劉凱，陳修報(bào)，劉洪波，姜濤，楊健,*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214081；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江中下游漁業(yè)生態(tài)環(huán)境評(píng)價(jià)和資源養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫214081）

銅（Cu）是生物體必需的微量元素之一，在維持機(jī)體正常代謝、生長(zhǎng)發(fā)育和增強(qiáng)免疫力等方面有不可替代的作用[1]。然而，Cu也是目前我國(guó)淡水漁業(yè)生態(tài)環(huán)境中污染形勢(shì)最為嚴(yán)峻的重金屬[2]?！?018年中國(guó)漁業(yè)生態(tài)環(huán)境狀況公報(bào)》指出，我國(guó)江河天然重要漁業(yè)水域中Cu超標(biāo)面積占所監(jiān)測(cè)面積的8.7%（約4.4萬(wàn)hm2），Cu平均濃度為0.000 5～0.045 mg·L-1；湖泊、水庫(kù)重要漁業(yè)水域中Cu超標(biāo)面積占所監(jiān)測(cè)面積的14.9%（約21萬(wàn)hm2），Cu平均濃度為0.000 6～0.014 mg·L-1[2]。這勢(shì)必會(huì)威脅我國(guó)淡水水生生物安全以及人類(lèi)健康。值得注意的是，Cu雖然是貝類(lèi)等無(wú)脊椎動(dòng)物的多種酶及血藍(lán)蛋白的重要成分[3-4]，但是當(dāng)Cu積累超過(guò)一定閾值時(shí)，便會(huì)對(duì)貝類(lèi)等無(wú)脊椎動(dòng)物產(chǎn)生嚴(yán)重的毒性效應(yīng)[5]，甚至?xí)@著降低其子代對(duì)Cu的耐受性[6]。

背角無(wú)齒蚌（Anodonta woodiana）是我國(guó)特有物種，目前在亞洲、歐洲、北美洲和中美洲廣泛分布[7-10]。因其具有營(yíng)底棲生活（活動(dòng)范圍狹小）、對(duì)重金屬的高積累性[對(duì)重金屬的積累性較褶紋冠蚌（Cristaria plicata）、圓頂珠蚌（Unio douglasiae）、斑馬貽貝（Dreissena polymorpha）、三角帆蚌（Hypriosis cumingii）等貝類(lèi)更強(qiáng)]及低代謝性、體內(nèi)積累的重金屬含量與水環(huán)境中重金屬含量呈簡(jiǎn)單相關(guān)關(guān)系等優(yōu)勢(shì)，被篩選為“淡水貝類(lèi)觀察”研究體系[8-10]中的專(zhuān)用指示生物，已成功應(yīng)用于水污染監(jiān)測(cè)及毒理學(xué)研究[8-12]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，背角無(wú)齒蚌幼蚌較成蚌對(duì)重金屬（Cu、Cd）毒性更為敏感[12-13]，如Cu對(duì)幼蚌和成蚌的96 h-EC50分別為3.4 mg·L-1和22.1 mg·L-1，后者約是前者的7倍[12]。因此，背角無(wú)齒蚌幼蚌可能更適宜用于水環(huán)境Cu污染的毒性效應(yīng)研究。

組織切片在水生生物毒理學(xué)研究中應(yīng)用十分廣泛，是一種十分高效便捷的組織損傷研究技術(shù)。目前，有關(guān)Cu脅迫對(duì)背角無(wú)齒蚌抗氧化酶影響、細(xì)胞損傷和組織積累方面的研究較多[14-16]，然而組織切片的相關(guān)研究較少。因此本研究擬開(kāi)展Cu對(duì)背角無(wú)齒蚌幼蚌的毒性實(shí)驗(yàn)，進(jìn)而利用組織切片技術(shù)探究Cu對(duì)幼蚌鰓、斧足、外套膜和消化腺的組織損傷效應(yīng)，以期為淡水漁業(yè)生態(tài)環(huán)境Cu污染監(jiān)測(cè)模式動(dòng)物開(kāi)發(fā)以及水域生態(tài)環(huán)境污染評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

背角無(wú)齒蚌幼蚌（1齡），殼長(zhǎng)（6.4±0.4）cm，采自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心南泉實(shí)驗(yàn)基地，人工養(yǎng)殖以及水環(huán)境條件參考文獻(xiàn)[17]。

1.2 暴露實(shí)驗(yàn)

