楊思德，常興平，潘政，李明堂，翁莉萍，李永濤，趙麗霞*

（1.吉林農業(yè)大學資源與環(huán)境學院，長春130118；2.農業(yè)農村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所農田有機污染生物消減創(chuàng)新團隊，農業(yè)農村部產地環(huán)境污染防控重點實驗室/天津市農業(yè)環(huán)境與農產品安全重點實驗室，天津300191；3.華南農業(yè)大學資源環(huán)境學院，廣州510642）

抗生素在畜禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中起重要作用，廣泛用于預防畜禽疾病、促進動物生長發(fā)育和提高畜禽產品質量等[1]。然而，進入到動物體內的抗生素只有少部分被吸收利用，大約90%的抗生素以母體或代謝物的形式通過糞便和尿液進入到畜禽糞肥和自然環(huán)境中[2]。研究報道，中國每年大約有5.38萬t的抗生素隨動物糞肥等進入到水體和土壤環(huán)境中[3]。金霉素作為當前用量最大的四環(huán)素類抗生素之一，近年來在土壤中被廣泛檢出，研究表明施用畜禽糞肥的農用土壤中金霉素濃度高達33.10～5 325μg·kg-1[4]，其中部分地區(qū)檢出濃度嚴重超出歐盟委員會設立的風險應激閾值（100μg·kg-1），對生態(tài)環(huán)境造成潛在風險[5]。土壤中金霉素的半衰期為6.2～28.8 d不等，有的甚至長達157.5 d，這表明其可能會長期殘留在土壤中[6]。殘留的抗生素一方面直接抑制土壤微生物活性，導致一些微生物種群及其生態(tài)功能的消失；另一方面會誘導土壤中抗生素抗性細菌增殖擴散，從而以多種方式破壞土壤微生物群落結構和功能[7]。此外，進入土壤中的金霉素能誘導土壤中微生物擴增抗生素抗性基因，也可以在農產品內富集，并通過食物鏈進入人體，對人類生命健康造成潛在的不良影響[8-9]。因此，開展關于土壤中抗生素和抗性基因的去除、抗生素污染土壤微生物群落結構與功能的恢復和提升的研究十分必要。

蚯蚓作為土壤中生物量最大的無脊椎生物，其對土壤肥力和結構有重要的影響作用，可通過掘穴、蠕動、進食和排便等活動，改變土壤理化性質和微生物群落，為土壤中污染物的去除提供有利的環(huán)境條件[10]。大量研究表明，蚯蚓可以加速土壤中許多有機污染物的降解，如農藥、多環(huán)芳烴和多氯聯(lián)苯等[11-13]。目前，關于蚯蚓對抗生素污染土壤影響的研究主要集中在對其總量的去除和抗生素抗性基因豐度削減方面[14-15]，而在此過程中，蚯蚓對土壤酶活性和微生物群落的影響研究十分稀少。土壤酶作為土壤的重要組分，參與了土壤中污染物的降解、有機質的礦化和養(yǎng)分元素循環(huán)等生物化學過程；同時，微生物是土壤酶的重要來源之一，土壤酶活性的變化一定程度上反映土壤微生物群落結構的變化[6]。僅有的一篇蚯蚓對抗生素污染土壤中酶活性和微生物群落影響的研究表明，蚯蚓是通過影響土壤pH和胡敏酸含量等促進四環(huán)素污染土壤酶活性的提升[16]，然而針對蚯蚓對抗生素污染土壤微生物群落的影響無深入探究。此外，有研究表明，相對于四環(huán)素，土壤中金霉素的殘留及生態(tài)風險更高[4]。因此，探討蚯蚓對金霉素污染土壤酶活性以及微生物群落的影響具有重要意義。本研究選取了威廉環(huán)毛蚓和赤子愛勝蚓兩種不同生態(tài)型的蚯蚓為實驗生物，通過土壤酶試劑盒（微板法）和高通量測序等方法分析土壤酶活性和微生物多樣性，揭示不同類型蚯蚓對金霉素污染土壤酶活性、微生物群落結構以及物種組成等方面的影響，以期為利用蚯蚓修復和改善抗生素污染土壤質量提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗土壤為潮土，采自天津市東麗區(qū)玉米田。土樣在實驗室自然風干后，過2 mm篩備用。土壤中未檢測到金霉素。供試土壤基本理化性質：土壤pH為8.19，有機質含量為36.0 g·kg-1，堿解氮含量為73.6 mg·kg-1，速效磷含量為28.7 mg·kg-1，速效鉀含量為148.0 mg·kg-1。供試蚯蚓威廉環(huán)毛蚓（內層蚓）和赤子愛勝蚓（表層蚓）均購買于蚯蚓養(yǎng)殖廠（江蘇省句容市）。實驗前兩種蚯蚓在供試土壤中馴化30 d，實驗時挑選健康、帶有環(huán)帶的蚯蚓，用無菌水清洗表面后放置于裝有濕潤濾紙的干凈燒杯中24 h，使其排出體內糞便。

