李昕翼，馮富巖，周曉東，胡繼明

(武漢大學(xué) 測(cè)試中心，湖北 武漢 430072)

銅是人體健康所必要的第三大過(guò)渡金屬元素，僅次于鋅和鐵，可在多種生物酶合成過(guò)程中作為蛋白的功能輔因子或主要結(jié)構(gòu)組成部分[1]，在細(xì)胞呼吸、骨骼發(fā)育、結(jié)締組織生長(zhǎng)等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，是人體必需的微量元素[2-7]。

2.4 新生兒窒息后發(fā)生AKI的COX回歸性分析 將尿液減少、Kim-1、Netrin-1、窒息程度納入COX回歸性分析發(fā)現(xiàn)，上述因素均與新生兒窒息后AKI發(fā)生呈正相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表2。

河北省作為全國(guó)加快實(shí)施最嚴(yán)格水資源管理制度試點(diǎn)之一，為從根本上解決地下水超采問(wèn)題，按照國(guó)家試點(diǎn)工作總體部署，將地下水超采治理作為改善生態(tài)環(huán)境的三件大事之一，突出重點(diǎn)，抓住關(guān)鍵，全力以赴打好超采治理攻堅(jiān)戰(zhàn)。堅(jiān)持突出重點(diǎn)、綜合施策、強(qiáng)力推進(jìn)，重點(diǎn)在“節(jié)、引、蓄、調(diào)、管”五個(gè)方面下功夫、作文章、要效益。按照實(shí)行最嚴(yán)格水資源管理制度要求和“政府市場(chǎng)協(xié)同發(fā)力、治理監(jiān)管同步推進(jìn)”的思路，凝聚群眾智慧，創(chuàng)新發(fā)展模式，總結(jié)推廣經(jīng)驗(yàn)，敢于碰禁區(qū)，敢于先行先試，探索建立有利于水資源可持續(xù)利用的體制機(jī)制，不斷增強(qiáng)治理地下水超采的內(nèi)生動(dòng)力。

美國(guó)環(huán)境保護(hù)署(Environmental Protection Agency，EPA)對(duì)飲用水中銅離子的含量限值是1.3 mg/L，正常情況下土壤或地表水中銅離子的含量范圍為0.005～30 μg/L。由于銅離子重要的生理功能及其水平失衡所造成的嚴(yán)重病理反應(yīng)，人們對(duì)環(huán)境水樣及生物樣品中銅離子含量的檢測(cè)進(jìn)行了諸多研究。Ndokoye等[8]通過(guò)Au—S鍵在合成的星狀金納米材料(AuNSs)表面修飾半胱氨酸分子(Cys-AuNSs)，借助銅離子與半胱氨酸分子上氮、氧原子配位引起AuNSs聚集所產(chǎn)生的表面增強(qiáng)拉曼光譜響應(yīng)信號(hào)(SERS)實(shí)現(xiàn)了對(duì)銅離子的定量檢測(cè)。Zhao等[9]設(shè)計(jì)了一非對(duì)稱(chēng)納米通道/離子通道混合耦合器，基于電化學(xué)方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)血液中銅離子的檢測(cè)。在該工作中，多孔氧化鋁所提供的納米通道表面修飾了多聚谷氨酸(PGA)，銅離子經(jīng)過(guò)時(shí)由于與谷氨酸上的氧、氮原子配位而使通道內(nèi)的電化學(xué)信號(hào)發(fā)生改變，基于此可實(shí)現(xiàn)對(duì)銅離子的定量檢測(cè)。Liu等[10]利用紅藍(lán)雙色碳量子點(diǎn)(CDs)基于特定的光能量轉(zhuǎn)移設(shè)計(jì)了銅離子比率熒光檢測(cè)試紙，實(shí)現(xiàn)了對(duì)銅離子的半定量檢測(cè)。類(lèi)似的，硒化鎘量子點(diǎn)也被用于自來(lái)水中銅離子的超靈敏檢測(cè)[11]。諸如此類(lèi)的檢測(cè)方法不勝枚舉，但對(duì)于實(shí)際檢測(cè)而言均具備一定的局限性。如借助半胱氨酸、多聚谷氨酸與銅離子配位的方法中，氨基酸對(duì)金屬離子的選擇性低，在進(jìn)行實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)其他金屬離子的干擾難以避免。另外，CdSe/ZnS量子點(diǎn)(QDs)、CDs等納米材料的應(yīng)用，在顯著提高檢測(cè)靈敏度的同時(shí)也增加了檢測(cè)過(guò)程的復(fù)雜性，檢測(cè)中還會(huì)存在其他重金屬離子的引入和間接污染。因此，對(duì)環(huán)境及生物樣品中銅離子的最佳檢測(cè)方法尚有待探究。