鑒于我國(guó)尚沒(méi)有淡水貝類(lèi)毒性實(shí)驗(yàn)研究的標(biāo)準(zhǔn)方法，本研究參照被廣泛認(rèn)可的美國(guó)“Standard guide for conducting laboratory toxicity tests with freshwater mussel”（ASTME2455-06）[18]開(kāi)展Cu對(duì)背角無(wú)齒蚌幼蚌的毒性暴露。

用刷子清洗幼蚌貝殼上的附著物，暫養(yǎng)2周以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)條件，每日投喂一次小球藻（Chlorella vulgaris），小球藻的投喂量為4×108個(gè)·L-1。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前3 d停止投喂，排空幼蚌腸道內(nèi)容物。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果，Cu對(duì)背角無(wú)齒蚌幼蚌的96 h半效應(yīng)濃度（96 h-EC50）為3.4 mg·L-1[12]，以及我國(guó)漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（GB 11607—1989）中Cu限量（0.01 mg·L-1），用人工配制軟水（pH值7.3～7.5、硬度40～48 mg·L-1、堿度30～35 mg·L-1）[18]配制5個(gè)濃度（2.0、1.0、0.1、0.01、0.005 mg·L-1）的暴露組和1個(gè)對(duì)照組（0 mg·L-1）溶液，每組設(shè)置3個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)在貝類(lèi)重金屬暴露系統(tǒng)中進(jìn)行，每個(gè)一次成型的玻璃缸中加入8 L溶液及16只幼蚌。實(shí)驗(yàn)期間不投喂餌料，水溫控制在（20±1）℃，光照和黑暗比為16 h∶8 h，光強(qiáng)為1 000 lx，溶氧量＞5.0 mg·L-1。為保持Cu濃度穩(wěn)定，每24 h將溶液全部更換。在24、48、72、96 h分別從各濃度組取3只幼蚌用于組織切片，并根據(jù)陳修報(bào)等[13]建立的背角無(wú)齒蚌幼蚌死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)（幼蚌雙殼張開(kāi)，用玻璃棒刺激不閉殼定義為死亡）監(jiān)測(cè)幼蚌存活情況，實(shí)驗(yàn)期間無(wú)幼蚌發(fā)生死亡。

1.3 組織切片與觀察

解剖出幼蚌的鰓、外套膜、斧足及消化腺，放于組織20倍體積的波恩氏液中固定3 h，之后將組織塊置于自來(lái)水下，流水過(guò)夜沖洗以去除固定液。用梯度乙醇（70%1 h、80%1 h、90%40 min、95%40 min、100%Ⅰ20 min、100%Ⅱ20 min）浸泡使組織脫水，用分析純二甲苯將組織依次透明兩次（每次透明10 min），二甲苯∶石蠟（1∶1）浸泡1 h，石蠟（62℃）浸蠟3 h，用ES300-1型包埋機(jī)（金華市華速科技有限公司）將組織包埋在石蠟塊中，并用HS-3345型全自動(dòng)切片機(jī)（金華市華速科技有限公司）切片，切片厚度為6μm，水浴鍋攤片，烘箱烘片，H.E染色（蘇木精染色5 min，1%鹽酸乙醇分色8 s，自來(lái)水返藍(lán)10 min，伊紅染色45 s），中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。本文參照李陽(yáng)等[19]和Otludil等[20]報(bào)道的方法，以損傷效應(yīng)最為明顯的暴露96 h的蚌組織切片圖體現(xiàn)各類(lèi)組織結(jié)構(gòu)的變化。

1.4 Cu濃度的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前取各濃度組水樣30 mL用于測(cè)定Cu實(shí)際濃度。使用7500ce型ICP-MS（Agilent，美國(guó)）測(cè)定Cu濃度，通過(guò)元素標(biāo)準(zhǔn)添加回收法確定測(cè)定精度（Cu回收率為108.4%）。實(shí)際測(cè)得的Cu濃度為2.1、1.0、0.1、0.01、0.003 mg·L-1。由于實(shí)際濃度和理論濃度總體很接近，因此本研究應(yīng)用理論濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cu脅迫對(duì)鰓組織結(jié)構(gòu)的影響