金霉素（純度≥93%）購自Dr.Ehrenstorfer公司（德國），甲醇（色譜純）購自Fisher公司（美國），其他試劑均為分析純。

1.2 實驗設計

實驗設置7個處理組：CK，空白土壤；L，土壤+0.50 mg·kg-1金霉素；ML，土壤+0.50 mg·kg-1金霉素+威廉環(huán)毛蚓；EL，土壤+0.50 mg·kg-1金霉素+赤子愛勝蚓；H，土壤+15 mg·kg-1金霉素；MH，土壤+15 mg·kg-1金霉素+威廉環(huán)毛蚓；EH，土壤+15 mg·kg-1金霉素+赤子愛勝蚓；每個處理3個平行。將5條威廉環(huán)毛蚓（總質量約10 g）和35條赤子愛勝蚓（總質量約10 g）放入到對應裝有1 kg土壤的燒杯中，添加蚯蚓的數(shù)量參照Pu等[14]的研究。金霉素儲備液的配制方法如下：取250 mg金霉素，溶解于甲醇中，并用甲醇定容至25 mL，配制成10 000 mg·L-1的金霉素溶液A；再吸取0.5 mL溶液A，用甲醇稀釋至5 mL，配制成1 000 mg·L-1的金霉素溶液B。吸取1.5 mL溶液A和0.5 mL溶液B分別加入到對應的處理組土壤中，待溶劑充分揮發(fā)后，混合均勻。用去離子水調節(jié)土壤含水量為25%，燒杯口用帶小孔的錫紙封住，室溫環(huán)境下培養(yǎng)28 d。實驗過程中每隔2 d加入去離子水保持土壤含水量穩(wěn)定。在第1、7、14、28 d收集土壤樣品，樣品凍干研磨過篩后用于土壤脫氫酶、過氧化氫酶、蔗糖酶、脲酶和堿性磷酸酶的測定，同時測定第28 d土壤樣品中的金霉素殘留量和土壤理化指標（pH和有機質）。

1.3 土壤酶活性測定

脫氫酶活性的測定：采用四氮唑鹽還原法。用四氮唑鹽作為脫氫酶的氫受體，反應生成黃色甲臜物質，該物質易溶于水，于460 nm處測定其吸光值，可得出土壤脫氫酶的活性，單位為μg·d-1·g-1。

過氧化氫酶活性的測定：土壤中過氧化氫酶可以催化一部分過氧化氫產生水和氧氣，而另一部分過氧化氫與一種高靈敏顯色探針反應生成紫色物質，其在510 nm處有最大吸收峰。通過計算過氧化氫的減少量得出土壤中過氧化氫酶的活性，單位為μmol·h-1·g-1。

蔗糖酶活性的測定：采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法。土壤蔗糖酶催化蔗糖降解生成還原糖，然后與DNS生成有色氨基化合物，該物質在540 nm處有特征光吸收。在一定范圍內540 nm光吸收增加速率與土壤蔗糖酶活性成正比，進而得到土壤蔗糖酶活性，單位為mg·d-1·g-1。

脲酶活性的測定：采用靛酚藍比色法。脲酶水解產物為銨態(tài)氮，其可在強堿介質中與苯酚和次氯酸鹽反應生成水溶性染料靛酚藍。在578 nm處，靛酚藍有最大光吸收，其顏色深淺與溶液中的銨態(tài)氮含量成正比，進而計算出土壤脲酶活性大小，單位為μg·d-1·g-1。

堿性磷酸酶活性的測定：在堿性環(huán)境下，土壤堿性磷酸酶可以催化對硝基苯磷酸酯生成黃色的對硝基苯酚，其在405 nm處有最大吸收峰。通過計算405 nm下對硝基苯酚的增加速率，得出土壤堿性磷酸酶活性的大小，單位為nmol·h-1·g-1。