人們?cè)趯?duì)因銅離子失衡所引起的相關(guān)神經(jīng)性疾病(如阿爾茲海默癥、帕金森病)[12-13]的研究中發(fā)現(xiàn)，淀粉樣蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)淀粉樣蛋白的累積與神經(jīng)性疾病的相關(guān)性也通過(guò)一定的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型得到進(jìn)一步證實(shí)[14-15]。相關(guān)銅蛋白的多樣結(jié)構(gòu)為對(duì)應(yīng)肽段的設(shè)計(jì)和篩選提供了充足的資源，例如基于淀粉樣蛋白的Aβ系列肽段。研究發(fā)現(xiàn)，多肽分子憑借豐富的結(jié)構(gòu)組成和可變的結(jié)構(gòu)特征，在生物分析、金屬離子檢測(cè)等領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大的潛力[16-17]。Li等[18]建立了一種基于多肽RFPRGGD-金納米粒子體系快速檢測(cè)銀離子的方法。利用多肽中精氨酸與金納米粒子之間的靜電吸力實(shí)現(xiàn)多肽的修飾，多肽另一端帶負(fù)電的天冬氨酸則會(huì)因與金納米粒子之間的靜電斥力起到穩(wěn)定作用。當(dāng)銀離子存在時(shí)，精氨酸的氨基和天冬氨酸的羧基會(huì)與其發(fā)生四配位，從而誘導(dǎo)多肽的構(gòu)象發(fā)生折疊，致使金納米粒子團(tuán)聚，以此實(shí)現(xiàn)對(duì)銀離子的高效檢測(cè)。

為了判斷5條肽段對(duì)銅離子親和能力的大小，分別將其與銅離子溶液混合孵育并進(jìn)行MALDI-TOF MS質(zhì)譜分析。結(jié)合數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)肽段P5(DDAEGHARHCR)對(duì)銅離子表現(xiàn)出較強(qiáng)的親和力，其余肽段也對(duì)銅離子表現(xiàn)出一定的親和性，但豐度較低(圖1)。由此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并篩選出多肽P5作為識(shí)別銅離子的功能肽段。

2.2.1體系pH值的優(yōu)化pH值對(duì)整個(gè)反應(yīng)體系的影響很大，主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面，首先就鈣黃綠素而言，不同的環(huán)境pH值對(duì)其熒光強(qiáng)度有一定的影響，這與鈣黃綠素分子的4個(gè)羧基及兩個(gè)六元環(huán)上的羥基有關(guān)；另外，對(duì)于多肽分子，不同氨基酸序列肽段的等電點(diǎn)不同(本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的肽段等電點(diǎn)為6.49)，在不同的環(huán)境酸度下表現(xiàn)的電性有所不同，整個(gè)多肽分子的電子密度也有所變化，表現(xiàn)出的與正電荷金屬離子的親和性也有所不同。因此考察了體系pH值對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。從圖4A可以發(fā)現(xiàn)，在偏酸性的溶液環(huán)境下，鈣黃綠素的熒光強(qiáng)度相對(duì)較低，這與鈣黃綠素分子內(nèi)的電子傳導(dǎo)有關(guān)，其在pH 7.0左右表現(xiàn)出最強(qiáng)的熒光信號(hào)。圖4B是環(huán)境pH值對(duì)體系熒光恢復(fù)效率的影響。在溶液pH值低于或接近多肽分子等電點(diǎn)時(shí)，多肽分子呈現(xiàn)正電性或電中性，此時(shí)肽段在接近金屬陽(yáng)離子時(shí)會(huì)表現(xiàn)出一定的靜電排斥力，該斥力會(huì)影響多肽與金屬離子的結(jié)合效率；當(dāng)pH值大于多肽等電點(diǎn)時(shí)，肽段整體帶負(fù)電，可與金屬陽(yáng)離子因靜電引力的輔助作用實(shí)現(xiàn)更高效的結(jié)合，熒光恢復(fù)效率上升。綜合鈣黃綠素與多肽分子受pH值的影響情況，以及文獻(xiàn)中對(duì)鈣黃綠素溶液的配制方案[22]，確定實(shí)驗(yàn)的最佳pH值為7.0左右。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

