李瑋瑋，李雨軒，林金明

(清華大學(xué) 化學(xué)系，微量分析測(cè)試方法和儀器研制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 生命有機(jī)磷化學(xué)和化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100084)

液晶(Liquid crystal,LC)是一種性質(zhì)介于固態(tài)和液態(tài)的物質(zhì)態(tài)，既具備晶體固體的各向異性，也具備液體的流動(dòng)性[1]。一種固體材料在完全轉(zhuǎn)變?yōu)楦飨蛲缘囊合嘀?，可能?jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)以分子取向?yàn)樘卣鞯闹虚g液晶相，相轉(zhuǎn)變過(guò)程或受溶劑的影響，或受熱過(guò)程的驅(qū)動(dòng)，相應(yīng)的材料則被稱為溶致液晶和熱致液晶[2-3]。溶致液晶是當(dāng)兩親分子在有機(jī)或無(wú)機(jī)溶劑中的濃度達(dá)到一定范圍時(shí)，通過(guò)自組裝有序排列形成[4]。熱致液晶由棒狀或盤狀的各向異性分子組成，相變過(guò)程受溫度變化影響，僅在一定的溫度范圍內(nèi)呈現(xiàn)液晶性質(zhì)[5]。在20世紀(jì)60年代到70年代間，液晶科學(xué)得到迅速發(fā)展，期間液晶顯示技術(shù)的發(fā)展在很大程度上也推動(dòng)了基礎(chǔ)和應(yīng)用研究[6]。液晶顯示器一般使用棒狀熱致液晶，LC分子在一定強(qiáng)度的外加電場(chǎng)作用下發(fā)生取向變化。也就是說(shuō)，由各向異性分子組成的液晶與外加場(chǎng)相互作用，強(qiáng)烈地改變自身的排列結(jié)構(gòu)。更令科學(xué)家感興趣的是，除了物理場(chǎng)之外，LC對(duì)界面化學(xué)和生物物質(zhì)的變化也極為敏感。因此，近年來(lái)基于液晶化學(xué)/生物傳感器的研究取得了很大進(jìn)展，拓寬了液晶材料的應(yīng)用領(lǐng)域。液晶對(duì)界面的高靈敏響應(yīng)和固有的光學(xué)各向異性(雙折射特性)是液晶傳感分析化學(xué)/生物物質(zhì)的基礎(chǔ)[7]。生化分析物的刺激或界面附近發(fā)生生化反應(yīng)會(huì)影響LC分子間相互作用的力平衡，導(dǎo)致LC分子排列取向改變。在偏光顯微鏡(POM)下，LC分子的這種取向改變呈現(xiàn)出不同的偏光形貌。因此，液晶傳感分析消除了對(duì)標(biāo)記/標(biāo)簽的需求，可通過(guò)LC分子有效地放大生化信號(hào)的光學(xué)響應(yīng)。目前，已經(jīng)有許多綜述介紹了液晶傳感器在生物化學(xué)分析領(lǐng)域的應(yīng)用[8-10]。本綜述以近年來(lái)液晶生物傳感器在檢測(cè)生物小分子、生物大分子以及生物有機(jī)體(病毒、細(xì)菌、細(xì)胞)等方面的研究進(jìn)展為線索展開介紹，特別提到了其與微流控細(xì)胞芯片結(jié)合的新興領(lǐng)域的發(fā)展和挑戰(zhàn)。