1.4 土壤中金霉素濃度測定

土壤中金霉素濃度的測定參照孟明輝等[17]的研究，在此基礎上做了一些改動。取2 g凍干土壤于50 mL離心管中，然后依次加入0.40 g乙二胺四乙酸二鈉鹽、10 mL乙腈和10 mL磷酸鹽緩沖液，渦旋混勻8 min（2 500 r·min-1）后，10 000 r·min-1離心10 min，轉移全部上清液于梨形瓶。重復上述過程1次，合并上清液。上清液于旋轉蒸發(fā)儀（40℃）蒸發(fā)至15 mL左右，過0.45μm尼龍濾膜，加入65 mL蒸餾水稀釋，并用甲酸調節(jié)pH至4，所得提取液進一步用PEP-2固相萃取小柱（500 mg/6 mL，博納艾杰爾科技有限公司，天津）凈化。過柱前，PEP-2柱用6.0 mL甲醇和6.0 mL蒸餾水活化。過柱后，用10 mL甲醇洗脫PEP-2柱。最后，用高純氮氣將洗脫液吹至近干，1.0 mL甲醇水（1∶1，V/V）復溶，過0.22μm尼龍濾膜于進樣小瓶，上機檢測。

金霉素的測定采用液相色譜-串聯(lián)質譜法（LCMS/MS，SCINEX QTRAP?4500，美國）。色譜柱為Waters UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7μm，美國），柱溫40℃。流動相：A為超純水+0.1%甲酸，B為甲醇+0.1%甲酸，進樣體積為5μL，流速為0.4 mL·min-1。采用多反應監(jiān)測模式（MRM）檢測目標物。電噴霧離子源（ESI）條件如下：離子源1和2的氣壓均為50 psi（1 psi=6 895 Pa），氣簾氣壓力為30 psi，離子源溫度為550℃，離子噴霧電壓為5 500 V，碰撞室入口和出口電壓分別為10 V和14 V。金霉素的定性和定量離子對以及對應的去簇電壓和碰撞能量見表1。采用加標法測定3種不同濃度金霉素（10、50、100 μg·kg-1）的回收率，回收率為72.1%～85.4%，變異系數(shù)為3.83%～9.58%。

1.5 土壤理化性質測定

土壤pH的測定：土壤pH采用電位法測定[16]。稱取2 g干土放入15 mL離心管，加入5 mL蒸餾水，渦旋混勻8 min（2 500 r·min-1），10 000 r·min-1離心10 min，取上清液用校準過的pH計測定。

土壤有機質的測定：有機質的測定采用重鉻酸鉀容量法（外加熱法）。在外加熱條件下（油浴溫度180℃，沸騰5 min），用一定濃度的重鉻酸鉀-硫酸溶液氧化土壤有機質，剩余的重鉻酸鉀用硫酸亞鐵溶液滴定，利用所消耗的重鉻酸鉀量計算土壤中有機質含量。

1.6 土壤細菌高通量分析

高通量測序步驟如下：（1）土壤DNA提?。旱?8 d的土壤樣品用試劑盒Power Soil DNA kit（Mobio，美國）提取DNA，然后用瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度和濃度，最后將DNA提取物稀釋至濃度為1 ng·μL-1。（2）擴增：對稀釋后的DNA進行PCR擴增，引物為16SrRNA基因的V4區(qū)（515F和806R）。（3）混樣和純化：將擴增反應產物按其濃度等體積混合，然后用2%瓊脂糖凝膠電泳測定，最后用膠回收試劑盒（Qiagen，德國）進行純化。（4）分析：純化后的DNA文庫構建和測序由諾禾致源公司（天津）完成。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS（Version 23.0）統(tǒng)計軟件對金霉素濃度、pH、土壤酶活性和理化性質在各處理組中的差異進行單因素方差分析（ANOVA，Duncan′s test，P＜0.05）；作圖軟件選用Origin 9.0；RDA（Redundancy analysis）分析選用Canoco 5.0。

2 結果與分析

2.1 金霉素污染土壤中酶活性的變化

在整個培養(yǎng)周期內，CK組中5種酶的活性波動較?。▓D1）。L組在第7 d和14 d時脫氫酶活性顯著低于CK組（P＜0.05），分別降低了32.5%和14.6%；在第1 d和28 d與CK組無顯著差異。在整個培養(yǎng)過程中，H組脫氫酶活性均低于CK組（P＜0.05），降低了15.2%～47.7%（圖1A）。與CK組相比，第1 d時，L和H組過氧化氫酶活性分別下降2.96%和5.43%（P＜0.05）；第14 d時，L組過氧化氫酶活性增加4.56%（P＜0.05）；第28 d時，H組過氧化氫酶活性增加2.88%（P＜0.05）（圖1B）。在第7 d和14 d時，L組蔗糖酶活性顯著低于CK組（P＜0.05），分別降低了10.1%和18.1%；第28 d時，L組中蔗糖酶活性回升到接近CK組水平；在整個培養(yǎng)期內，H組蔗糖酶活性顯著低于CK組（P＜0.05），降低17.1%～31.0%（圖1C）。在第1～14 d，L組中脲酶活性顯著低于CK組（P＜0.05），降低23.2%～41.3%；在整個培養(yǎng)周期內，H組中脲酶活性顯著低于CK組（P＜0.05），降低23.5%～55.0%（圖1D）。L組在第7 d和14 d時堿性磷酸酶活性顯著低于CK（P＜0.05），分別降低6.06%和11.3%，第28 d時活性與CK組無顯著差異；在整個培養(yǎng)周期內，H組堿性磷酸酶活性均顯著低于CK組，降低幅度為5.28%～26.3%（圖1E）。

