎn)移耐藥性細(xì)菌至人體和致癌等［2-4］。

磺胺二甲基嘧啶（Sulfamethazine，SM 2）屬于磺胺類抗生素，氧氟沙星（Ofloxacin，OFL）屬于喹諾酮類抗生素，均是家禽疾病防治的常用藥。為保障家禽產(chǎn)品質(zhì)量安全和公共衛(wèi)生安全，中國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定在雞肌肉組織中SM 2的最大殘留限量為100μg/kg，禁止使用OFL［5-6］。目前，檢測(cè)肉中磺胺類和喹諾酮類抗生素殘留的方法主要有液相色譜法［7-8］、液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用法［9-10］等。這些方法需要實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、熟練的技術(shù)人員和較長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間等，難以滿足日益增長(zhǎng)的現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測(cè)需求［11-13］。因此，需要開(kāi)發(fā)操作簡(jiǎn)單、快速和低成本的檢測(cè)技術(shù)。熒光屬于光致發(fā)光現(xiàn)象，當(dāng)紫外線照射某些物質(zhì)時(shí)，這些物質(zhì)會(huì)發(fā)射出不同顏色和強(qiáng)度的可見(jiàn)光，而當(dāng)停止照射時(shí)，發(fā)射的光也會(huì)迅速消失［14］。在實(shí)際使用中，常規(guī)熒光光譜法具有較高靈敏度，但對(duì)于一些多組分混合物分析時(shí)，熒光光譜常重疊嚴(yán)重，難以分析，光譜檢測(cè)效果不佳。為改善熒光檢測(cè)的效果，同步熒光掃描技術(shù)被提出，該技術(shù)同時(shí)掃描激發(fā)和發(fā)射單色器波長(zhǎng)，并將測(cè)得的熒光強(qiáng)度信號(hào)對(duì)應(yīng)的激發(fā)（或發(fā)射）波長(zhǎng)作圖［15-16］。與常規(guī)熒光光譜相比，同步熒光法具有窄化光譜帶、減弱光譜重疊等優(yōu)點(diǎn)。科研人員已經(jīng)應(yīng)用同步熒光技術(shù)檢測(cè)豬肉中頭孢噻呋或頭孢拉定殘留［17-18］，由此表明同步熒光技術(shù)可用于單種抗生素殘留的快速檢測(cè)。

目前，應(yīng)用同步熒光技術(shù)同時(shí)檢測(cè)雞肉中SM 2和OFL殘留的研究尚無(wú)報(bào)道。因此，本文將同步熒光技術(shù)與化學(xué)計(jì)量學(xué)方法結(jié)合，以雞肉為載體，SM 2和OFL為研究對(duì)象，優(yōu)化了熒光檢測(cè)條件，建立并對(duì)比了峰高法和峰面積法的預(yù)測(cè)模型，為進(jìn)一步應(yīng)用同步熒光技術(shù)檢測(cè)肉中抗生素殘留提供技術(shù)支持。

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 材料與試劑

雞胸肉（南昌市某大型超市）；SM 2（99.4%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司）；OFL（≥99%，上海源葉生物科技有限公司）；鄰苯二甲醛、β-巰基乙醇（99.0%，成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司）；硼酸（≥99.5%）、磷酸（≥85.0%）（西隴科學(xué)股份有限公司）；乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA）、磷酸 二 氫 鉀（KH2PO4）和 磷 酸 氫 二 鉀（K2HPO4·3H2O）（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）；冰乙酸（≥99.5%，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；三氯乙酸（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；有機(jī)相針式濾器（0.45μm，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。

磷酸鹽緩沖液（含0.4 mmol/L的Na2EDTA和10%的三氯乙酸溶液）的配制：準(zhǔn)確稱取1 g K2HPO4·3H2O和4 g KH2PO4，用480 mL超純水溶解，分別加入Na2EDTA 75 mg和三氯乙酸50 g，溶解混勻并用超純水定容至500 mL。0.01 mol/L鄰苯二甲醛溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.134 g鄰苯二甲醛溶于100 mL容量瓶中，用超純水稀釋至刻度。0.1 mol/Lβ-巰基乙醇溶液的配制：準(zhǔn)確量取β-巰基乙醇704μL于100 mL容量瓶中，用超純水稀釋至刻度。BR緩沖液（p H 1.8）的配制：用超純水配制濃度各為0.04 mol/L的磷酸、冰乙酸和硼酸混合緩沖溶液。