滲瀝液產(chǎn)生量受地表降水、地下水以及垃圾自身降解特性的影響，地表水對(duì)滲瀝液產(chǎn)生量的影響可以通過(guò)雨污分流措施加以控制，而地下水的影響則可以通過(guò)防滲襯墊系統(tǒng)加以隔離，但在沒(méi)有防滲處理措施的填埋場(chǎng)中，地下水和滲瀝液的影響是相互作用的。對(duì)簡(jiǎn)易垃圾場(chǎng)的滲瀝液遷移問(wèn)題，必須首先掌握?qǐng)鰠^(qū)地下水滲流場(chǎng)分布情況，其次分析滲瀝液的擴(kuò)散路徑與范圍，最終確定柔性垂直防滲墻的合理阻隔位置［3］。

鈣黃綠素、氯化銅、硝酸鋅、氯化鉀、硝酸鈷、氯化鈣、硝酸錳、氯化鐵、氯化鎳、無(wú)水乙醇、二水合磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、磷酸均購(gòu)于北京國(guó)藥集團(tuán)。實(shí)驗(yàn)用多肽(P1：Asp-Ala-Glu-Phe-Gly-His-Ala-Arg-His-Arg；P2：Asp-Asp-Ala-Glu-Gly-His-Ala-Arg-His-Arg；P3：Asp-Asp-Ala-Glu-Phe-Gly-His-Ala-Arg-His-Arg；P4：Asp-Asp-Ala-Glu-Phe-Gly-His-Arg-His-Arg；P5：Asp-Asp-Ala-Glu-Gly-His-Ala-Arg-His-Cys-Arg)由南京杰肽生物科技有限公司合成。10 mmol/L 磷酸鹽緩沖溶液 (PB);按濃HCl與濃HNO33∶1的體積比配制王水。

1.2 溶液配制

穩(wěn)定的作物經(jīng)濟(jì)狀況以及良好的種植條件促進(jìn)了巴西種植的快速開(kāi)始。有分析師認(rèn)為未來(lái)巴西大豆面積將增加3%至5%，玉米面積將增加5%以上。

用10 mmol/L pH 7.4的PB緩沖溶液配制1 mmol/L的鈣黃綠素溶液，冰箱4 ℃保存。氯化銅標(biāo)準(zhǔn)溶液由超純水配制，并通過(guò)梯度稀釋方法稀釋至不同濃度。10 mmol/L不同pH值的PB緩沖溶液配制方法如下：分別配制100 mmol/L的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉溶液100 mL，按不同體積比將兩種磷酸鹽溶液混合均勻，使用pH計(jì)檢測(cè)緩沖溶液的實(shí)際pH值，并通過(guò)兩磷酸鹽溶液對(duì)pH值進(jìn)行微調(diào)。所得緩沖溶液按1∶10體積比稀釋。

1.3 銅離子檢測(cè)