2.2 蚯蚓介入后金霉素污染土壤中酶活性的變化

在本研究中，威廉環(huán)毛蚓和赤子愛勝蚓的存活率分別為100%和89.2%。與接種前相比，28 d時蚯蚓的生物量下降了17.9%～36.2%（表2）。與L組相比，在第7 d時，ML與EL組脫氫酶的活性提高最顯著，分別增加了73.7%和77.0%；與H組相比，在第7 d時MH組脫氫酶的活性提高最顯著，增加了77.8%，第14 d時EH組脫氫酶的活性提高最顯著，增加了88.5%（圖1A）。在第1～28 d，ML組中過氧化氫酶的活性均高于L組，其中第1 d時ML組過氧化氫酶活性提高最顯著（P＜0.05），增加了4.00%；在第1 d和7 d，EL組的過氧化氫酶活性顯著高于L組（P＜0.05），分別增加6.16%和4.70%；在第1 d，MH組與EH組過氧化氫酶的活性都顯著高于H組（P＜0.05），分別增加3.08%和4.02%；隨著培養(yǎng)時間的延長，蚯蚓對過氧化氫酶活性的激活作用逐漸減弱，培養(yǎng)結束時，MH和EH組的過氧化氫酶活性與H組差異不顯著（圖1B）。在第7～28 d，ML和EL組中蔗糖酶的活性顯著高于L組（P＜0.05），分別增加了15.0%～72.6%和15.8%～69.2%。在第7～28 d，MH組中蔗糖酶的活性顯著高于H組（P＜0.05），增加30.0%～36.3%；在第7 d和14 d時，EH組蔗糖酶活性顯著高于H組（P＜0.05），分別增加31.9%和29.1%（圖1C）。在整個培養(yǎng)周期內，ML組脲酶活性都顯著高于L組（P＜0.05），在第28 d時，ML組中脲酶活性最高，為2.13μg·d-1·g-1；在第1、14 d和28 d時，EL組脲酶活性都顯著高于L組（P＜0.05），增加30.9%～42.3%。在第1～28 d，MH組脲酶活性都顯著高于H組（P＜0.05），增加27.8%～37.9%；在第1～14 d，EH組脲酶活性都顯著高于H組（P＜0.05），增加了19.6%～48.8%（圖1D）。在第7 d和28 d，ML組堿性磷酸酶活性顯著低于L組（P＜0.05），分別降低5.00%和7.74%；在第14 d和28 d，EL組堿性磷酸酶活性都顯著低于L組（P＜0.05），分別降低5.84%和8.31%；在第14 d和28 d，MH和EH組都顯著低 于H組（P＜0.05），分 別 降 低10.9%～23.8%和14.6%～25.0%（圖1E）。

表1金霉素測定的質譜參數(shù)Table 1 Massspectrometric parameters of chlortetracycline determination

2.3 金霉素和蚯蚓介入后土壤細菌群落結構和組成的變化

根據(jù)不同處理土壤中OTUs的組成，對所有處理組進行了PCoA分析（圖2）。由PCoA分析可看出，試驗結束時，自然土（CK）與添加金霉素處理的2個處理組（L與H）明顯分開；與L組相比，H組距CK的距離更遠。這些結果表明金霉素可以改變土壤的細菌群落結構，且濃度越大，影響作用越顯著。加入蚯蚓的4個處理組與金霉素的2個處理組明顯分開；威廉環(huán)毛蚓處理組（ML和MH）與赤子愛勝蚓處理組（EL和EH）也明顯分開，而EL和EH相聚較近，ML與MH聚在一起。這表明蚯蚓的加入顯著改變了金霉素污染土壤中細菌群落的結構，且蚯蚓的種類不同影響結果也有差異。