2.2 儀器與設(shè)備

實(shí)驗(yàn)設(shè)備有：Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)（美國(guó)瓦里安）；FA 1004B電子天平（上海上平儀器有限公司）；全自動(dòng)RO純水機(jī)（湖南科爾頓水務(wù)有限公司）；JK-50B超聲波清洗器（合肥金尼克機(jī)械有限公司）；VORTEX-5漩渦混合器（海門市其林貝爾儀器有限公司）；KJ-201BS振蕩器（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）；JW-1024低速離心機(jī)（安徽嘉文儀器裝備有限公司）；JJ-2B組織搗碎勻漿機(jī)（江蘇省金南儀器廠）；1 cm光程石英比色皿（宜興市晨偉玻璃儀器廠）。

2.3 樣品的制備

（1）抗生素儲(chǔ)備液的配制：取7.5 mg的SM 2（或OFL）標(biāo)準(zhǔn)品溶于50 mL超純水，可得到150 mg/L SM 2（或150 mg/L OFL）儲(chǔ)備液，于4℃下儲(chǔ)存。

（2）SM 2工作液的配制：取0.6 mL的SM 2儲(chǔ)備液，用超純水稀釋至15 mL，得到6.0 mg/L SM 2工作液，于4℃下儲(chǔ)存。

（3）OFL工作液的配制：取0.1 mL的OFL儲(chǔ)備液，用超純水稀釋至15 mL，得到1.0 mg/L OFL工作液，于4℃下儲(chǔ)存。

（4）根據(jù)文獻(xiàn)［8］中的快速溶劑萃取法提取空白雞肉，具體操作如下：稱取均質(zhì)的雞胸肉5.0 g（精確到0.1 g），置于50 mL離心管中，加入超純水4 mL，渦旋1 min，再加入磷酸鹽緩沖液10 mL，渦旋1 min，振蕩15 min，4500 r/min離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一個(gè)50 mL離心管中，往離心管沉淀物中再加入磷酸鹽緩沖液10 mL；重復(fù)上述步驟1次，并將2次提取的上清液合并，混勻，過(guò)0.45μm濾膜，用磷酸鹽緩沖液定容至25 mL，得到空白雞肉提取液。

（5）根據(jù)文獻(xiàn)［8］，雞肉中SM 2和OFL的殘留提取操作分為3部分。①混合抗生素工作液的配制：在10 mL離心管中分別加入0.083，0.167，0.500，0.750，1.000，1.250，1.500，1.750，2.250，2.500 mL的SM 2儲(chǔ)備液和0.042，0.083，0.167，0.417，0.500，0.583，0.667，0.750，0.833，0.917 mL的OFL儲(chǔ)備液，兩者濃度隨機(jī)組合，用超純水定容至4 mL，得到這兩種混合抗生素工作液。②加標(biāo)雞肉的制備：稱取均質(zhì)的雞胸肉5.0 g（精確到0.1 g），置于50 mL離心管中，加入4 mL混合抗生素工作液，渦旋1 min。③雞肉中抗生素的提?。杭尤肓姿猁}緩沖液10 mL，渦旋1 min，振蕩15 min，4500 r/min離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一個(gè)50 mL離心管中，往離心管沉淀物中再加入磷酸鹽緩沖液10 mL，重復(fù)上述步驟1次，并將2次提取的上清液合并，混勻，過(guò)0.45μm有機(jī)相濾膜，用磷酸鹽緩沖液定容至25 mL。得到含SM 2和OFL的雞肉提取液：SM 2濃 度 為0.5，1.0，3.0，4.5，6.0，7.5，9.0，10.5，13.5，15.0 mg/L（分別對(duì)應(yīng)于雞肉中含有2.5，5.0，15.0，22.5，30.0，37.5，45.0，52.5，67.5，75.0 mg/kg的SM 2），OFL濃度為0.25，0.5，1.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5 mg/L（分別對(duì)應(yīng)于雞肉中含有1.25，2.5，5.0，12.5，15.0，17.5，20.0，22.5，25.0，27.5 mg/kg的OFL）。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液以及雞肉提取液的三維同步熒光光譜的采集