配制0～15 μmol/L的銅離子溶液，鈣黃綠素濃度恒定為80 μmol/L，將不同濃度的銅離子溶液與鈣黃綠素溶液混合5 min，待銅離子反應(yīng)完全,檢測(cè)熒光信號(hào)(F1);加入1.5倍物質(zhì)的量的多肽分子，反應(yīng)22 min。待反應(yīng)完全后檢測(cè)熒光恢復(fù)信號(hào)(F2)。取自來(lái)水在空氣中靜置2 h，代替銅離子溶液重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)自來(lái)水中的銅離子含量。取東湖水經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，代替銅離子溶液重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)湖水中銅離子的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及原理

識(shí)別元件的選擇是傳感設(shè)計(jì)的關(guān)鍵。大量文獻(xiàn)證實(shí)，基于銅蛋白的功能肽段淀粉樣蛋白肽對(duì)銅離子表現(xiàn)出一定的親和性，通過(guò)一系列親和系數(shù)的計(jì)算篩選出的mAβ16肽段(DAEFGHDSGFEVRHQK)具有最高的結(jié)合能力[16]。研究表明，由于銅離子體積較小，該肽段與銅離子結(jié)合時(shí)易發(fā)生構(gòu)型折疊，部分區(qū)域相鄰或相間氨基酸可同時(shí)與銅離子成鍵。其成鍵原子分別為天冬氨酸(Asp)氨基氮原子、丙氨酸(Ala)羰基氧原子、甘氨酸(Gly)肽鍵氮原子、組氨酸(His)咪唑環(huán)內(nèi)氮原子以及Asp、谷氨酸(Glu)4個(gè)氨基酸殘基上的某個(gè)羥基氧原子[16]?；趍Aβ16肽段與銅離子相互作用的結(jié)構(gòu)特征與配位點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)保留二者的作用位點(diǎn)與結(jié)合模型，同時(shí)更改其余氨基酸的排布方式，設(shè)計(jì)出5條能與銅離子特異結(jié)合的功能肽段，依次命名為P1～P5，具體序列如“1.1”所示。

圖1 P5與銅離子的MALDI-TOF MS質(zhì)譜圖Fig.1 MALDI-TOF MS spectrum of the mixtures of P5 and Cu(Ⅱ)

本文通過(guò)對(duì)淀粉樣蛋白肽結(jié)構(gòu)與功能位點(diǎn)的分析，設(shè)計(jì)并篩選出銅離子高親和性的功能肽段[19-21]。針對(duì)早期銅離子對(duì)部分熒光素的熒光猝滅作用，選用鈣黃綠素(Calcein)作為熒光探針，借助功能肽段對(duì)銅離子的高特異性結(jié)合作用并能奪取Calcein-Cu(Ⅱ)的性質(zhì)，設(shè)計(jì)了檢測(cè)銅離子的熒光恢復(fù)型傳感器[22]。通過(guò)基體輔助激光解吸電離源-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)對(duì)Cu(Ⅱ)-Peptide 配合物進(jìn)行了表征分析，并進(jìn)一步通過(guò)質(zhì)譜分析證實(shí)了樣品的選擇性。通過(guò)對(duì)體系pH值、反應(yīng)溫度、鈣黃綠素濃度、反應(yīng)時(shí)間等條件的優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了對(duì)環(huán)境水樣中銅離子的高特異性檢測(cè)。

生長(zhǎng)過(guò)程中所需要的氮元素很大部分由根瘤菌提供，但仍需要從土壤中吸收大量的各種元素供其生長(zhǎng)，缺素不僅會(huì)造成植株生長(zhǎng)差、植株弱化、結(jié)莢少、病害多、病害重，導(dǎo)致產(chǎn)量低。不同生育期所吸收的養(yǎng)分?jǐn)?shù)量也有所不同。其生長(zhǎng)前期需肥量較少，花莢結(jié)實(shí)期，吸收養(yǎng)分的數(shù)量最多，此期所吸收的氮元素占全生育期的48%，磷占60%，鉀占46%。此階段養(yǎng)分不足，會(huì)造成減產(chǎn)減質(zhì)。尤其是缺乏鉀、磷元素的供應(yīng)，會(huì)造成嚴(yán)重的減產(chǎn)。另外，在適時(shí)適量的滿足蠶豆對(duì)氮、磷、鉀三大主肥需求的同時(shí)，還要及時(shí)補(bǔ)施硼、鉬等微肥，以確保產(chǎn)量和品質(zhì)。

