王淑淑 崔鎵鈺 張凱佳 谷金華 鄭遠航 張寶剛 史立宏

肺癌是目前世界上最常見的惡性腫瘤之一[1,2]。肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）是肺癌中最常見的病理類型[3]，侵襲轉移是導致肺腺癌患者死亡的主要原因，如何抑制癌細胞的侵襲轉移一直是腫瘤治療的研究熱點。

越來越多的證據(jù)表明腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment, TME）關系密切。TME由腫瘤細胞、腫瘤相關成纖維細胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs）、免疫細胞、間充質細胞以及間質和浸潤在其中的生物分子等組成[4,5]。CAFs是TME的重要組成成分，參與腫瘤細胞增殖、免疫逃逸、血管生成、淋巴轉移和耐藥等多個過程，已被認為是抗癌治療的潛在靶點[6,7]。研究[8]表明，α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）、成纖維細胞活化蛋白（fibroblast activation protein, FAP）和成纖維細胞特異性蛋白（fibroblast specific protein, FSP）等分子在CAFs中表達較高，可以作為定義CAFs的標志物，Kalluri等[9]研究發(fā)現(xiàn)α-SMA和FAP在CAFs中更具特異性。

FAP是II型絲氨酸蛋白酶家族成員之一，具有二肽基肽酶及膠原酶活性，是CAFs表面的重要標志物，也是研究較多的CAFs治療靶標。據(jù)報道FAP可以促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[10,11]，提示抑制FAP可能有益于癌癥治療，然而靶向抑制CAFs中的FAP對肺腺癌遷移侵襲的作用及其機制尚不清楚。

外泌體是雙層脂質構成的微囊（30 nm-150 nm），含有多種生物活性分子，包括DNA、microRNAs、蛋白質和脂質[12,13]。外泌體是腫瘤細胞與微環(huán)境間信息交流的關鍵中介，在腫瘤發(fā)生、生長、血管生成、免疫逃逸、耐藥性和遷移侵襲中發(fā)揮重要作用[14-16]。有學者[17]發(fā)現(xiàn)CAFs釋放的外泌體可以促進肺腺癌細胞的遷移及侵襲，但特異性FAP抑制劑SP13786是否可以通過影響CAFs的外泌體從而抑制肺腺癌的遷移侵襲尚未見報道。

本研究發(fā)現(xiàn)CAFs外泌體可以上調A549細胞Stat3的磷酸化水平從而促進A549細胞的上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）、遷移及侵襲，而FAP特異性抑制劑SP13786可以顯著抑制CAFs外泌體誘導的Stat3-EMT，抑制A549細胞的遷移侵襲，提示SP13786可能是一個針對肺腺癌的潛在新型治療藥物。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；SP13786［說明書標注半數(shù)抑制濃度（50% inhibitory concentration, IC50）為3.2 nmol/L］購自美國MCE公司；α-SMA一抗購自美國Sigma公司；FAP一抗購自英國Abcam公司；GAPDH、E-cadherin、N-cadherin、Slug、Stat3、P-Stat3一抗均購自美國CST公司；細胞上清外泌體提取試劑盒購自美國Invitrogen公司；基質膠購自美國BD公司；BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天公司；DAPI購自Solarbio公司；Transwell小室購自美國Corning公司；SP9000免疫組化試劑盒購自北京中杉生物技術有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 人肺腺癌細胞系A549購自中國科學院細胞庫。培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至對數(shù)期時進行傳代。

原代肺腺癌CAFs及PTFs分別取自手術新鮮切除的肺腺癌組織和癌周正常組織。將新鮮的組織剪碎放在含0.12%I型膠原酶中，37oC消化30 min，離心1,000 rpm、5 min，在5% CO2細胞培養(yǎng)箱中用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。通過形態(tài)觀察及檢測α-SMA和FAP判斷是否成功獲得CAFs與PTFs，將2代-5代細胞用于后續(xù)研究。

1.3 MTT實驗 取對數(shù)生長期的CAFs細胞，以5×103個/孔的細胞密度接種到96孔板中培養(yǎng)24 h，加入濃度為0 nmol/L、1.5 nmol/L、3 nmol/L、4.5 nmol/L、6 nmol/L和7.5 nmol/L的SP13786溶液，作用48 h后，每孔加20 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入150 μL DMSO，酶標儀檢測570 nm波長處各孔的吸光度。重復3次，取平均值。