1 生物小分子分析

液晶生物傳感器已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物小分子物質(zhì)的檢測(cè)分析，比如寡肽、磷脂、尿素、葡萄糖等。Bai等[11]研究了二肽有序單分子膜上向列相液晶的取向有序性：向列相液晶5CB(4-氰基-4′-戊基聯(lián)苯)和TL205(含環(huán)己烷氟化聯(lián)苯和氟化三苯的介晶混合物)在二肽有序單分子膜上的排列取向明顯受二肽的手性和磷酸化狀態(tài)的影響。上述屬于一種液晶-固體界面型的液晶生物傳感器，然而由于水對(duì)生物分子的結(jié)構(gòu)和功能具有重要的保護(hù)作用，因此一些關(guān)于液晶和水相形成界面的研究為創(chuàng)建液晶-水界面型的生物傳感器提供了新機(jī)會(huì)[12-13]。例如，Brake等[12,14]研究了引入磷脂的液晶-水界面上LC分子的排列取向變化，在純液晶-水界面上，LC分子傾向于平行于表面排列，即沿面排列(Planar)，而磷脂的引入誘導(dǎo)LC分子的取向變?yōu)榇姑媾帕?Homeotropic)；在含有酶負(fù)載液晶層的生物傳感器上引入含脂質(zhì)的水溶液可對(duì)酶促反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，酶促反應(yīng)發(fā)生前，LC分子由于磷脂的誘導(dǎo)作用在界面上呈垂面排列，隨著酶促反應(yīng)進(jìn)行，界面區(qū)域的脂質(zhì)被耗盡，LC分子的取向變?yōu)槠矫媾帕校瑢?duì)應(yīng)酶促反應(yīng)進(jìn)程，在POM下可觀察液晶層呈現(xiàn)不同的偏光光學(xué)形貌。類似的這種平面薄膜型的液晶傳感器(厚度通常為幾微米)，通過(guò)功能化修飾還可實(shí)現(xiàn)對(duì)抗生素及其水解酶的高靈敏檢測(cè)[15]。

液晶分散在水相溶液中形成的LC液滴也是液晶-水界面型傳感器的一種重要形式，在液晶生物傳感領(lǐng)域發(fā)展迅猛[16]。相比薄膜型液晶傳感器，LC液滴無(wú)需通過(guò)表面處理的固體基板來(lái)確定LC分子的初始排列方向，其分子的初始取向結(jié)構(gòu)由液滴界面的化學(xué)性質(zhì)決定[17]。目標(biāo)分析物吸附到LC液滴表面或在LC液滴附近發(fā)生反應(yīng)，觸發(fā)LC表面錨定的變化，從而使液滴內(nèi)LC分子呈現(xiàn)不同的排列取向[18-19]。Park課題組[20-21]設(shè)計(jì)了一種聚(丙烯酸-b-4-氰基聯(lián)苯-4′-十一烷基丙烯酸酯)(PAA-b-LCP)功能化的5CB液滴，并將脲酶或葡萄糖氧化酶共價(jià)固定在PAA鏈上，在POM下實(shí)現(xiàn)了對(duì)尿素和葡萄糖分子的高靈敏檢測(cè)。除了將POM作為觀測(cè)手段，Duan等[22]將硬脂酸摻雜5CB微液滴作為傳感反應(yīng)器和光學(xué)諧振腔，結(jié)合回音壁模式(Whispering gallery mode，WGM)激光技術(shù)，對(duì)生物小分子尿素進(jìn)行了高靈敏檢測(cè)(圖1)：尿素和脲酶之間的酶促反應(yīng)產(chǎn)生氫氧根離子，導(dǎo)致水/液晶界面的硬脂酸脫質(zhì)子化和自組裝，誘導(dǎo)了LC分子的排列取向變化；WGM激光光譜的可探測(cè)位移與LC分子的排列取向相關(guān)，指示酶促反應(yīng)進(jìn)程并實(shí)現(xiàn)了對(duì)尿素的定量檢測(cè)。

圖1 硬脂酸摻雜的5CB微液滴作為傳感反應(yīng)器和光學(xué)諧振腔，結(jié)合WGM激光技術(shù)用于尿素分子的檢測(cè)[22]Fig.1 Stearic acid-doped 5CB microdroplet as both optical resonator and sensing reactor,combined with whispering gallery mode(WGM) lasing technology for detection of urea[22]