圖2 鈣黃綠素-多肽體系熒光檢測(cè)銅離子的傳感原理圖(A)和反應(yīng)前后的熒光變化(B)Fig.2 Schematic diagram of fluorescence-based calcein-peptide assay for Cu(Ⅱ)(A)and fluorescence signals change(B)

為了考察方法的可行性，通過(guò)MALDI-TOF MS分析了Na(Ⅰ)、Mg(Ⅱ)、K(Ⅰ)、Ca(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)、Fe(Ⅲ)、Co(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)9種常量、微量金屬元素與多肽分子的親和性。一定量的多肽分子與相當(dāng)物質(zhì)的量的9種金屬離子混合液孵育60 min，質(zhì)譜數(shù)據(jù)如圖3A所示。9種金屬離子和肽段均無(wú)可識(shí)別性的配位結(jié)合。當(dāng)向金屬離子混合液中加入銅離子時(shí)，可發(fā)現(xiàn)明顯的分子離子峰(圖3B)，且相對(duì)豐度較高，說(shuō)明該肽段與銅離子結(jié)合具有很強(qiáng)的靶向性和親和性。鈣黃綠素作為鈣的指示劑與鈣離子結(jié)合較為穩(wěn)定，且不能通過(guò)EDTA(乙二胺四乙酸)掩蔽，為此考察了鈣離子對(duì)體系的干擾情況。如圖3C和圖3D所示，在鈣黃綠素溶液中加入等物質(zhì)的量的鈣離子，熒光強(qiáng)度有20%的增加，在該體系中繼續(xù)加入等物質(zhì)的量的銅離子，熒光很快猝滅，說(shuō)明鈣離子的加入不會(huì)干擾Calcein-Cu(Ⅱ)的生成。隨后在該溶液中加入多肽分子，熒光逐漸恢復(fù)。結(jié)合多肽與鈣黃綠素的濃度比估算得到熒光恢復(fù)率為80%，說(shuō)明鈣離子的引入并未造成明顯的干擾。由此可見(jiàn)，肽段的設(shè)計(jì)成功地避免了鈣黃綠素與其他金屬離子結(jié)合致使熒光強(qiáng)度改變而對(duì)體系造成的干擾，同時(shí)Cu2+之處的其他金屬離子與鈣黃綠素的結(jié)合未對(duì)多肽配位效率產(chǎn)生影響，說(shuō)明該方法具有較好的選擇性。

2.2 實(shí)驗(yàn)參數(shù)的優(yōu)化

黃庭堅(jiān)(1045-1105)，字魯直，號(hào)山谷道人，晚號(hào)涪翁，洪州分寧（今江西修水縣）人。宋英宗治平四年（1067）中進(jìn)士，時(shí)年22歲。歷官縣尉、知縣、知州、校書(shū)郎、秘書(shū)丞、國(guó)史館編修等。與蘇軾亦師亦友，以詩(shī)與書(shū)法聞名。

熒光分光光度計(jì)(F-4600，日本日立公司)，紫外-可見(jiàn)吸收光譜儀(UV-2550，日本島津公司)，超純水儀(Millipore Direct-Q3，德國(guó)默克密理博公司)，MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀(AB 5800，美國(guó)愛(ài)博才思公司)。

