石婕 劉璇 明宗娟 李維 呂欣 楊俠 王煜 張夢穎 楊拴盈

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)性死亡的主要原因[1]。根據(jù)中國國家癌癥登記中心數(shù)據(jù)[2]顯示，肺癌在男性中的發(fā)病率居于首位，在女性中的發(fā)病率僅次于乳腺癌。肺癌是癌癥死亡的首要原因。早期肺癌的預(yù)后顯著優(yōu)于晚期肺癌，因此，對早期識別肺癌尤為重要。孤立性肺結(jié)節(jié)（solitary pulmonary nodule, SPN）是指影像學(xué)上發(fā)現(xiàn)的肺內(nèi)直徑≤3 cm的單個(gè)、局灶性、類圓形、密度增高的肺部陰影，周圍被肺實(shí)質(zhì)包繞，無肺不張、淋巴結(jié)增大或胸腔積液等表現(xiàn)[3]。雖然部分肺結(jié)節(jié)是良性的，但有相當(dāng)一部分是早期的、潛在可治愈的惡性腫瘤[4]。因此，盡早識別良惡性SPN是目前臨床工作的的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

血清腫瘤標(biāo)志物為腫瘤的診斷、治療療效及預(yù)后提供參考證據(jù)，但是，其在早期肺癌患者中敏感性較低[5]。為解決腫瘤標(biāo)志物在早期肺癌診斷中的局限性，與其他血清生物標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢驗(yàn)成為目前研究的熱點(diǎn)。

炎性細(xì)胞因子是由多種免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分泌的一類具有廣泛生物學(xué)活性的低分子量可溶性蛋白質(zhì)，可以反映腫瘤微環(huán)境和機(jī)體的免疫功能[6]。既往研究表明炎性因子與腫瘤密切相關(guān)，我們擬探討細(xì)胞因子與腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測對SPN良惡性的鑒別診斷價(jià)值，尋找可預(yù)測惡性SPN的血清生物標(biāo)志物，從而提高早期肺癌診斷的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 研究對象及分組 選取2019年3月-2020年1月就診于西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院經(jīng)胸部計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography, CT）發(fā)現(xiàn)SPN并最終明確診斷且病例資料記錄完整的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往診斷為肺癌并接受治療的患者；肺部有急性感染或者活動性肺結(jié)核病變的患者；有自身免疫性疾病，服用激素治療的患者；有嚴(yán)重的心、肝、腎功能異常的患者；有其他系統(tǒng)惡性腫瘤史的患者。最終入選81例，依據(jù)病理結(jié)果分為良性結(jié)節(jié)組和惡性結(jié)節(jié)組，其中惡性結(jié)節(jié)組47例，肺腺癌39例，鱗癌8例；良性結(jié)節(jié)組34例。收集患者的臨床資料、影像學(xué)資料、病理資料和血清學(xué)指標(biāo)（包括常見肺腫瘤標(biāo)志物和細(xì)胞因子系列）。

1.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件、MedCalc軟件和GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖。計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)（百分比）表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)；符合正態(tài)分布的計(jì)量資料兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；偏態(tài)分布的資料兩組間比較采用兩個(gè)獨(dú)立樣本的Mann-Whitney非參數(shù)檢驗(yàn)；采用單因素和多因素分析篩選出預(yù)測肺結(jié)節(jié)惡性概率的獨(dú)立血清指標(biāo)，并用二元Logistic回歸分析構(gòu)造聯(lián)合指標(biāo)；繪制受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve, ROC），金標(biāo)準(zhǔn)為病理結(jié)果，計(jì)算曲線下面積（area under the curve, AUC）。P＜0.05表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 良性結(jié)節(jié)組和惡性結(jié)節(jié)組的一般臨床資料分析 如表1所示，良性結(jié)節(jié)組和惡性結(jié)節(jié)組在分布中存在顯著差異（P=0.041），其中惡性結(jié)節(jié)在右肺上葉的比例最高（40.4%）；良性結(jié)節(jié)組和惡性結(jié)節(jié)組在性別、年齡、吸煙史、腫瘤家族史、不同直徑和不同密度結(jié)節(jié)中的分布均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

表1 良性結(jié)節(jié)組和惡性結(jié)節(jié)組的一般臨床資料分析Tab 1 General clinical data of patients with benign or malignant solitary pulmonary nodules

2.2 細(xì)胞因子在良性結(jié)節(jié)組和惡性結(jié)節(jié)組中的表達(dá)水平如圖1及表2所示，白介素6（interleukin-6, IL-6）、白介素8（interleukin-8, IL-8）在惡性結(jié)節(jié)患者組中的表達(dá)水平高于良性結(jié)節(jié)組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；IL-8在惡性結(jié)節(jié)患者組中的表達(dá)水平高于良性結(jié)節(jié)組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；而白介素2受體（interleukin-2 receptor, IL-2R）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）在良性結(jié)節(jié)組和惡性結(jié)節(jié)組間未見顯著差異。

圖1 良性結(jié)節(jié)組和惡性結(jié)節(jié)組中細(xì)胞因子表達(dá)水平的比較Fig 1 Comparison of cytokines expression levels of patients with benign or malignant solitary pulmonary nodules. **P＜0.01; NS:non-significant difference.