2 生物大分子分析

液晶生物傳感器在檢測(cè)分析蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子方面也有廣泛的應(yīng)用?；诒∧ば蚅C傳感器，Hu等[23]設(shè)計(jì)了一種適配體靶向誘導(dǎo)解離輔助的功能性LC傳感方法，可同時(shí)檢測(cè)血液中多種腫瘤標(biāo)志物(見圖2)：適配體1(apt1)修飾的磁珠(MBs)特異性捕獲血液中的靶蛋白，靶蛋白包被的MBs與信號(hào)DNA/apt2共同孵育后，由于apt2對(duì)靶蛋白的特異性識(shí)別，在MBs上形成apt1/靶蛋白/apt2三明治復(fù)合物，誘導(dǎo)信號(hào)DNA釋放；信號(hào)DNA被負(fù)載互補(bǔ)DNA的LC傳感器特異性識(shí)別，引起LC傳感器偏光形貌的改變。類似地，他們還通過(guò)原位RCA反應(yīng)放大腫瘤標(biāo)志物信號(hào)，在原位RCA產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到十八烷基三甲基溴化銨(OTAB)修飾的LC界面后，液晶層的偏光形貌由暗變亮[24]。微流控技術(shù)在制備液滴型LC傳感器方面展現(xiàn)出巨大優(yōu)勢(shì)，制備的LC微液滴可用于生物大分子的特異性識(shí)別檢測(cè)。Khan等[25]通過(guò)液滴微流控的方法制備了PAA-b-LCP功能化的5CB液滴：與LCP嵌段緊密連接的PAA包覆在5CB液滴表面，通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)對(duì)其進(jìn)行生物素化修飾，用于特異性檢測(cè)水/LC界面上生物素(Biotin)—親和素(Avidin)的特異性反應(yīng)：生物素和親和素在液滴表面特異性識(shí)別結(jié)合后，引起液滴表面電荷密度的改變，導(dǎo)致5CB液滴在POM下呈現(xiàn)從輻射(Radial，R)到雙極(Bipolar，B)的織構(gòu)轉(zhuǎn)變，表明了功能化的LC液滴可通過(guò)配體-受體模型特定性地檢測(cè)蛋白質(zhì)或其他分析物。

3 生物有機(jī)體分析

LC液晶傳感器在檢測(cè)細(xì)菌、病毒和細(xì)胞等有機(jī)體方面展現(xiàn)出了巨大的潛能。單分散的5CB液晶液滴可用于區(qū)分不同類型的細(xì)菌和病毒，接觸革蘭氏陰性(G-)細(xì)菌和脂膜病毒發(fā)生從B到R的織構(gòu)轉(zhuǎn)變，而對(duì)G+細(xì)菌和非脂膜病毒則不會(huì)發(fā)生織構(gòu)轉(zhuǎn)變[26]。上述織構(gòu)轉(zhuǎn)變被歸因于脂質(zhì)從生物體向LC液滴的轉(zhuǎn)移。LC傳感器在細(xì)胞層面的應(yīng)用將有助于對(duì)細(xì)胞生命活動(dòng)的探索，推動(dòng)細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展。Yoon等[27]將與葉酸(FA)配體共軛的聚(苯乙烯-b-丙烯酸)嵌段共聚物(PS-b-PAA)修飾至5CB液晶液滴表面，LC液滴上的葉酸配體與人口腔表皮樣癌細(xì)胞(KB)的葉酸受體發(fā)生特異性相互作用，導(dǎo)致LC液滴發(fā)生R-B的織構(gòu)轉(zhuǎn)變，實(shí)現(xiàn)了對(duì)KB細(xì)胞的特異性識(shí)別(圖3)。該研究小組[28]進(jìn)一步設(shè)計(jì)了β-半乳糖與PS-b-PAA共軛修飾的5CB液晶液滴，對(duì)肝癌細(xì)胞(HepG2)的識(shí)別表現(xiàn)出了高度選擇性，HepG2細(xì)胞與β-半乳糖共軛的嵌段共聚物發(fā)生相互作用，有效地引起LC液滴發(fā)生R-B的織構(gòu)轉(zhuǎn)變，他們認(rèn)為嵌段共聚物的聚苯乙烯段將配體-受體的相互作用力從界面?zhèn)鬟f到LC液滴的內(nèi)部。但是以上用于細(xì)胞識(shí)別的LC液滴的尺寸與細(xì)胞的尺寸相當(dāng)，在檢測(cè)靈敏度上有待提高；另外，為了維持LC液滴在水相介質(zhì)中的形貌，需加入表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)，但SDS對(duì)細(xì)胞的毒害作用可能影響細(xì)胞活性。為了獲得更加靈敏的響應(yīng)和更好的生物相容性，Manna等[29]將液晶E7(一種向列相液晶混合物，向列相的溫度范圍TN=10～60 ℃)封裝在共價(jià)交聯(lián)的聚合物微膠囊中，實(shí)時(shí)檢測(cè)細(xì)胞周圍介質(zhì)中是否存在對(duì)細(xì)胞有害的物質(zhì)，但未追蹤細(xì)胞釋放的分子或離子的動(dòng)態(tài)變化。

圖3 葉酸配體修飾的LC液滴體外檢測(cè)人口腔表皮樣癌細(xì)胞[27]Fig.3 Folate ligand anchored liquid crystal microdroplets emulsion for in vitro detection of KB cancer cells[27]