圖3為第28 d相對豐度排名前10的門水平細菌柱狀圖。各處理組土壤中的優(yōu)勢菌門為變形菌門（Proteobacteria）占比38.8%～45.1%、酸桿菌門（Acido-bacteria）占比10.2%～17.4%、擬桿菌門（Bacteroidetes）占比5.13%～16.7%、放線菌門（Actinobacteria）占比7.25%～10.4%、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）占比4.30%～9.40%。金霉素的加入提高了土壤中Proteobacteria和Bacteroidetes的豐度。加入蚯蚓后，土壤中Proteobacteria和Bacteroidetes的相對豐度進一步提高。與L組相比，ML和EL組中Proteobacteria的相對豐度分別增加2.39%和0.83%，Bacteroidetes的相對豐度分別增加198%和75.8%；與H組相比，MH和EH組中Proteobacteria的相對豐度分別增加14.1%和11.5%，Bacteroidetes的相對豐度分別增加165%和69.0%。與Proteobacteria和Bacteroidetes的相對豐度變化不同，金霉素的加入降低了Acidobacteria和Gemmatimonadetes的相對豐度，且金霉素濃度越高下降幅度越大。加入蚯蚓后，Acidobacteria和Gemmatimonadetes的相對豐度進一步降低。與L組相比，ML與EL組中Acidobacteria的相對豐度分別下降38.5%和23.1%，Gemmatimonadetes的相對豐度分別下降44.4%和17.0%；與H組相比，MH與EH組中Acidobacteria的相對豐度分別降低35.8%和19.0%，Gemmatimonadetes的相對豐度分別降低44.0%和11.2%。低濃度金霉素對Actinobacteria的相對豐度無明顯影響，高濃度金霉素使Actinobacteria的相對豐度增加了3.38%。加入蚯蚓后，Actinobacteria的相對豐度降低。與L組相比，ML與EL組中Actinobacteria的相對豐度分別下降17.2%和14.6%；與H組相比，MH與EH組中Actinobacteria的相對豐度分別下降22.7%和30.0%。以上結果表明，蚯蚓的加入未改變土壤中的優(yōu)勢菌門組成，但明顯改變了其各自的豐度。

表2蚯蚓在第28 d時的生物量Table 2 The biomass of earthworms at the 28th day

為了進一步分析金霉素和蚯蚓對土壤中微生物屬水平的影響，列舉了第28 d相對豐度排名前15的屬（圖4）。結果顯示，金霉素處理后土壤中的優(yōu)勢菌屬組成未發(fā)生變化，但其相對豐度發(fā)生了變化。CK、L與H組中的優(yōu)勢菌屬為Sphingomonas、unidentified_Acidobacteria、Stenotrophobacter、Haliangium和unidentified_Nitrospiraceae，占 比9.58%～10.6%。與CK組相比，Sphingomonas的豐度在L組中增加了10.7%；Stenotrophobacter和Haliangium的豐度在H組分別降低了13.1%和15.1%。蚯蚓加入后土壤中優(yōu)勢菌屬發(fā)生了明顯的變化，同類型蚯蚓處理之間優(yōu)勢菌屬相同。ML和MH組中，F(xiàn)lavobacterium、Sphingomonas、Pseudomonas和unidentified_Acidobacteria為優(yōu)勢菌屬；EL和EH組中，Sphingomonas、unidentified_Acidobacteria、Flavobacterium和unidentified_Nitrospiraceae的豐度較高。LEfSe（LDA score＞3.5）分析可用于找出不同處理組間差異顯著的物種（圖5），相較于無蚯蚓的金霉素污染處理組，威廉環(huán)毛蚓處理組土壤中菌屬豐度顯著增加的是Flavobacterium、Pseudomonas、Aeromonas、Luteolibacter、Adhaeribacter和Lysobacter（P＜0.05）；赤子愛勝蚓處理組中豐度顯著升高的分別是Flavobacterium、Luteolibacter、Aeromonas、Adhaeribacter、Pseudomonas和unidentified_Nitrospiraceae（P＜0.05）。通 過 以 上 結 果 發(fā) 現(xiàn)，F(xiàn)lavobacterium，Aeromonas、Luteolibacter、Adhaeribacter和Pseudomonas的豐度在所有蚯蚓處理組中都顯著升高，在ML、EL、MH和EH中占比分別為17.2%、5.19%、14.8%和6.14%。

2.4 土壤中金霉素濃度和理化性質的變化

實驗結束時，土壤中金霉素的濃度和理化性質如表3所示。在第28 d時，ML組和EL組中的金霉素濃度分別為0.026 mg·kg-1和0.022 mg·kg-1，顯著低于L組（0.033 mg·kg-1）；MH組和EH組中的金霉素濃度分別為0.879 mg·kg-1和1.006 mg·kg-1，顯著低于H組（1.585 mg·kg-1）。此外，低、高濃度金霉素的加入對土壤pH均無顯著影響（P＞0.05）；兩種生態(tài)型蚯蚓的加入均顯著降低了土壤的pH（P＜0.05）。與CK相比，L和H組有機質含量略微增加。與L組相比，ML和EL組有機質含量分別降低23.5%和13.2%；與H組相比，MH和EH組有機質含量分別降低20.4%和8.81%。