背角無(wú)齒蚌的鰓主要由排列緊密的鰓絲構(gòu)成。對(duì)照組鰓絲結(jié)構(gòu)完整，鰓絲之間由絲間隔相連，其表面覆蓋有大量纖毛，鰓絲內(nèi)部由結(jié)締組織以及各種血細(xì)胞組成（圖1 A）。經(jīng)24 h暴露，各濃度組鰓組織均未出現(xiàn)明顯組織損傷。經(jīng)48 h暴露，0.1 mg·L-1暴露組開(kāi)始出現(xiàn)色素細(xì)胞增多，且色素細(xì)胞數(shù)量隨著Cu濃度增加而逐漸增多；2.0 mg·L-1暴露組開(kāi)始出現(xiàn)部分纖毛脫落。經(jīng)72 h暴露，0.01 mg·L-1暴露組開(kāi)始出現(xiàn)色素細(xì)胞增多；1.0 mg·L-1暴露組開(kāi)始出現(xiàn)少量細(xì)胞空泡化和部分纖毛脫落；2 mg·L-1暴露組開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞壞死。經(jīng)96 h暴露，0.01 mg·L-1暴露組色素細(xì)胞顯著增多且細(xì)胞出現(xiàn)空泡化（圖1C）；0.1 mg·L-1暴露組開(kāi)始出現(xiàn)部分纖毛脫落且巨噬細(xì)胞增多（圖1D）；1.0 mg·L-1暴露組巨噬細(xì)胞持續(xù)增多，細(xì)胞空泡化和纖毛脫落加?。▓D1E）；2.0 mg·L-1暴露組鰓絲結(jié)構(gòu)出現(xiàn)萎縮，纖毛脫落和細(xì)胞空泡化嚴(yán)重，結(jié)締組織發(fā)生糜爛壞死（圖1F）。

2.2 Cu脅迫對(duì)斧足組織結(jié)構(gòu)的影響

斧足是背角無(wú)齒蚌的運(yùn)動(dòng)器官，主要由肌細(xì)胞組成，還存在一些色素細(xì)胞、黏液細(xì)胞及上皮細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照組斧足組織結(jié)構(gòu)完整，肌細(xì)胞排列密集、核染色清晰，上皮細(xì)胞排列緊密，表面覆蓋有大量纖毛（圖2A）。經(jīng)24 h暴露，各濃度組斧足均未出現(xiàn)明顯組織損傷。經(jīng)48 h暴露，1.0 mg·L-1暴露組開(kāi)始出現(xiàn)黏液細(xì)胞變形；2.0 mg·L-1暴露組開(kāi)始出現(xiàn)黏液細(xì)胞變形以及上皮層損傷。經(jīng)72 h暴露，1.0 mg·L-1暴露組黏液細(xì)胞變形加重；2.0 mg·L-1暴露組黏液細(xì)胞變形且上皮層損傷加重。經(jīng)96 h暴露，0.005mg·L-1和0.01 mg·L-1暴露組的斧足均未出現(xiàn)明顯損傷（圖2B和圖2C）；0.1 mg·L-1暴露組開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞空泡化及上皮層損傷（圖2D）；1.0 mg·L-1暴露組細(xì)胞空泡化以及上皮層損傷進(jìn)一步加重（圖2E）；2.0 mg·L-1暴露組上皮層損傷和細(xì)胞空泡化嚴(yán)重，空泡相互連接導(dǎo)致表皮細(xì)胞處出現(xiàn)斷連，從而無(wú)法維持正常的組織形態(tài)（圖2F）。

2.3 Cu脅迫對(duì)外套膜組織結(jié)構(gòu)的影響

外套膜主要由內(nèi)、外單層表皮及結(jié)締組織組成，結(jié)締組織中分布著色素細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及少量肌細(xì)胞。對(duì)照組外套膜組織結(jié)構(gòu)始終保持完整，內(nèi)外上皮層細(xì)胞排列緊密，表面覆蓋有大量纖毛，少量色素細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均勻地分布在結(jié)締組織中（圖3A）。經(jīng)24 h暴露，0.01 mg·L-1暴露組開(kāi)始出現(xiàn)色素細(xì)胞增多，且色素細(xì)胞數(shù)量隨暴露濃度的增加而增多。經(jīng)過(guò)48 h和72 h暴露，各濃度組色素細(xì)胞持續(xù)增多。經(jīng)96 h暴露，0.01 mg·L-1暴露組色素細(xì)胞和巨噬細(xì)胞顯著增多（圖3C），0.1、1.0、2.0 mg·L-1暴露組色素細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量隨著暴露濃度的升高而增加（圖3D至圖3F）；2.0 mg·L-1暴露組開(kāi)始出現(xiàn)上皮層損傷（圖3F）。