4 微流控芯片細(xì)胞分析中的應(yīng)用

微流控芯片由于小型化、集成化等優(yōu)點(diǎn)，容易實(shí)現(xiàn)與液晶傳感器的結(jié)合，在細(xì)胞分析領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。將液晶生物傳感器引入微流控細(xì)胞芯片是細(xì)胞分析前沿的一個(gè)嶄新領(lǐng)域。本課題組在與微流控細(xì)胞芯片結(jié)合的液晶生物傳感方面進(jìn)行了開發(fā)和研究：如通過(guò)設(shè)計(jì)一種具有良好生物相容性的聚合物封裝的液晶微滴(P-E7PBA)，可固定在微流控芯片上培養(yǎng)的細(xì)胞表面高靈敏度、高選擇性地實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞/單細(xì)胞釋放的NH3[30]：通過(guò)將摻雜4-戊基聯(lián)苯-4′-羧酸(PBA)的液晶E7封裝在聚電解質(zhì)層層自組裝的微膠囊中制備P-E7PBA；由于P-E7PBA聚合物層外表面的氨基有利于其固定在負(fù)電荷的細(xì)胞膜表面，固定在細(xì)胞膜上的P-E7PBA響應(yīng)細(xì)胞釋放的NH3，并引起自身表面電荷密度的改變，誘導(dǎo)了LC分子的排列取向變化，POM下可觀察到P-E7PBA從R到B的織構(gòu)轉(zhuǎn)變。考慮到P-E7PBA聚電解質(zhì)層層自組裝的制備耗時(shí)，我們進(jìn)一步設(shè)計(jì)了可直接固定在微流控芯片上培養(yǎng)的細(xì)胞表面的辣根過(guò)氧化物酶修飾的液晶彈性體微球(LCEM-HRP)，以超高分辨率、選擇性監(jiān)測(cè)細(xì)胞釋放的H2O2(圖4)[31]：LCEM-HRP通過(guò)一種同心(Concentric，C)向輻射(Radial，R)的織構(gòu)轉(zhuǎn)變(C-R)可視化實(shí)時(shí)報(bào)告細(xì)胞產(chǎn)生的H2O2，這是由于HRP催化還原H2O2引起了微球的去質(zhì)子化和內(nèi)部鏈間/鏈內(nèi)氫鍵斷裂；細(xì)胞表面的LCEM-HRP發(fā)生C-R織構(gòu)轉(zhuǎn)變的水平反映了細(xì)胞H2O2釋放量的差異，由此可探索細(xì)胞系和細(xì)胞-細(xì)胞的異質(zhì)性。

圖4 一種辣根過(guò)氧化物酶修飾的液晶彈性體微球(LCEM-HRP)可直接固定在2D微流控芯片上培養(yǎng)的細(xì)胞表面監(jiān)測(cè)細(xì)胞釋放的H2O2[31]Fig.4 Elastomer microspheres functionalized with horse-radish peroxidase(LCEM-HRP) can be immobilized directly on the surface of cells cultured on a 2D microfluidic chip to minitor the releasing of H2O2 from cells[31](A) LCEM-HRP immobilized directly on cell membrane to visualize the real-time releasing of H2O2 from a single-living cell;(B) LCEM-HRP responds to the releasing of H2O2 from cells,and changes the orientation of LC molecules;(C) With a POM,LCEM-HRP shows a concentric to radial transfiguration((A) LCEM-HRP直接固定在細(xì)胞膜上用于監(jiān)測(cè)單個(gè)細(xì)胞釋放H2O2；(B) LCEM-HRP響應(yīng)細(xì)胞釋放的H2O2，液晶分子的取向發(fā)生改變；(C) 在POM下，LCEM-HRP呈現(xiàn)從同心到輻射的織構(gòu)改變圖像)

上述P-E7PBA和LCEM-HRP引入的均為2D微流控細(xì)胞芯片，隨芯片內(nèi)微流體的層流流動(dòng)，可直接固定在細(xì)胞表面對(duì)細(xì)胞釋放的分子進(jìn)行特異性的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，依托于微流控芯片的優(yōu)勢(shì)，該方法顯著減少了樣品試劑的用量和體積。微流控細(xì)胞芯片除了支持細(xì)胞培養(yǎng)，還可為體外細(xì)胞模擬/重構(gòu)體內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境[32-33]。在模擬細(xì)胞微環(huán)境下，如機(jī)械應(yīng)力刺激、生化因子濃度梯度分布以及細(xì)胞-細(xì)胞相互作用等，通過(guò)集成的液晶生物傳感器實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞及其微環(huán)境變化的監(jiān)測(cè)，對(duì)細(xì)胞分析和細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展具有重大意義。