2.5 土壤酶、細菌群落、金霉素殘留和土壤理化性質間的相關性

通過冗余分析探究土壤酶、細菌群落（被蚯蚓顯著刺激的屬）、金霉素和理化性質（pH和有機質）間的關系。圖6表明，軸1和軸2分別解釋了62.8%和7.43%的變異度，合計解釋了總變量的70.2%。脫氫酶、脲酶和蔗糖酶與pH、有機質和金霉素方向相反，呈負相關關系，與5種菌屬呈正相關關系。過氧化氫酶與金霉素呈正相關，與pH、有機質呈負相關，與5種菌屬呈正相關關系。堿性磷酸酶與pH、有機質呈正相關，與金霉素和5種菌屬呈負相關關系。

3 討論

3.1 蚯蚓對金霉素污染土壤酶活性的影響

土壤酶參與土壤中各種生物化學過程，是判斷土壤生物化學過程強度及評價土壤肥力的重要指標之一[18]。金霉素的加入抑制了土壤中脫氫酶、蔗糖酶、脲酶和堿性磷酸酶的活性，且濃度越高抑制效果越明顯，這與先前的研究結果一致[19-20]。造成這一結果的主要原因可能是金霉素作為細菌抑制劑，對土壤中的微生物有一定的毒害作用甚至使其失活，從而改變細菌的群落結構與功能[21]。PCoA分析結果也表明，金霉素污染土壤的細菌群落結構與無金霉素處理組明顯不同，但并不是所有土壤酶的活性都被金霉素抑制。本研究結果表明，金霉素可以促進土壤中過氧化氫酶的活性，可能原因是進入到土壤中的金霉素可以被一些耐受性高的微生物利用而豐度升高，從而導致土壤酶活性的提高，這也與Yang等[22]的研究結果類似。

表3第28 d不同處理組土壤中pH、金霉素濃度和有機質含量Table 3 pH，chlortetracycline concentration and organic matter content of soils in different treatments at the 28thday

蚯蚓的加入提高了土壤中脫氫酶、過氧化氫酶、蔗糖酶和脲酶的活性。脫氫酶和過氧化氫酶是表征土壤微生物總體活性的指標，金霉素的毒害作用導致土壤微生物活性降低，而蚯蚓的加入促進了金霉素的降解和轉化，從而削弱了毒害作用，促進了脫氫酶和過氧化氫酶的活性。蚯蚓還可以通過分泌體表黏液等方式對土壤酸堿性進行調節(jié)[23]。本研究選用的土壤為堿性土壤，蚯蚓的加入顯著降低了土壤的pH，為微生物的生長提供了適宜的環(huán)境，有利于金霉素污染土壤中酶活性的升高。在兩種濃度條件下，加入蚯蚓均使脫氫酶活性顯著提高，但由于低、高濃度條件下土壤中可利用的金霉素含量不同，使得蚯蚓對脫氫酶活性的影響程度也有所差異。實驗初期，因高濃度處理組整體微生物活性受到金霉素的抑制作用較大，脫氫酶的活性整體低于低濃度處理組，但由于蚯蚓的刺激作用，隨著時間的延長，高濃度處理組中越來越多的金霉素被微生物消耗利用，微生物活性逐漸恢復并超過低濃度處理組，因此在實驗后期（28 d時）高濃度蚯蚓處理組中脫氫酶的活性超過了低濃度蚯蚓處理組。加入蚯蚓對兩種濃度條件下過氧化氫酶活性的影響與脫氫酶類似，實驗初期高濃度處理組整體活性低于低濃度處理組，直至實驗后期兩種濃度條件下蚯蚓處理組中過氧化氫酶的活性基本相當。威廉環(huán)毛蚓和赤子愛勝蚓都以土壤中有機質為食，這與有機質的轉化和降解關系密切[24]。表3結果表明，兩種生態(tài)型蚯蚓都加速了土壤有機質的消耗，從而促進了與土壤碳轉化相關的蔗糖酶的活性。赤子愛勝蚓為表層蚓，體型小、吞土量少，主要以有機質為食；威廉環(huán)毛蚓屬內層蚓，體型較大、吞土量多，以落葉和深層有機質為食，因而更能促進與土壤碳轉化相關的蔗糖酶的活性。高濃度處理組金霉素可能對蚯蚓產生一定的毒性效應[25]，蚯蚓活性降低，攝食有機質能力減弱，有機質的消耗量減少（表3），因此對蔗糖酶活性的刺激作用與低濃度處理組相比較小。脲酶反映土壤氮素狀況，與土壤有效態(tài)氮含量呈正相關，蚯蚓可通過攝食土壤和排泄蚓糞等方式增加土壤中有機氮的礦化速度，導致無機氮含量的增加[26]。此外，我們發(fā)現(xiàn)威廉環(huán)毛蚓處理組中脲酶活性要略高于赤子愛勝蚓處理組。之前的研究發(fā)現(xiàn)脲酶活性與土壤團聚體粒徑關系密切，土壤團聚體粒徑增大，脲酶活性升高[27]。與表層蚓相比，內層蚓具有極強的擾動能力和腸道消化作用，導致形成的土壤團聚體粒徑較大和土壤透氣性增加[28-29]，這可以解釋威廉環(huán)毛蚓處理組脲酶活性高于赤子愛勝蚓處理組。與蔗糖酶結果一致，低濃度處理組蚯蚓對脲酶活性的促進作用更強。與上述4種酶活性變化不同，蚯蚓抑制了土壤堿性磷酸酶的活性。冗余分析結果表明，堿性磷酸酶活性與土壤有機質呈正相關關系。耿玉清等[30]研究發(fā)現(xiàn)堿性磷酸酶活性與有機質密切相關，增加土壤有機質含量可促進堿性磷酸酶的產生，是提高土壤中有效磷含量的重要途徑。因此，蚯蚓處理組土壤中有機質含量的降低，導致了堿性磷酸酶活性的下降。此外，有研究表明添加遠盲蚓可以顯著增加土壤中堿性磷酸酶的活性[31]，這可能與蚯蚓的種類、土壤類型、培養(yǎng)時間和外源添加組分等有關。