為了采集標(biāo)準(zhǔn)溶液以及雞肉提取液的三維同步熒光光譜，分別取200μL SM 2標(biāo)準(zhǔn)溶液（6.0 mg/L）、OFL標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0 mg/L）、空白雞肉提取液和含SM 2和OFL的雞肉提取液（6.0 mg/kg SM 2，1.0 mg/kg OFL）于不同的石英比色皿中，再先后加入800μL BR緩沖液，100μL β-巰基乙醇溶液和100μL鄰苯二甲醛溶液，采集波長(zhǎng)差（Δλ：20～300 nm，間隔10 nm）的三維同步熒光光譜。

2.5 定性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

（1）為了探究不同β-巰基乙醇溶液加入量對(duì)同步熒光強(qiáng)度的影響，向石英比色皿中依次加入200μL含SM 2和OFL的雞肉提取液（6.0 mg/kg SM 2，1.0 mg/kg OFL），BR緩沖液（調(diào)節(jié)其體積使體系恒為1.2 mL），25，100，300，400，600和800μL的β-巰基乙醇溶液，100μL鄰苯二甲醛溶液，設(shè)置5個(gè)平行組，采集44 min，Δλ=150 nm和210 nm處的同步熒光光譜。

（2）為了探究不同鄰苯二甲醛溶液加入量對(duì)同步熒光強(qiáng)度的影響，向石英比色皿中依次加入200μL含SM 2和OFL的雞肉提取液（6.0 mg/kg SM 2，1.0 mg/kg OFL），BR緩沖液（調(diào)節(jié)其體積使體系恒為1.2 mL），300μLβ-巰基乙醇溶液，25，100，200，300和400μL的鄰苯二甲醛溶液，設(shè)置5個(gè)平行組，采集44 min，Δλ=150 nm和210 nm處的同步熒光光譜。

（3）為了探究不同時(shí)間對(duì)同步熒光強(qiáng)度的影響，向石英比色皿中依次加入200μL含SM 2和OFL的雞肉提取液（6.0 mg/kg SM 2，1.0 mg/kg OFL），675μL BR緩沖液，300μLβ-巰基乙醇溶液，25μL鄰苯二甲醛溶液，設(shè)置5個(gè)平行組，采集0～100 min（間隔4 min），Δλ=150 nm和210 nm處的同步熒光光譜。

2.6 定量實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

向石英比色皿中依次加入200μL的含不同濃度SM 2和OFL的雞肉提取液，675μL BR緩沖液，300μLβ-巰基乙醇溶液，25μL鄰苯二甲醛溶液，設(shè)置5個(gè)平行組，采集44 min，Δλ=150 nm和210 nm處的同步熒光光譜。

2.7 熒光光譜儀參數(shù)設(shè)置

標(biāo)準(zhǔn)溶液以及雞肉提取液的三維同步熒光光譜采集時(shí)，熒光光譜儀的采集參數(shù)設(shè)置如下：激發(fā)波長(zhǎng)的掃描范圍為240～490 nm，激發(fā)、發(fā)射狹縫寬度分別為10 nm和5 nm，光電倍增管（Photomultiplier Tube，PMT）電壓為700 V。

定性實(shí)驗(yàn)和定量實(shí)驗(yàn)時(shí)，熒光光譜儀的參數(shù)設(shè)置如下：激發(fā)波長(zhǎng)的掃描范圍為240～400 nm，激發(fā)、發(fā)射狹縫寬度分別為10 nm和5 nm，PMT電壓為700 V。