表2 細(xì)胞因子在良性結(jié)節(jié)組和惡性結(jié)節(jié)組中的表達(dá)水平Tab 2 Cytokines expression level of patients with benign or malignant solitary pulmonary nodules

2.3 腫瘤標(biāo)志物在良性結(jié)節(jié)組和惡性結(jié)節(jié)組中的表達(dá)水平 如圖2及表3所示，癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）和細(xì)胞角蛋白19片段（cytokeratin 19 fragment 21-1, CYFRA21-1）在惡性結(jié)節(jié)患者組中的表達(dá)水平高于良性結(jié)節(jié)組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase, NSE）、糖類抗原125（carbohydrate antigen 125, CA125）、胃泌素釋放前肽（progastrin releasing peptide, PROGRP）、鱗癌抗原（squamous cell carcinoma antigen, SCC-Ag）在良性結(jié)節(jié)組和惡性結(jié)節(jié)組間的表達(dá)水平均無顯著差異。

圖2 良性結(jié)節(jié)組和惡性結(jié)節(jié)組中腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平的比較Fig 2 Comparison of tumor markers expression levels of patients with benign or malignant solitary pulmonary nodules. *: P＜0.05.

表3 腫瘤標(biāo)志物在良性結(jié)節(jié)組和惡性結(jié)節(jié)組表達(dá)水平Tab 3 Tumor markers expression level of patients with benign or malignant solitary pulmonary nodules

2.4 細(xì)胞因子和腫瘤標(biāo)志物的單因素及多因素分析結(jié)果由二元Logistic單因素分析可知（表4），CEA、IL-6及IL-8有助于惡性結(jié)節(jié)的診斷，為惡性SPN的危險(xiǎn)性因素，NSE、CYRFA、CA125、PROGRP、SCC、IL-2R、TNF-α對惡性結(jié)節(jié)的診斷均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此不納入多因素回歸分析。

表4 惡性結(jié)節(jié)中細(xì)胞因子和腫瘤標(biāo)志物血清水平的單因素分析結(jié)果Tab 4 Result of univariate analysis of cytokines and tumor markers in patients with malignant solitary pulmonary nodules

基于單因素分析的結(jié)果及各因素之間可能存在的相互作用，將CEA、IL-6和IL-8納入多因素回歸分析中，得出結(jié)果如表5所示，CEA、IL-6和IL-8為預(yù)測惡性結(jié)節(jié)的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，它們的OR值分別為1.620（95%CI: 1.043-2.517,P＜0.05）、1.317（95%CI: 1.028-1.688,P=0.030）和1.122（95%CI: 1.027-1.226,P=0.011）。

表5 惡性結(jié)節(jié)中細(xì)胞因子和腫瘤標(biāo)志物血清水平的多因素分析結(jié)果Tab 5 Result of multivariate analysis of cytokines and tumor markers in patients with malignant solitary pulmonary nodules

2.5 細(xì)胞因子及其與腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測的ROC分析 我們通過二元Logistic回歸分析構(gòu)造聯(lián)合因子CEA+IL-6、CEA+IL-8和CEA+IL-6+IL-8，用聯(lián)合因子的概率值代表指標(biāo)聯(lián)合檢測水平，分別用3個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)及其聯(lián)合構(gòu)造的指標(biāo)繪制ROC曲線，計(jì)算AUC，并檢驗(yàn)AUC的差異是否具有統(tǒng)計(jì)顯著性，取Youden指數(shù)最大值時(shí)的閾值作為最佳診斷臨界值，計(jì)算對應(yīng)的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和準(zhǔn)確率。

單項(xiàng)指標(biāo)C E A、I L-6、I L-8及聯(lián)合檢測分組（CEA+IL-6、CEA+IL-6和CEA+IL-6+IL-8）的ROC曲線分析結(jié)果見圖3及表6。CEA、IL-6、IL-8的最佳診斷臨界值分別是3.455 ng/mL、4.160 pg/mL和9.710 pg/mL。ROC曲線分析結(jié)果顯示，指標(biāo)聯(lián)合檢測的AUC均大于單項(xiàng)指標(biāo)，依次是CEA+IL-6+IL-8＞CEA+IL-8＞CEA+IL-6＞IL-8＞IL-6＞CEA。