1.4 外泌體的分離和純化 待PTFs、CAFs及CAFs+SP13786（3.3 nmol/L, 48 h）細胞密度生長至80%左右時，更換為含10%去外泌體胎牛血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞培養(yǎng)液，2,000 rpm離心30 min后取上清，并添加0.5倍體積的總外泌體分離試劑，4 °C過夜。次日，4 °C、10,000 rpm離心1 h，棄上清，1×PBS重懸，即分別得到PTFs-exo、CAFs-exo以及CAFs+SP13786-exo。

1.5 透射電鏡觀察外泌體 分別將PTFs-exo、CAFs-exo以及CAFs+SP13786-exo與4%多聚甲醛混合，滴到Formvar碳涂層的電子顯微鏡格柵上，1%戊二醛固定10 min，2%乙酸鈾酰溶液負染色。使用透射電鏡在163 kV下獲得圖像。

1.6 熒光共聚焦顯微鏡觀察A549細胞攝取外泌體 分別用PBS將PTFs-exo、CAFs-exo和CAFs+SP13786-exo稀釋到1 mL，加入5 μL DID染料，37oC孵育30 min，1,500 rpm離心5 min，棄上清用PBS重懸，分別加入到A549細胞中共培養(yǎng)0 h、24 h、48 h，熒光顯微鏡觀察A549細胞攝取外泌體的情況。

1.7 A549細胞實驗分組 Ctrl組；PTFs組：PTFs-exo與A549共孵育48 h；CAFs組：CAFs-exo與A549共孵育48 h；SP13786組：CAFs+SP13786-exo與A549共孵育48 h。

1.8 細胞免疫熒光實驗 將CAFs、PTFs、CAFs+SP13786及不同處理組的A549細胞接種于共聚焦皿中，培養(yǎng)24 h，用4%多聚甲醛固定細胞15 min，山羊血清封閉1 h，分別加入α-SMA（1:400）、FAP（1:400）、Stat3（1:300）、P-Stat3（1:200）、N-cadherin（1:200）、E-cadherin（1:200）、Slug（1:200）抗體在4oC過夜。次日以熒光二抗（1:200）37oC孵育1.5 h，DAPI避光孵育8 min，封片，熒光共聚焦顯微鏡拍照。

1.9 細胞免疫組織化學實驗 將CAFs、P TFs、CAFs+SP13786及不同處理組的A549細胞接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h后用4%多聚甲醛固定15 min，3% H2O215 min，山羊血清封閉20 min，分別加入下列一抗：α-SMA（1:400）、FAP（1:400）、Stat3（1:300）、P-Stat3（1:200）、N-cadherin（1:200）、E-cadherin（1:200），4oC過夜。次日，二抗37oC孵育30 min，DAB 8 min，蘇木素10 min，拍照。

1.10 Western blot實驗 將各組細胞提取蛋白，經(jīng)SDSPAGE凝膠分離后轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1.5 h，分別在α-SMA（1:2,500）、FAP（1:5,000）、Stat3（1:1,000）、P-Stat3（1:1,000）、N-cadherin（1:1,000）、E-cadherin（1:1,000）、Slug（1:1,000）、Snail（1:1,000）、β-actin（1:5,000）和GAPDH（1:3,000）中孵育，4oC過夜。次日用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，ECL化學發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)曝光檢測。

1.11 Transwell遷移及侵襲實驗 將基質膠與無血清培養(yǎng)基以1:20稀釋，包被及水化Transwell小室基底膜。將各組A549細胞用無血清培養(yǎng)基重懸，并調整細胞密度約為1×105個/mL。在Transwell小室的上室每孔加入200 μL細胞懸液（約2×104個細胞），下室加500 μL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，37oC培養(yǎng)24 h，取出小室，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結晶紫染色20 min，拍照，計數(shù)細胞遷移數(shù)，并進行統(tǒng)計學分析。遷移試驗不需要基質膠。

1.12 細胞劃痕實驗 取對數(shù)生長期的A549細胞接種于六孔板中，與各組外泌體共培養(yǎng)48 h，待細胞匯聚度達到80%，用滅菌藍槍頭進行劃痕。于0 h、24 h分別用顯微鏡拍照，計算劃痕愈合率。Image J軟件計算細胞遷移率（%）= [（0-24）h的面積/0 h的起始面積]×100%。