2.8 數(shù)據(jù)處理方法

在建立預(yù)測(cè)模型之前，使用The Unscram?bler X 10.4（挪威CAMO公司）軟件對(duì)原始光譜進(jìn)行基線偏移，以消除原始光譜的基線漂移。其次，使用LabSpec 5（法國(guó)JobinYvon公司）軟件對(duì)SM 2的同步熒光光譜（Δλ=150 nm，激發(fā)波長(zhǎng)在270～315 nm）和OFL的同步熒光光譜（Δλ=210 nm，激發(fā)波長(zhǎng)在275～315 nm）進(jìn)行峰面積計(jì)算。為了建立基于峰高法的預(yù)測(cè)模型，擬合雞肉中SM 2殘留濃度和熒光激發(fā)峰強(qiáng)度（Δλ=150 nm，熒光激發(fā)峰為292.5 nm）之間的關(guān)系、擬合雞肉中OFL殘留濃度和熒光激發(fā)峰強(qiáng)度（Δλ=210 nm，熒光激發(fā)峰為295 nm）之間的關(guān)系，來(lái)評(píng)估熒光激發(fā)峰強(qiáng)度與相應(yīng)濃度之間是否存在良好的線性關(guān)系。此外，為了建立基于峰面積法的預(yù)測(cè)模型，擬合雞肉中SM 2殘留濃度和熒光激發(fā)峰面積之間的關(guān)系以及雞肉中OFL殘留濃度和熒光激發(fā)峰面積之間的關(guān)系，來(lái)評(píng)估熒光激發(fā)峰面積與相應(yīng)濃度之間是否存在良好的線性關(guān)系。計(jì)算訓(xùn)練集決定系數(shù)（Coefficient of Determina?tion for the Training Set，）、預(yù)測(cè)集決定系數(shù)（Coefficient of Determination for the Prediction Set，）、預(yù)測(cè)集均方根誤差（Root Mean Square Error for the Prediction Set，RMSEP）、回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD），以評(píng)估預(yù)測(cè)模型性能。

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液以及雞肉提取液的三維同步熒光光譜

SM 2和OFL具有不同的熒光基團(tuán)，進(jìn)而有著不同的熒光特性。為了同時(shí)檢測(cè)這兩種抗生素，需要SM 2和OFL都能表現(xiàn)出明顯的熒光特征，從而收集包含這兩種抗生素的熒光信息。SM 2是弱熒光物質(zhì)，但它具有伯胺基團(tuán)，可通過(guò)衍生劑（本文使用鄰苯二甲醛）進(jìn)行衍生，其產(chǎn)物在Δλ/激發(fā)波長(zhǎng)為150/292.5 nm處有熒光激發(fā)峰。伯胺化合物與鄰苯二甲醛反應(yīng)的化學(xué)方程式［19］如下：

另一方面，從化學(xué)結(jié)構(gòu)來(lái)看，OFL具有共軛結(jié)構(gòu)和剛性，且其核心結(jié)構(gòu)部分為喹啉，因此具有較強(qiáng)的熒光特性［20］。圖1（a）和圖1（b）分別為SM 2衍生物和OFL的三維同步熒光等高線圖。從中可見(jiàn)，OFL在Δλ/激發(fā)波長(zhǎng)為170/330 nm和210/295 nm處有熒光激發(fā)峰。雞肉成分復(fù)雜（存在蛋白質(zhì)、脂肪等），某些成分（例如色氨酸等）具有較強(qiáng)的熒光特性，因此，采用三氯乙酸、有機(jī)相針式濾器對(duì)提取液進(jìn)行處理，以減弱蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)的干擾。圖1（c）為空白雞肉提取液的三維同步熒光等高線圖。從中可見(jiàn)，空白雞肉提取液在Δλ/激發(fā)波長(zhǎng)為60/282.5 nm和130/337.5 nm處有明顯的熒光激發(fā)峰。圖1（d）為含SM 2和OFL的雞肉提取液的三維同步熒光等高線圖。從中可見(jiàn)，在含SM 2和OFL的雞肉提取液中SM 2衍生物和OFL顯現(xiàn)出它們的熒光激發(fā)峰。綜上所述，待測(cè)抗生素（SM 2、OFL）與雞肉背景的熒光信號(hào)有明顯的區(qū)別，可通過(guò)Δλ/激發(fā)波長(zhǎng)150/292.5 nm（SM 2）和210/295 nm（OFL）實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)。