本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)原理是基于Cu(Ⅱ)對(duì)鈣黃綠素(Calcein)的熒光猝滅作用，借助功能肽段特異性捕獲銅離子而使熒光恢復(fù)來(lái)檢測(cè)Cu(Ⅱ)。鈣黃綠素是一種橙黃色固體粉末，溶于水呈黃色并顯綠色熒光，遇銅離子熒光猝滅。由于鈣黃綠素可與多種金屬離子結(jié)合，使得其他金屬離子對(duì)檢測(cè)體系干擾嚴(yán)重。本文創(chuàng)新性地設(shè)計(jì)了可對(duì)銅離子特異性結(jié)合的肽段，實(shí)現(xiàn)了對(duì)Calcein-Cu(Ⅱ)配合物中Cu(Ⅱ)的捕獲，鈣黃綠素作為可化學(xué)發(fā)光的熒光分子將在肽段奪取銅離子后恢復(fù)熒光。根據(jù)熒光恢復(fù)強(qiáng)度差值(F2-F1)即可實(shí)現(xiàn)對(duì)銅離子的特異性定量檢測(cè)(圖2)。

2.2.2反應(yīng)溫度的優(yōu)化一般情況下，溫度主要影響化學(xué)反應(yīng)的速率。本實(shí)驗(yàn)對(duì)反應(yīng)溫度的優(yōu)化主要考慮兩個(gè)因素：一是鈣黃綠素的熒光信號(hào)會(huì)因分子碰撞等因素發(fā)生猝滅，因此反應(yīng)溫度不宜過(guò)高；二是多肽作為生物分子，需具備合適的溫度環(huán)境，較低的環(huán)境溫度將直接影響肽段與金屬配位的化學(xué)反應(yīng)效率。如圖4C所示，鈣黃綠素低溫下的熒光強(qiáng)度相對(duì)較低，在25 ℃時(shí)熒光響應(yīng)信號(hào)最高，繼續(xù)升溫至30 ℃時(shí)存在一定的分子熒光猝滅。多肽分子的熒光恢復(fù)效率受溫度的影響如圖4D所示，其在20～25 ℃范圍內(nèi)的熒光恢復(fù)效率最高。結(jié)合鈣黃綠素分子自身熒光強(qiáng)度受溫度的影響情況，選定25 ℃為最佳反應(yīng)溫度。

2.2.3鈣黃綠素濃度的優(yōu)化對(duì)濃度分別為10-7～10-3mol/L的鈣黃綠素溶液進(jìn)行熒光分析，結(jié)果如圖4E所示。在鈣黃綠素濃度低于10-5mol/L時(shí)，熒光響應(yīng)信號(hào)較低。當(dāng)濃度大于10-4時(shí)熒光信號(hào)出現(xiàn)一定程度的自猝滅且熒光發(fā)射光譜出現(xiàn)了一定程度的藍(lán)移(藍(lán)移原因尚未查明)。當(dāng)鈣黃綠素的濃度保持在10-5～10-4mol/L時(shí)，溶液表現(xiàn)出最高的靈敏度。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇鈣黃綠素檢測(cè)的最終濃度為10-5～10-4mol/L范圍。

2.2.4反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)中，鈣黃綠素分子結(jié)合銅離子的熒光猝滅瞬間發(fā)生，這與分子間的能量傳遞有關(guān)。由于與銅離子間較強(qiáng)的親和性，多肽分子會(huì)奪取calcein-Cu(Ⅱ)配合物中的Cu(Ⅱ)形成peptide-Cu(Ⅱ)配合物，鈣黃綠素分子被釋放因而熒光信號(hào)恢復(fù)?？疾炝穗亩渭尤牒蟮姆磻?yīng)動(dòng)力學(xué)，以熒光強(qiáng)度作為參考值，以2 min 為取樣間隔，采集每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的熒光恢復(fù)數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖4F所示。發(fā)現(xiàn)22 min時(shí)熒光達(dá)到最大值，并在20～25 min前后保持相對(duì)穩(wěn)定。因此確定肽段奪取Cu(Ⅱ)的穩(wěn)定時(shí)間為22 min。

2.3 銅離子的檢測(cè)