1.13 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 21.0軟件及Image J軟件進行實驗數(shù)據(jù)的分析。計量資料用均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），利用GraphPad Prism 5進行圖表繪制，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CAFs和PTFs的分離與鑒定 CAFs和PTFs均為長梭形，且CAFs比PTFs形態(tài)更加細長（圖1A）。免疫熒光與免疫組化結果均顯示α-SMA和FAP在CAFs中高表達而在PTFs中低表達（圖1B，圖1C）。表明通過原代分離培養(yǎng)成功獲得了人肺腺癌CAFs和PTFs。

圖1 原代分離的CAFs和PTFs形態(tài)及表型鑒定。A：顯微鏡下觀察CAFs及PTFs的細胞形態(tài)（×100）；B：免疫熒光檢測α-SMA及FAP在CAFs和PTFs中的表達；C：免疫組化檢測α-SMA在CAFs和PTFs中的表達量（×100）。Fig 1 Morphology and phenotypic identification of primary isolated CAFs and PTFs. A: Morphological features of primary cultured PTFs and CAFs(×100). B: The expression levels of α-SMA and FAP in CAFs and PTFs were analyzed by immunofluorescence technique. The slide was stained with 4’, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, blue), FAP antibody (green) and α-SMA antibody (red); C: The expression levels of FAP in CAFs and PTFs were analyzed by immunohistochemistry (×100). CAFs: cancer-associated fibroblasts; PTFs: peri-tumer fibroblasts; α-SMA: alpha-smooth muscle actin; FAP: fibroblast activation protein.

2.2 FAP抑制劑SP13786顯著抑制CAFs中FAP的表達 用不同濃度的SP13786孵育CAFs 48 h并進行MTT實驗以檢測CAFs增殖率。如圖2A所示，SP13786顯著降低CAFs的增殖，其IC50值約為3.3 nmol/L。Western blot結果顯示與CAFs組相比，CAFs+SP13786組的FAP與α-SMA的表達水平明顯降低（P＜0.05，圖2B）。進一步通過免疫熒光與免疫組化實驗得到相同結果，如圖2C、圖2D。表明SP13786（3.3 nmol/L）孵育CAFs 48 h后CAFs中FAP與α-SMA的表達顯著降低，CAFs向正常成纖維細胞轉化，從而選用3.3 nmol/L的SP13786用于后續(xù)實驗。

圖2 SP13786對CAFs的增殖及FAP、α-SMA表達的影響。A：MTT檢測CAFs增殖率；B、C：Western blot和免疫熒光檢測α-SMA及FAP的表達；D：免疫組化檢測FAP的表達（×200）。*P＜0.05；**P＜0.01。Fig 2 Effects of SP13786 on the proliferation of CAFs and the expression of FAP and α-SMA. A: MTT was used to detect the proliferation rate of CAFs; B, C: The expression of α-SMA and FAP was detected by Western blot (B) and immunofluorescence (C); D: Expression of FAP detected by immunohistochemistry (×200). *P＜0.05; **P＜0.01.

2.3 外泌體鑒定與細胞攝取 分別提取PTFs-exo、CAFs-exo以及CAFs+SP13786-exo。透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)樣品均呈橢圓形或球形囊泡，其粒徑大小在40 nm-150 nm之間（圖3A）。將各組外泌體與A549細胞共孵育0 h、24 h和48 h，熒光共聚焦結果顯示外泌體能夠被A549細胞所攝取且攝取量隨時間延長而增多（圖3B）。

圖3 外泌體的鑒定與細胞攝取。A：PTFs-exo、CAFs-exo和CAFs+SP13786-exo的透射電鏡照片；B：PTFs-exo、CAFs-exo和CAFs+SP13786-exo（紅色）進入A549細胞。Fig 3 Identification of exosomes and intercellular metastasis. A: Transmission electron micrograph of PTFs-exo, CAFs-exo and CAFs+SP13786-exo;B: The PTFs-exo, CAFs-exo and CAFs+SP13786-exo (red) were absorbed by A549 cells.

2.4 SP13786通過CAFs外泌體影響A549細胞形態(tài)、遷移及侵襲 與Ctrl組比較，CAFs組的A549細胞呈紡錘形變化趨勢（圖4A）。Transwell遷移及侵襲實驗結果均顯示CAFs組A549細胞的穿膜數(shù)目較Ctrl組顯著增多（P＜0.001），而SP13786組較CAFs組穿膜細胞數(shù)顯著減少（P＜0.05），與PTFs組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖4B，圖4C）。劃痕實驗結果顯示CAFs組A549細胞劃痕愈合能力較Ctrl組顯著增強（P＜0.001），而SP13786組細胞的劃痕愈合能力較CAFs組顯著下降（P＜0.05），與PTFs組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖4D）。上述結果表明SP13786可通過CAFs外泌體間接影響A549細胞的形態(tài)與遷移侵襲。