2.4 Cu脅迫對(duì)消化腺組織結(jié)構(gòu)的影響

消化腺由消化小管、結(jié)締組織和淋巴區(qū)域組成。對(duì)照組消化腺組織結(jié)構(gòu)始終保持完整，小管上皮排列整齊，結(jié)締組織充盈（圖4A）。經(jīng)24、48、72 h暴露，各濃度組消化腺均未出現(xiàn)明顯組織損傷。然而，經(jīng)過(guò)96 h暴露，0.01 mg·L-1暴露組開(kāi)始出現(xiàn)小管上皮細(xì)胞變形、淋巴區(qū)域擴(kuò)大以及結(jié)締組織萎縮（圖4C）；0.1、1.0、2.0 mg·L-1暴露組開(kāi)始出現(xiàn)小管上皮細(xì)胞變形以及結(jié)締組織萎縮（圖4D至圖4F）。

3 討論

Cu是生物必需元素，參與合成多種酶。然而，當(dāng)Cu在生物體富集超過(guò)一定的閾值，就會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生嚴(yán)重的毒害作用。當(dāng)Cu濃度達(dá)到0.005～0.01 mg·L-1時(shí)，就可能對(duì)無(wú)脊椎動(dòng)物產(chǎn)生毒性[21]。需要高度重視的是，我國(guó)江河、湖泊、水庫(kù)等重要漁業(yè)水域中Cu平均濃度為0.000 5～0.045 mg·L-1[2]，超標(biāo)率為8.7%（江河）～14.9%（湖泊、水庫(kù)）[2]，而養(yǎng)殖池塘中Cu濃度更是可高達(dá)2.0 mg·L-1[22]。本研究結(jié)果表明，當(dāng)Cu濃度達(dá)到0.01 mg·L-1時(shí)，便會(huì)對(duì)背角無(wú)齒蚌幼蚌的鰓、外套膜和斧足產(chǎn)生明顯的組織損傷，且損傷程度隨著Cu濃度的升高和暴露時(shí)間的延長(zhǎng)不斷加重。值得注意的是，不同組織的損傷程度有明顯差異，這可能與不同組織對(duì)元素積累具有特異性有關(guān)[23]。這與尖膀胱螺（Physa acuta）經(jīng)Cu暴露的組織損傷結(jié)果相似[20]。

3.1 Cu對(duì)鰓的組織損傷效應(yīng)

隨著Cu濃度的增加，鰓出現(xiàn)色素細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增多、細(xì)胞空泡化、鰓絲萎縮以及結(jié)締組織糜爛等現(xiàn)象。巨噬細(xì)胞增多一方面可以抵抗Cu對(duì)機(jī)體造成的損傷，另一方面其過(guò)量釋放的酶也會(huì)破壞正常的組織結(jié)構(gòu)、造成組織糜爛等現(xiàn)象。陳彩芳等[24]在以Cd脅迫泥蚶（Tegillarca granosa）的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果。對(duì)紫貽貝（Mytilusedulis）鰓的研究也表明，Cu脅迫會(huì)引起鰓組織發(fā)生炎癥反應(yīng)，造成血細(xì)胞增多、鰓絲膨大等現(xiàn)象[25]。李雨奎[26]研究發(fā)現(xiàn)，背角無(wú)齒蚌鰓受高濃度Cu脅迫會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞空泡化和鰓絲受損嚴(yán)重的現(xiàn)象。相較于外套膜、消化腺和斧足，鰓是本實(shí)驗(yàn)中受損傷最嚴(yán)重的組織。這可能與該器官

的特殊功能有關(guān)，鰓是主要的呼吸和濾水器官且與水體中的重金屬離子接觸最為頻繁。水環(huán)境中的Cu可以通過(guò)離子通道主動(dòng)運(yùn)輸、被動(dòng)擴(kuò)散或者與金屬結(jié)合蛋白結(jié)合等途徑轉(zhuǎn)運(yùn)到鰓中。Romeo等[27]研究表明Ruditapes decussatus的鰓對(duì)Cu的積累顯著大于消化腺等其他器官。井維鑫[28]研究發(fā)現(xiàn)，鰓是背角無(wú)齒蚌Cd積累量最高的器官之一。在對(duì)花鰍（Cobitis taenia）的研究中發(fā)現(xiàn)，鰓和肝臟的Cu積累量隨Cu濃度的增加而增加，且鰓積累量大于肝臟積累量[29]。綜上所述，鰓可能是背角無(wú)齒蚌幼蚌主要的Cu富集器官之一且對(duì)Cu毒性靈敏，適宜用作淡水漁業(yè)生態(tài)環(huán)境Cu污染監(jiān)測(cè)和毒性評(píng)價(jià)的靶器官。