圖3 不同指標(biāo)對惡性孤立性肺結(jié)節(jié)診斷的ROC曲線Fig 3 ROC curve of different index in malignant solitary pulmonary nodules

表6 不同指標(biāo)對惡性孤立性肺結(jié)節(jié)診斷的ROC曲線分析Tab 6 ROC curve analysis of different index in malignant solitary pulmonary nodules

3 討論

肺癌是最常見的癌癥，也是癌癥相關(guān)死亡的主要原因。隨著環(huán)境問題的加劇，肺癌的負(fù)擔(dān)日益增加。盡管肺癌的診療不斷取得進(jìn)展，但其預(yù)后和生存期仍無明顯改善，并且隨著分期的增加，生存率顯著下降。因此，肺癌的早期篩查與診斷具有重要臨床意義。隨著健康體檢篩查的普及和胸部CT的廣泛應(yīng)用，SPN的檢出率顯著增加，部分SPN是早期肺癌的表現(xiàn)，其良惡性的鑒別是目前臨床重點(diǎn)關(guān)注的問題，盡早識別SPN中的惡性結(jié)節(jié)，并及時(shí)治療，可以顯著改善肺癌患者的預(yù)后和生存率。

一些患者的臨床特征被認(rèn)為是肺部惡性腫瘤的危險(xiǎn)因素，比如年齡的增長、吸煙史、腫瘤家族病史、職業(yè)暴露、肺纖維化和慢性阻塞性肺疾病等[7]。已有研究[8]表明，肺癌發(fā)病率的風(fēng)險(xiǎn)隨著年齡的增長而顯著增加，在≥65歲的SPN患者中，惡性率超過85%，是年輕組的2.25倍，提示年齡是判斷SPN為惡性的獨(dú)立影響因素。本研究納入的惡性SPN患者中，＜65歲的人群中惡性SPN占38.3%，≥65歲的人群中惡性SPN占61.7%，這與上述研究結(jié)果一致。另外，吸煙是肺癌發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素，在吸煙者中惡性肺結(jié)節(jié)的生長更快，容易促進(jìn)病情向晚期進(jìn)展。在初次篩查時(shí)，50歲以上的吸煙患者中幾乎都會發(fā)現(xiàn)肺部結(jié)節(jié)，并且有10%的篩查對象會在1年內(nèi)出現(xiàn)新的結(jié)節(jié)[9]。本研究中良性和惡性SPN病例在年齡、性別、吸煙史和家族史中分布無顯著差異，但這并不意味著這些臨床特征與惡性SPN無相關(guān)性，可能與樣本量較小有關(guān)。在將來的研究中，應(yīng)該擴(kuò)大樣本量、豐富研究因素，進(jìn)行多中心研究，進(jìn)一步探討SPN的流行病學(xué)因素。

另外一些影像學(xué)特征有助于SPN患者的危險(xiǎn)分層，包括結(jié)節(jié)大小、密度、位置、邊緣及內(nèi)部特征和體積倍增時(shí)間等。在美國國家癌癥研究所的肺部篩查研究中，＞20 mm的結(jié)節(jié)的肺癌診斷率最高，然后依次是11 mm-19 mm和≤10 mm的結(jié)節(jié)，分別為34.5%、21.3%和＜5%[10]。SPN直徑越大惡性概率的可能性越高，本研究47例惡性SPN中20 mm-30 mm、11 mm-19 mm和≤10 mm所占的比例依次為51.1%、40.4%和8.5%，與既往研究一致。本研究中SPN在右肺上葉發(fā)生的比例最高（30.7%），其中惡性SPN位于右肺上葉的比例為40.4%，這與大多數(shù)的研究是一致的。Takahashi等[10]對360例有病理結(jié)果的SPN患者進(jìn)行分析，肺結(jié)節(jié)多位于右肺上葉（37.5%），大多數(shù)≤20 mm的惡性SPN位于右肺上葉（41.4%）。研究[10]發(fā)現(xiàn)在3種不同密度的結(jié)節(jié)中，部分實(shí)性結(jié)節(jié)的惡性概率最高，然后依次是實(shí)性結(jié)節(jié)、磨玻璃樣結(jié)節(jié)。本研究81例SPN患者中，部分實(shí)性結(jié)節(jié)、實(shí)性結(jié)節(jié)和磨玻璃樣結(jié)節(jié)中惡性結(jié)節(jié)的概率依次為60.0%、62.7%和40%，與上述研究結(jié)果不一致，但符合大多是惡性結(jié)節(jié)是實(shí)性結(jié)節(jié)的流行病學(xué)規(guī)律?？衫^續(xù)隨訪收集更多部分實(shí)性結(jié)節(jié)和磨玻璃樣結(jié)節(jié)的病例納入研究，展開深入分析。