圖4 SP13786通過CAFs-exo對A549細胞形態(tài)、遷移及侵襲的影響。A：PTFs-exo、CAFs-exo和CAFs+SP13786-exo對A549細胞形態(tài)的影響（×100）；B：Transwell檢測24 h后PTFs-exo、CAFs-exo和CAFs+SP13786-exo對A549細胞侵襲能力的影響（×200）；C、D：Transwell遷移實驗（C, ×200）和劃痕實驗（D, ×40）檢測24 h后PTFs-exo、CAFs-exo和CAFs+SP13786-exo對A549細胞遷移能力的影響。*P＜0.05；***P＜0.001。Fig 4 Effects of SP13786 on the morphology, invasion and migration of A549 cells through CAFs-exo. A: The effect of PTFs-exo, CAFs-exo and CAFs+SP13786-exo on the morphology of A549 cells (×100); B: Transwell assays were performed to evaluate cell invasive ability after 24h (×200); C,D: Transwell assays (C, ×200) and wound healing assays (D, ×40) were performed to evaluate cell migration ability after 24 h. *P＜0.05; ***P＜0.001.

2.5 SP13786通過抑制Stat3的磷酸化抑制EMT 為進一步明確SP13786的作用機制，我們觀察了CAFs-exo對A549細胞EMT的影響。免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，與Ctrl組相比，CAFs組A549細胞的E-cadherin表達降低，N-cadherin表達增加（P＜0.01）；與CAFs組比較，SP13786組A549細胞的E-cadherin表達增加，N-cadherin表達減少（P＜0.05），而與PTFs組比較則無顯著差異（P＞0.05，圖5A）。Slug與Stat3是調控EMT的重要轉錄因子，CAFs組Slug與P-Stat3表達較Ctrl組均顯著增多（P＜0.01），SP13786組Slug與P-Stat3表達均較CAFs組減少（P＜0.05），與Ctrl組相比均未見顯著差異（P＞0.05，圖5A）。同時Western blot（圖5B）與免疫組化（圖5C）均顯示出與免疫熒光相同的結果。表明CAFs-exo可以促進A549細胞EMT，SP13786可以抑制CAFs-exo對A549細胞EMT的促進作用。為了確定SP13786是否是通過抑制Stat3磷酸化而抑制了A549細胞的EMT，我們進一步使用Stat3抑制劑WP1066進行驗證。結果顯示CAFs組加入WP1066后，A549細胞E-cadherin表達增高，N-cadherin表達降低，P-Stat3顯著減少（P＜0.05）；在CAFs組中同時加入WP1066與SP13786后，E-cadherin、N-cadherin及P-Stat3表達與只加入WP1066無顯著差異（P＞0.05，圖5D）。提示CAFs-exo可通過誘導A549中Stat3的磷酸化促進EMT的轉化，增強A549細胞的遷移侵襲，而SP13786可通過影響CAFs-exo間接抑制A549細胞中Stat3磷酸化從而抑制EMT。

圖5 SP13786通過CAFs-exo對A549細胞EMT及Stat3磷酸化的影響。A-C：免疫熒光、Western blot和免疫組化檢測E-cadherin、N-cadherin、Slug、Stat3及P-Stat3的表達量；D：Western blot檢測E-cadherin、N-cadherin、Stat3及P-Stat3的表達量。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。Fig 5 Effects of SP13786 on EMT and Stat3 phosphorylation in A549 cells via CAFs-exo. A-C: The expression levels of E-cadherin, N-cadherin, Slug,Stat3 and P-Stat3 were detected by immunofluorescence (A), Western blot (B) and immunohistochemistry (C, ×200); D: Western blot to detect the expression of E-cadherin, N-cadherin, Stat3 and P-Stat3. *P＜0.05; **P＜0.01; ***P＜0.001. E-cad: E-cadherin; N-cad: B-cadherin.