3.2 蚯蚓對金霉素污染土壤細菌群落的影響

與CK相比，金霉素的加入改變了土壤細菌群落結構，且濃度越高影響作用越大（圖2）。主要原因是金霉素作為一種廣譜性抗菌劑，對大部分細菌都有毒副作用，其進入到土壤中，會對土壤微生物造成一定的選擇性壓力，進而導致群落結構的變化[32]。Proteobacteria、Acidobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria和Gemmatimonadetes是金霉素污染土壤中的優(yōu)勢菌門。其中Proteobacteria、Bacteroidetes和Actinobacteria受到金霉素刺激而活性增強，且金霉素濃度越高刺激作用越強；Acidobacteria和Gemmatimonadetes受到金霉素抑制而活性降低，低濃度組抑制作用略強。之前的研究表明在抗生素污染的土壤中Actinobacteria、Proteobacteria和Bacteroidetes的豐度較高，對抗生素具有一定的耐受性[33-35]。此外，Proteobacteria和Actinobacteria也被證實是抗生素抗性基因的宿主菌門[36]。

與無蚯蚓處理組相比，蚯蚓處理組土壤中的細菌群落結構發(fā)生了顯著變化。低、高濃度金霉素污染土壤中Proteobacteria和Bacteroidetes的相對豐度經兩種蚯蚓刺激作用后均升高。Proteobacteria是所有處理組土壤中豐度最高的菌門，蚯蚓對其豐度的影響必將導致土壤細菌群落結構的改變，本研究表明低金霉素濃度條件下Proteobacteria受蚯蚓刺激程度較弱，而高濃度條件下受蚯蚓刺激作用顯著增強。有研究表明Proteobacteria對固定化微生物脫氮具有重要作用[37]。Bacteroidetes受兩種蚯蚓的刺激作用相對豐度上升比例最高，且低濃度處理組刺激作用更強。Bacteroidetes是一類具有極強分解能力的菌門，可以分解土壤營養(yǎng)物質，為土壤中酶促反應提供能量[38]。蚯蚓的加入刺激了土壤中Proteobacteria和Bacteroidetes的生長，從而有助于土壤中酶活性的增加。不同生態(tài)型蚯蚓處理組土壤中的細菌群落結構也有顯著差異，本實驗選用的兩種蚯蚓分別為表層蚓和內層蚓，不同的生存環(huán)境和食物偏好可能是導致這一現(xiàn)象的原因[39-40]。兩種濃度條件下，威廉環(huán)毛蚓對Proteobacteria和Bacteroidetes的促進效果都優(yōu)于赤子愛勝蚓，這一定程度上解釋了威廉環(huán)毛蚓處理組土壤中酶活性高于赤子愛勝蚓處理組的原因。蚯蚓加入后，土壤中Acidobacteria、Actinobacteria和Gemmatimonadetes豐度降低，且威廉環(huán)毛蚓對此3種菌門的抑制程度高于赤子愛勝蚓。造成這種結果的原因可能是這些菌群以土壤有機質作為碳源來抵御環(huán)境壓力[41]，然而喜好取食土壤有機質的蚯蚓加入后，與這些進食土壤有機質的菌群產生競爭，導致其豐度下降。本文的研究結果也表明在低、高濃度金霉素處理組中，威廉環(huán)毛蚓和赤子愛勝蚓的加入均顯著降低了土壤有機質含量（P＜0.05）。此外，高濃度金霉素處理組中蚯蚓對3種菌門的抑制作用相較于低濃度處理組有所減弱，可能是因為高濃度金霉素對蚯蚓活性產生一定的抑制作用，一定程度上減少了土壤有機質的消耗。