圖1 三維同步熒光等高線圖Fig.1 Contour spectra of three-dimensional synchronous fluorescence

3.2 同步熒光光譜檢測(cè)條件優(yōu)化

在鄰苯二甲醛與SM 2的衍生過(guò)程中，β-巰基乙醇作為還原劑［21］，其加入量會(huì)影響目標(biāo)衍生物的生成量。由圖2（a）可知，β-巰基乙醇溶液加入量在25～300μL內(nèi)，隨著β-巰基乙醇溶液加入量的增多，SM 2衍生物的熒光強(qiáng)度迅速增強(qiáng)。這可能是隨著β-巰基乙醇含量增加，更多的β-巰基乙醇參與了衍生反應(yīng)，SM 2衍生物產(chǎn)量增加了。β-巰基乙醇溶液加入量在300～800μL內(nèi)，它對(duì)SM 2衍生物的熒光強(qiáng)度影響不大。這是因?yàn)棣?巰基乙醇溶液加入量對(duì)SM 2衍生物生成的影響減小了。此外，β-巰基乙醇溶液加入量在25～600μL內(nèi)，隨著β-巰基乙醇溶液加入量的增多，OFL的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。這是因?yàn)樵谒嵝越橘|(zhì)（p H 4）中具有苯環(huán)的OFL熒光特性更強(qiáng)［22］，隨著β-巰基乙醇（pH 4.5～6.0）含量的增加，體系p H逐步向β-巰基乙醇靠近。β-巰基乙醇溶液加入量在600～800μL內(nèi)，它對(duì)OFL的熒光強(qiáng)度影響不大。這是因?yàn)棣?巰基乙醇溶液加入量對(duì)體系p H的影響減小了。從圖2（a）可以看出，加入β-巰基乙醇溶液300μL時(shí)，SM 2衍生物的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，且OFL的熒光強(qiáng)度比SM 2衍生物強(qiáng)。因此，β-巰基乙醇溶液的加入量在300～800μL之間。SM 2產(chǎn)生熒光條件苛刻，且熒光較弱，所以增強(qiáng)其熒光強(qiáng)度有利于提高檢測(cè)靈敏度。綜合考慮，SM 2和OFL的熒光強(qiáng)度以及節(jié)約β-巰基乙醇用量，確定300μL為最佳加入量。

目前，鄰苯二甲醛在熒光檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用［23-25］。由圖2（b）可見(jiàn)，鄰苯二甲醛溶液加入量在25～300μL內(nèi)，隨著鄰苯二甲醛溶液加入量的增多，SM 2衍生物的熒光強(qiáng)度逐漸減弱。在異吲哚衍生物形成過(guò)程中加入過(guò)量的鄰苯二甲醛會(huì)導(dǎo)致其快速降解［26-28］，這是SM 2衍生物熒光強(qiáng)度減弱的原因。鄰苯二甲醛溶液加入量在300～400μL內(nèi)，它對(duì)SM 2衍生物熒光強(qiáng)度的影響不大。這是因?yàn)猷彵蕉兹┤芤杭尤肓繉?duì)異吲哚衍生物降解的影響減弱了。此外，鄰苯二甲醛溶液加入量在25～300μL內(nèi)，隨著加入量的增多，OFL的熒光強(qiáng)度也逐漸減弱。在酸性體系中，隨著鄰苯二甲醛（pH7，53 g/L）含量的增加，體系的pH升高，從而減弱了OFL的熒光特性。鄰苯二甲醛溶液加入量在300～400μL內(nèi)，它對(duì)OFL熒光強(qiáng)度的影響不大。這是因?yàn)猷彵蕉兹┤芤杭尤肓繉?duì)體系pH的影響減弱了。綜合考慮，在加入鄰苯二甲醛溶液25μL時(shí)，SM 2衍生物和OFL的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。因此，選擇25μL作為鄰苯二甲醛溶液的加入量。

由圖2（c）可知，在0～44 min內(nèi)，隨著時(shí)間的增加，SM 2衍生物的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，在44 min后，其熒光強(qiáng)度保持穩(wěn)定。此外，在0～30 min內(nèi)，隨著時(shí)間的增加，OFL的熒光強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)；在30 min后，其熒光強(qiáng)度保持穩(wěn)定。綜合考慮，在30 min時(shí)，OFL的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大；在44 min時(shí)，SM 2衍生物的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，同時(shí)OFL的熒光強(qiáng)度并未減弱。因此，選擇在44 min采集熒光光譜。

圖2 不同條件對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.2 Effects of difference conditions on fluorescence intensity