CEA是一種參與細(xì)胞黏附的多糖蛋白復(fù)合物，在健康成年人的血液中它通常不存在或含量甚微，被認(rèn)為與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)[11]。CEA血清學(xué)水平與肺癌的病理分期關(guān)系密切。Grunnet等[11]發(fā)現(xiàn)肺癌患者血清中CEA較良性病變患者升高更明顯（P＜0.05），但早期變化不大。我們的研究結(jié)果中，CEA是惡性SPN的獨(dú)立預(yù)測因素，其特異度是幾項(xiàng)單獨(dú)指標(biāo)中最高的，但靈敏度僅為48.9%，說明CEA在早期肺癌中的作用有限。

為了進(jìn)一步解決CEA在早期肺癌診斷中的局限性，與其他血清生物標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢驗(yàn)成為目前研究的熱點(diǎn)。細(xì)胞因子作為連接腫瘤細(xì)胞、炎性微環(huán)境和宿主免疫系統(tǒng)的紐帶，與肺癌的發(fā)生、發(fā)展緊密相連。既往研究[12]發(fā)現(xiàn)IL-6可通過誘導(dǎo)血管擴(kuò)張共濟(jì)失調(diào)突變基因（ataxiatelangiectasia mutated kinase, ATM）磷酸化，增加基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）表達(dá)，促進(jìn)肺癌的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，而IL-6/STAT3信號傳導(dǎo)通過誘導(dǎo)細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)劑細(xì)胞周期蛋白D1促進(jìn)了肺癌細(xì)胞的生長[13]。IL-8促進(jìn)肺癌的機(jī)制尚不明確，有研究[14]認(rèn)為IL-8通過GLUT3和GFAT誘導(dǎo)的O-GlcNAc修飾可調(diào)節(jié)結(jié)腸和肺癌細(xì)胞中的癌干細(xì)胞樣特性，這些機(jī)制研究均說明IL-6及IL-8在肺癌的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用。Holmer等[15]研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者血清中IL-8、IL-6、TNF-α和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）水平明顯升高。Pine等[16]研究證明，高水平的IL-6和IL-8患者肺癌發(fā)病率分別增加了3.29倍和2.06倍，表明IL-6和IL-8是肺癌的危險(xiǎn)因素，這與我們的結(jié)果相符。本研究中，IL-6、IL-8在惡性結(jié)節(jié)組中的表達(dá)水平顯著高于良性結(jié)節(jié)組（P＜0.05），和既往研究一致。但在肺腺癌和肺鱗癌兩個(gè)NSCLC病理分型亞組間，IL-6的表達(dá)水平無差異，肺鱗癌組IL-8的表達(dá)水平高于肺腺癌組，這說明IL-6和IL-8在惡性結(jié)節(jié)患者中的表達(dá)水平升高，IL-8可能與組織學(xué)亞型肺鱗癌具有一定的相關(guān)性，但是本研究中鱗癌樣本量偏少，可能存在偏倚，需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。本研究單因素及多因素分析發(fā)現(xiàn)IL-6和IL-8的升高與惡性SPN存在密切相關(guān)。本研究提示，外周血細(xì)胞因子可能是早期肺癌的血清標(biāo)志物，反映癌癥的存在和機(jī)體特異性的高免疫反應(yīng)。

本研究對有獨(dú)立預(yù)測意義的CEA、IL-6、IL-8這3項(xiàng)血清指標(biāo)及其不同聯(lián)合檢測組合進(jìn)行綜合分析評價(jià)。將CEA分別與IL-6、IL-8組合聯(lián)合檢測，有3種不同的組合方式（CEA+IL-6、CEA+IL-8和CEA+IL-6+IL-8），其中CEA+IL-6+IL-8的靈敏度最高，并且其診斷準(zhǔn)確率在單項(xiàng)檢測和聯(lián)合檢測中最高，綜合評價(jià)分析認(rèn)為3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測的診斷價(jià)值高于CEA、IL-6、IL-8單獨(dú)診斷效能以及兩兩診斷效能，說明CEA+IL-6+IL-8聯(lián)合檢測有望輔助診斷SNP的性質(zhì)，對肺癌的診斷有一定的價(jià)值。

綜上所述，腫瘤標(biāo)志物和細(xì)胞因子聯(lián)合檢測對惡性SNP的早期診斷較單項(xiàng)更具有臨床意義，提高了對肺部惡性腫瘤的診斷效能，可以作為輔助檢查手段，為臨床提供更多的參考信息和診斷證據(jù)。