3.2 Cu對(duì)斧足的組織損傷效應(yīng)

本研究發(fā)現(xiàn)斧足經(jīng)Cu脅迫會(huì)出現(xiàn)黏液細(xì)胞變形、細(xì)胞空泡化以及上皮層損傷等現(xiàn)象。黏液分泌增加是背角無(wú)齒蚌對(duì)多種類(lèi)型壓力（包括物理刺激、化學(xué)刺激）的主要響應(yīng)方式之一。低濃度Cu脅迫時(shí)，黏液細(xì)胞分泌量增加，分泌黏液以隔絕水體，減少水體重金屬對(duì)機(jī)體影響。高濃度Cu脅迫時(shí)，表層的黏液和機(jī)體的代謝已經(jīng)難以抵抗Cu的毒性損傷，造成斧足細(xì)胞空泡化以及上皮層損傷。

3.3 Cu對(duì)外套膜的組織損傷效應(yīng)

Cu對(duì)背角無(wú)齒蚌外套膜的毒性效應(yīng)表現(xiàn)為色素細(xì)胞、巨噬細(xì)胞增多以及上皮層損傷等。以Cd脅迫背角無(wú)齒蚌也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果[30]。這與其他貝類(lèi)的研究結(jié)果相一致，例如通過(guò)對(duì)尖膀胱螺進(jìn)行Cu暴露發(fā)現(xiàn)外套膜先是出現(xiàn)色素細(xì)胞增多，后隨Cu濃度增加和暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而出現(xiàn)細(xì)胞空泡化、上皮層損傷甚至壞死[20]。外套膜在0.01 mg·L-1暴露組，經(jīng)24 h暴露就開(kāi)始出現(xiàn)色素細(xì)胞增多現(xiàn)象，可能是因?yàn)橥馓啄づc外界水體接觸面積較大所引起的。然而，隨著Cu濃度增加和暴露時(shí)間延長(zhǎng)，組織損傷程度沒(méi)有明顯加重，推測(cè)可能是因?yàn)橥馓啄け砻娓采w的纖毛起到了一定的屏障作用，大量的色素細(xì)胞和巨噬細(xì)胞也可以抵抗Cu脅迫對(duì)組織造成的損傷。

3.4 Cu對(duì)消化腺的組織損傷效應(yīng)

消化腺是產(chǎn)生消化酶、吸收養(yǎng)分、產(chǎn)生生物轉(zhuǎn)化酶以及金屬儲(chǔ)存和解毒的關(guān)鍵新陳代謝器官。本研究結(jié)果顯示背角無(wú)齒蚌幼蚌的消化腺在所有暴露組的前72 h內(nèi)均未出現(xiàn)明顯組織損傷，直到暴露96 h時(shí)在0.1 mg·L-1暴露組才開(kāi)始出現(xiàn)小管上皮細(xì)胞變形和結(jié)締組織萎縮現(xiàn)象。相較于其他器官，消化腺對(duì)Cu脅迫的敏感性較弱，可能是因?yàn)橄俨慌c水體直接接觸，且消化腺中存在一種黃色顆粒是重金屬的儲(chǔ)存場(chǎng)所，研究認(rèn)為其與各種金屬硫蛋白或脂褐素顆粒螯合使重金屬污染物解毒的機(jī)制有關(guān)[31]。因此，Cu對(duì)幼蚌消化腺毒性損傷較弱，消化腺組織損傷程度不明顯。

4 結(jié)論

（1）迄今報(bào)道的我國(guó)有8.7%的江河天然重要漁業(yè)水域，以及14.9%的湖泊、水庫(kù)重要漁業(yè)水域中Cu超標(biāo)，這些水域中Cu濃度已高于可導(dǎo)致背角無(wú)齒蚌幼蚌發(fā)生組織損傷效應(yīng)的水平。

（2）背角無(wú)齒蚌幼蚌對(duì)Cu毒性響應(yīng)靈敏，其中鰓相較于其他組織對(duì)Cu毒性最為敏感，適宜用作淡水漁業(yè)生態(tài)環(huán)境Cu污染監(jiān)測(cè)的靶器官。