3.3 預(yù)測(cè)模型建立及預(yù)測(cè)結(jié)果分析

含SM 2和OFL的雞肉提取液樣本共10個(gè)，采用1∶1的分配方案，預(yù)測(cè)集的數(shù)據(jù)都落在訓(xùn)練集的范圍之內(nèi)，訓(xùn)練集、預(yù)測(cè)集都由5個(gè)樣本組成，如表1所示。預(yù)測(cè)模型的性能用預(yù)測(cè)集進(jìn)行驗(yàn)證，擬合真實(shí)值與預(yù)測(cè)值之間的線性關(guān)系。

表1 雞肉中SM 2和OFL殘留的樣本統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab.1 Statistical results of samples of SM 2 and OFL residues in chicken

3.3.1 基于峰高法的預(yù)測(cè)模型

圖3（a）為雞肉中不同濃度SM 2殘留和對(duì)應(yīng)的熒光激發(fā)峰強(qiáng)度（Δλ=150 nm，熒光激發(fā)峰為292.5 nm）之間的線性關(guān)系。由圖可知，基于峰高法的SM 2殘留的工作曲線具有良好的線性關(guān)系，線性方程為y=0.5505x+18.884，為0.9194。由圖3（c）可知，真實(shí)值與預(yù)測(cè)值之間的為0.8973，RMSEP為6.0605 mg/kg。對(duì)預(yù)測(cè)集樣本進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，樣本回收率處于76.1%～115.2%之間，RSD處于2.7%～7.0%之間（見(jiàn)表2）。

圖3 基于峰高法的雞肉中SM 2和OFL殘留的工作曲線和預(yù)測(cè)集樣本關(guān)系Fig.3 Working curves and relationship between actual and predicted values of SM 2 and OFL residues in prediction sam?ples in chicken by peak height algorithm

圖3（b）為雞肉中不同濃度OFL殘留和對(duì)應(yīng)的熒光激發(fā)峰強(qiáng)度（Δλ=210 nm，熒光激發(fā)峰為295 nm）之間的線性關(guān)系。由圖可知，基于峰高法的OFL殘留的工作曲線具有良好的線性關(guān)系，線 性 方 程 為y=7.7838x+15.919，R2

T為0.9738。由圖3（d）可知，真實(shí)值與預(yù)測(cè)值之間的為0.9973，RMSEP為0.5392 mg/kg。對(duì)預(yù)測(cè)集樣本進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，樣本回收率處于96.7%～110.1%之間，RSD處于2.8%～10.0%之間（見(jiàn)表2）。

表2 基于峰高法的雞肉中SM 2和OFL殘留的預(yù)測(cè)結(jié)果Tab.2 Prediction results of SM 2 and OFL residues in chicken by peak height algorithm

3.3.2 基于峰面積法的預(yù)測(cè)模型

圖4（a）為雞肉中不同SM 2殘留和對(duì)應(yīng)的熒光激發(fā)峰面積（Δλ=150 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為270～315 nm）之間的線性關(guān)系。由圖可知，基于峰面積法的雞肉中SM 2殘留的工作曲線具有良好的線性關(guān)系，線性方程為y=20.508x+870.12，為0.8328。由圖4（c）可知，真實(shí)值與預(yù)測(cè)值之間的R2

P為0.7281，RMSEP為11.2770 mg/kg。對(duì)預(yù)測(cè)集樣本進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，回收率處于56.3%～127.4%之間，RSD處于2.5%～6.6%之間（見(jiàn)表3）。

對(duì)比基于峰高法和峰面積法的雞肉中SM 2殘留預(yù)測(cè)模型可知，基于峰高法的預(yù)測(cè)模型比基于峰面積法的預(yù)測(cè)模型的和大，分別大了0.0866和0.1692，表明采用峰高法可以有效地提高預(yù)測(cè)模型的線性關(guān)系，提高預(yù)測(cè)集的真實(shí)值和預(yù)測(cè)值之間的線性關(guān)系。基于峰高法的預(yù)測(cè)模型比基于峰面積法的預(yù)測(cè)模型的回收率的上、下限值更接近100%，此外，基于峰高法的預(yù)測(cè)模型比基于峰面積法的預(yù)測(cè)模型的RMSEP減小了5.2165 mg/kg，表明采用峰高法可以顯著提高預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確度?；诜甯叻ê突诜迕娣e法的預(yù)測(cè)模型的RSD均小于7%，表明采用這兩種算法分析數(shù)據(jù)，預(yù)測(cè)模型均具有良好的精密度。