3 討論

肺腺癌是肺癌中最常見的病理類型[18,19]，侵襲轉移是導致患者死亡的主要原因。研究表明，腫瘤的侵襲轉移不只與腫瘤細胞的特性有關，還受腫瘤微環(huán)境的影響。CAFs是一種活化的成纖維細胞，是腫瘤微環(huán)境的主要細胞成分，通過多種通信方式促進腫瘤的發(fā)展和遷移[9,20]。為了研究CAFs在肺腺癌遷移侵襲中的作用與機制，本研究分別從新鮮切除的肺腺癌組織和癌旁正常組織中分離提取并培養(yǎng)了CAFs和PTFs，免疫熒光和免疫組化結果顯示CAFs中α-SMA和FAP的表達水平顯著高于PTFs，且CAFs比PTFs形態(tài)更加細長，這一結果與文獻[20,21]報道結果一致。

FAP是絲氨酸蛋白酶家族的一種II型跨膜細胞表面蛋白。FAP不僅在間質成纖維細胞表達，也在各種上皮來源的癌細胞中存在，對多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響[22-24]，是潛在的腫瘤早期診斷標志物與治療靶點[25,26]。近年來，靶向FAP在腫瘤治療中的應用越來越受到關注。比如抗FAP單克隆抗體FAP5-DM1與美登木素生物堿聯(lián)用，可以抑制癌癥的進展[27]；靶向FAP的免疫毒素FAP-PE38在乳腺癌中可以特異性消除CAF中的FAP，并顯示出抑制腫瘤發(fā)展的作用[28]。有研究[29-31]報道FAP抑制劑如Talabostat及Sibrotuzumab等能通過抑制FAP對腫瘤產(chǎn)生抑制作用，但因未能通過臨床二期試驗，仍需繼續(xù)探索以尋找更有效的FAP抑制劑。新型小分子FAP抑制劑SP13786具有抗腫瘤作用[32]，但其對肺腺癌的影響尚未見報道。本研究觀察到3.3 nmol/L濃度的SP13786通過特異性抑制FAP使CAFs的標志物FAP和α-SMA表達顯著降低，使CAFs向正常成纖維細胞轉化，因此我們推測SP13786可以通過影響CAFs的功能，改變腫瘤微環(huán)境從而起到抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。

外泌體是細胞間溝通的重要媒介，CAFs可通過外泌體影響腫瘤細胞的功能。為明確SP13786對CAFs外泌體功能的影響，本研究分別提取了PTFs-exo、CAFs-exo和CAFs+SP13786-exo。結果表明，外泌體被A549細胞攝取后，CAFs組的A549細胞侵襲遷移能力較PTFs組顯著增強，而SP13786組的遷移及侵襲能力較CAFs組明顯減弱，提示SP13786靶向抑制CAFs中的FAP后減弱了CAFsexo的惡性表征，從而降低了CAFs外泌體對A549細胞遷移侵襲的促進作用。EMT是上皮細胞失去連接和極性并轉變?yōu)殚g充質表型的基本生物學過程[33]，在腫瘤的遷移中發(fā)揮著重要作用。Shintani等[20,34]的研究發(fā)現(xiàn)CAFs可以誘導肺癌細胞發(fā)生EMT，本研究也發(fā)現(xiàn)CAFs-exo可以促進A549細胞EMT，應用SP13786抑制FAP后，CAFs-exo促進A549細胞EMT的能力顯著減弱，SP13786組A549細胞與CAFs組比較，E-cadherin增加，N-cadherin和Slug降低，說明SP13786能夠通過影響CAFs-exo間接影響A549細胞的EMT與遷移侵襲。

Stat3通過促進腫瘤細胞EMT進而增加腫瘤細胞的遷移、侵襲能力[35,36]。本研究結果顯示CAFs-exo使CAFs組A549細胞的P-Stat3顯著增加，而SP13786組A549細胞中P-Stat3與CAFs組比較顯著減少，提示SP13786可以通過影響CAFs-exo間接抑制A549細胞中Stat3的磷酸化而逆轉EMT，抑制A549細胞的遷移和侵襲。有趣的是，應用Stat3的特異性抑制劑WP1066抑制CAFs組A549細胞Stat3活化后，SP13786不能對Stat3的磷酸化以及A549細胞的EMT起到進一步的抑制作用，進一步證明SP13786可能是通過影響CAFs-exo間接抑制A549細胞Stat3的活化從而抑制A549細胞的EMT及遷移侵襲。

綜上所述，本研究通過細胞實驗證明FAP的特異性小分子抑制劑SP13786能夠通過影響CAFs的外泌體間接抑制A549細胞Stat3的磷酸化，進而抑制A549細胞的EMT、遷移和侵襲，提示FAP可能成為肺腺癌治療的新靶點，SP13786有望成為肺腺癌治療的潛在新型藥物。但本研究尚未對SP13786作用前后CAFs外泌體內成分的變化做出闡明，也未擴展到動物實驗進行驗證，具有一定的局限性，有待進一步深入研究。