實驗結束時，與無蚯蚓處理組相比，蚯蚓處理組土壤中優(yōu)勢菌屬的組成也發(fā)生了明顯的改變，F(xiàn)lavobacterium、Aeromonas、Pseudomonas、Luteolibacter和Adhaeribacter在4個蚯蚓處理組豐度都顯著升高。此外，這5種菌屬在金霉素處理組的相對豐度也高于CK組（圖4），表明其可能是金霉素的潛在降解菌。RDA結果表明，土壤脫氫酶、過氧化氫酶、蔗糖酶和脲酶與上述金霉素降解菌屬呈正相關關系。脫氫酶是一種能催化土壤有機物質脫氫、使有機污染物降解的胞內酶，并與多種微生物的分泌活動相關[42-43]。金霉素降解菌的活性受蚯蚓刺激而增加，這可能導致了脫氫酶活性的增加，同時也會加速土壤中金霉素的降解。土壤中氮循環(huán)與有機污染物降解關系密切，含氮化合物作為微生物氮源與其生長繁殖直接相關，但微生物對土壤中不同形態(tài)氮的利用難易程度也不同。蚯蚓對氮循環(huán)的促進作用增加了土壤中易被微生物利用的氮素，促進了其活性[44]。Liang等[45]研究發(fā)現(xiàn)Pseudomonas可產生脲酶，圖5也顯示蚯蚓處理中Pseudomonas豐度大幅度增加，從而導致土壤中脲酶活性升高。土壤堿性磷酸酶與Flavobacterium、Aeromonas、Pseudomonas、Luteolibacter和Adhaeribacter呈負相關關系，說明蚯蚓處理組中堿性磷酸酶活性下降可能與金霉素降解菌活性升高有關。此外，有研究表明Flavobacterium有降解環(huán)丙沙星的潛力[14]；Aeromonas可以加速土壤中異丙甲草胺的降解[46]；Pseudomonas是土壤中土霉素和莠去津的主要降解者[47]。楊浩等[48]研究表明Luteolibacter是窖水中污染物微生物降解的重要細菌。蚯蚓處理組中這些菌屬豐度的升高，可能加速了土壤中金霉素的生物降解，減少了其對土壤中其他微生物的毒害作用，從而一定程度上導致了蚯蚓處理組中脫氫酶、過氧化氫酶、蔗糖酶和脲酶活性的升高。

土壤中蚯蚓種類眾多，在未來的工作中，可以在蚯蚓類型方面開展細化研究，篩選出改善污染土壤質量的最優(yōu)蚓種。另外，土壤酶與微生物的關系并非單一的、有規(guī)律的，而是多元多變的，因此還需借助宏基因組等技術手段，明確土壤微生物群落中差異物種的生態(tài)功能，進一步揭示蚯蚓對抗生素污染土壤酶活性和微生物群落的影響機制。

4 結論

金霉素的加入，使土壤中脫氫酶、蔗糖酶、脲酶和堿性磷酸酶的活性受到抑制，濃度越高抑制作用越明顯；過氧化氫酶活性被激活；土壤中的細菌群落發(fā)生演變。威廉環(huán)毛蚓和赤子愛勝蚓的加入均促進了金霉素污染土壤中脫氫酶、過氧化氫酶、蔗糖酶和脲酶的活性，其中威廉環(huán)毛蚓對脫氫酶、蔗糖酶和脲酶活性的促進作用優(yōu)于赤子愛勝蚓；堿性磷酸酶的活性則受到抑制。土壤pH、有機質含量、金霉素濃度和細菌群落結構是影響土壤酶活性變化的重要因子。

兩種蚯蚓均未改變金霉素污染土壤中的細菌優(yōu)勢菌門組成，但都改變了其豐度占比。在屬水平上，

Flavobacterium、Aeromonas、Luteolibacter、Adhaeribacter

和Pseudomonas等潛在金霉素降解菌被兩種蚯蚓刺激豐度顯著增加，從而加速了土壤中金霉素的降解。此外，兩種蚯蚓的加入均改變了金霉素污染土壤中的細菌群落結構，且蚯蚓種類不同影響作用也不同。