然而，目前將液晶生物傳感器引入微流控細(xì)胞分析還是一個(gè)嶄新的領(lǐng)域，面臨著許多問(wèn)題與挑戰(zhàn)。首先，微流控芯片允許進(jìn)行2D/3D細(xì)胞培養(yǎng)以及細(xì)胞微環(huán)境模擬，然而不同培養(yǎng)維度下細(xì)胞微環(huán)境在空間組織結(jié)構(gòu)、物質(zhì)傳輸方式、濃度梯度分布等方面存在差異性，要求設(shè)計(jì)適合不同細(xì)胞培養(yǎng)維度的液晶微傳感器以獲取真實(shí)的細(xì)胞生命活動(dòng)信息。在2D靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)條件下，檢測(cè)以細(xì)胞作為唯一來(lái)源或者消耗的物質(zhì)濃度，與距離細(xì)胞的位置有直接關(guān)系，為了獲取接近細(xì)胞真實(shí)釋放或者消耗水平的定量檢測(cè)，有必要在細(xì)胞附近甚至是細(xì)胞表面引入一個(gè)位置明確的傳感器。能夠固定在細(xì)胞表面的液晶生物傳感器要求尺寸應(yīng)在幾微米，且具有良好的生物相容性和長(zhǎng)時(shí)間的機(jī)械穩(wěn)定性，甚至可以在細(xì)胞表面以可控?cái)?shù)量和明確位置進(jìn)行精確固定，這需要進(jìn)一步研究方可實(shí)現(xiàn)。而3D細(xì)胞培養(yǎng)具有更加復(fù)雜的化學(xué)性和空間性，對(duì)引入其中的液晶生物傳感器在滿足2D細(xì)胞培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上提出了更高要求。例如，向一種廣泛使用的3D細(xì)胞培養(yǎng)模型——多細(xì)胞微球中引入液晶生物傳感器以檢測(cè)細(xì)胞代謝物質(zhì)，而對(duì)于引入傳感器的位置和幾何形狀設(shè)計(jì)，以及代謝物質(zhì)向傳感器的運(yùn)輸方式等問(wèn)題尚需進(jìn)行更深入的研究。此外，細(xì)胞界面現(xiàn)象的多樣性和復(fù)雜性，以及目標(biāo)生化分析物呈現(xiàn)的化學(xué)官能團(tuán)的多樣性和復(fù)雜性，不但增加了傳感設(shè)計(jì)的難度，也使得預(yù)測(cè)LC分子在含目標(biāo)分析物的界面上的排列取向成為一個(gè)亟待解決的特殊挑戰(zhàn)。

5 結(jié) 論

液晶傳感器具有的許多獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，如對(duì)界面物理化學(xué)性質(zhì)響應(yīng)敏感，容易通過(guò)化學(xué)修飾實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的特異性識(shí)別，無(wú)需對(duì)目標(biāo)生物分子進(jìn)行標(biāo)記，界面液晶分子的取向變化傳至液晶本體快速放大信號(hào)響應(yīng)，以及可實(shí)現(xiàn)小型化和生物相容性設(shè)計(jì)等，使其在生物傳感分析方面展現(xiàn)出了非凡的應(yīng)用價(jià)值。本文針對(duì)近年來(lái)液晶生物傳感器在檢測(cè)分析生物大/小分子和生物有機(jī)體等方面的研究進(jìn)展做了簡(jiǎn)要綜述。此外，還特別介紹了新興領(lǐng)域——液晶生物傳感器引入微流控芯片細(xì)胞分析當(dāng)前的發(fā)展與面臨的挑戰(zhàn)?？傊?，目前液晶生物傳感器已發(fā)展到檢測(cè)分析細(xì)胞等生物有機(jī)體，然而就液晶傳感器的尺寸、穩(wěn)定性、特異性、生物相容性、傳感設(shè)計(jì)原理以及對(duì)不同細(xì)胞培養(yǎng)模型的適用性等諸多問(wèn)題還值得進(jìn)行更加深入的設(shè)計(jì)與研究。