圖4（b）為雞肉中不同OFL殘留和對(duì)應(yīng)的熒光激發(fā)峰面積（Δλ=210 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為275～315 nm）之間的線性關(guān)系。由圖可知，基于峰面積法的雞肉中OFL殘留的工作曲線具有良好的線性關(guān)系，線性方程為y=238.07x+505.57，為0.9748。由圖可知，真實(shí)值與預(yù)測(cè)值之間的為0.9965，RMSEP為0.6060 mg/kg。對(duì)預(yù)測(cè)集樣本進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，回收率處于96.7%～113.5%之間，RSD處于2.9%～9.9%之間（見(jiàn)表3）。

表3 基于峰面積法的雞肉中SM 2和OFL殘留的預(yù)測(cè)結(jié)果Tab.3 Prediction results of SM 2 and OFL residues in chicken by peak area algorithm

圖4 基于峰面積法的雞肉中SM 2和OFL殘留的工作曲線和預(yù)測(cè)集樣本關(guān)系Fig.4 Working curves and relationship between actual and predicted values of SM 2 and OFL residues in chicken in predic?tion samples by peak area algorithm

對(duì)比基于峰高法和峰面積法的雞肉中OFL殘留預(yù)測(cè)模型可知，基于峰高法和基于峰面積法的預(yù)測(cè)模型的和相差很小，表明采用峰高法和峰面積法建立的預(yù)測(cè)模型都具有良好的線性關(guān)系且差異不大，此外，預(yù)測(cè)集的真實(shí)值和預(yù)測(cè)值之間也都具有良好的線性關(guān)系且差異不大。基于峰高法的預(yù)測(cè)模型比基于峰面積法的預(yù)測(cè)模型的回收率上限值要更接近100%，且預(yù)測(cè)模型的RMSEP要小0.0668 mg/kg，表明采用峰高法能夠提高預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確度?；诜甯叻ê突诜迕娣e法的預(yù)測(cè)模型的RSD均小于10%，表明采用這兩種方法建立的預(yù)測(cè)模型均具有良好的精度。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選峰高法建立雞肉中SM 2和OFL殘留的預(yù)測(cè)模型，檢測(cè)雞肉中SM 2和OFL殘留的檢出限分別可達(dá)2.5 mg/kg和1.25 mg/kg，能夠滿足雞肉中SM 2和OFL殘留快速同時(shí)檢測(cè)的要求。

4 結(jié)論

本文采用同步熒光技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，提出了雞肉中SM 2和OFL殘留快速檢測(cè)方法。首先，分析了SM 2標(biāo)準(zhǔn)溶液、OFL標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白雞肉提取液和含SM 2和OFL的雞肉提取液的三維同步熒光光譜，確定Δλ/激發(fā)波長(zhǎng)為150/292.5 nm（SM 2）和210/295 nm（OFL）。其次，采用單因素實(shí)驗(yàn)研究了β-巰基乙醇加入量、鄰苯二甲醛加入量和時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響，得到了最佳檢測(cè)條件：β-巰基乙醇加入量為300μL、鄰苯二甲醛加入量為25μL和時(shí)間為44 min。最后，比較了基于峰高法和峰面積法的預(yù)測(cè)模型性能，選擇了基于峰高法的預(yù)測(cè)模型作為分析模型?；诜甯叻ǖ腟M 2殘留預(yù)測(cè)模型的真實(shí)值與預(yù)測(cè)值之間的RMSEP為6.0605 mg/kg，回 收 率 為76.1%～115.2%，RSD為2.7%～7.0%?；诜甯叻ǖ腛FL殘留預(yù)測(cè)模型的真實(shí)值與預(yù)測(cè)值之間的RMSEP為0.5392 mg/kg，回 收 率 為96.7%～110.1%，RSD為2.8%～10.0%。由此表明，該方法可以滿足快速檢測(cè)雞肉中SM 2和OFL殘留的需求。