在優(yōu)化條件下，考察了不同濃度的Cu(Ⅱ)對(duì)鈣黃綠素溶液的熒光猝滅作用，平行測(cè)定3組。銅離子與鈣黃綠素反應(yīng)迅速，將銅離子溶液加入到鈣黃綠素溶液中反應(yīng)5 min后檢測(cè)該Cu(Ⅱ)-calcein體系的熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)隨著銅離子濃度的增加熒光強(qiáng)度逐漸降低(圖5)，說(shuō)明隨著銅離子濃度的升高，發(fā)生熒光猝滅的calcein-Cu(Ⅱ)配合物逐漸增加，并得到隨Cu(Ⅱ)濃度(x)變化鈣黃綠素?zé)晒鈴?qiáng)度(y)梯度降低的標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=-248.45x(μmol/L)+3 994.12，相關(guān)系數(shù)R2=0.998。由于鈣黃綠素可與多種金屬離子結(jié)合產(chǎn)生熒光增強(qiáng)或猝滅，進(jìn)行實(shí)際檢測(cè)時(shí)，生活用水中的Ca(Ⅱ)、Mg(Ⅱ)等離子均會(huì)對(duì)其熒光強(qiáng)度產(chǎn)生干擾。本實(shí)驗(yàn)引入的對(duì)Cu(Ⅱ)具有特異性捕獲功能的肽段P5可使熒光恢復(fù)到一穩(wěn)定值?；跓晒鈴?qiáng)度恢復(fù)的平均值F2與相應(yīng)的各銅離子濃度(x)對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度猝滅值F1的差值(y)，構(gòu)建的銅離子檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=249.42x(μmol/L)+470.36，線性范圍為0.12～13 μmol/L(R2=0.995)，檢出限為127 nmol/L。

圖5 不同銅離子濃度下鈣黃綠素-銅離子體系的熒光光譜圖Fig.5 The fluorescence spectra of calcein-Cu system in different concentrations of Cu(Ⅱ)

根據(jù)國(guó)家環(huán)境安全標(biāo)準(zhǔn)中Cu(Ⅱ)的限定濃度1 mg/L(15.74 mmol/L，EPA標(biāo)準(zhǔn))，該方法可滿足日常生活用水及環(huán)境水中銅離子的定量檢測(cè)要求?；诒疚慕⒌姆椒?，將加標(biāo)處理后的自來(lái)水及湖水實(shí)際樣品按照Cu(Ⅱ)標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測(cè)方法加入到鈣黃綠素溶液中，保持5 min，檢測(cè)其熒光信號(hào)F1，加入肽段22 min后檢測(cè)其熒光信號(hào)F2，根據(jù)熒光恢復(fù)情況實(shí)現(xiàn)了對(duì)水樣中銅離子檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。為了證實(shí)方法的準(zhǔn)確性，通過(guò)原子吸收光譜法(AAS)進(jìn)行驗(yàn)證。AAS法所得結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)方法基本吻合(表1)，說(shuō)明該方法具有較好的實(shí)用性。

表1 實(shí)際樣品中銅離子檢測(cè)數(shù)據(jù)Table 1 The results of Cu(Ⅱ) detection in practical samples

3 結(jié) 論

本工作設(shè)計(jì)了一種基于特定多肽的熒光恢復(fù)型銅離子生物傳感器。依據(jù)生物體內(nèi)淀粉樣蛋白與Cu(Ⅱ)的特異性作用，設(shè)計(jì)了一系列可與Cu(Ⅱ)靶向作用的功能肽段P5。該肽段可快速奪取Calcein-Cu(Ⅱ)絡(luò)合物中的Cu(Ⅱ)并與其形成穩(wěn)定的配合物，同時(shí)促使Calcein熒光信號(hào)恢復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Cu(Ⅱ)的定量檢測(cè)。方法成功避免了其他金屬離子對(duì)銅離子檢測(cè)的干擾，改善了已有報(bào)道中氨基酸熒光信號(hào)恢復(fù)而伴隨的熒光穩(wěn)定性差且選擇性低等局限，增加了檢測(cè)的準(zhǔn)確度與可靠性。該方法簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定、選擇性強(qiáng)，線性范圍為0.12～13 μmol/L，檢出限為127 nmol/L，可滿足地表水及生活用水的正常檢測(cè)要求。