王超群，劉 睿，周 靜，呂 弋*

(1.四川大學(xué) 分析測(cè)試中心，四川 成都 610064；2.四川大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，四川 成都 610064)

癌癥具有發(fā)病率高且生存率低的特點(diǎn)，是導(dǎo)致70歲之前死亡的首要原因。2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全球估計(jì)有1 930萬例新病例和1 000萬例癌癥死亡病例[1]。除遺傳因素外，環(huán)境污染物、化學(xué)致癌物和不健康生活方式等多種因素也會(huì)導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。早期診斷和治療可以減少醫(yī)療成本，減輕患者痛苦,是提高患者治愈率最有效的途徑。因此，對(duì)惡性腫瘤的早期診斷具有重要意義。

腫瘤標(biāo)志物主要包括腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的分子以及與腫瘤相關(guān)正常組織產(chǎn)生的代謝和免疫產(chǎn)物[2]。在正常人體內(nèi)，腫瘤標(biāo)志物通常以低水平存在，當(dāng)腫瘤形成、組織轉(zhuǎn)移或治療干預(yù)后其濃度會(huì)發(fā)生變化[3]。因此，腫瘤標(biāo)志物的臨床分析有助于癌癥的早期診斷和治療進(jìn)展監(jiān)測(cè)。結(jié)直腸癌是除肺癌外死亡率最高的癌癥，通過篩查檢測(cè)出癌癥的前體腺瘤息肉進(jìn)行清除，即可預(yù)防癌癥的發(fā)生[4]。數(shù)據(jù)顯示，90年代中期，大多數(shù)高收入國家引入前列腺特異性抗原(PSA)檢測(cè)后，前列腺癌的死亡率有所下降[1]。因此，發(fā)展檢測(cè)臨床樣品(血液和血清等)中腫瘤標(biāo)志物的高靈敏方法對(duì)疾病的診斷、預(yù)防與治療具有重要意義。

目前，生物標(biāo)志物的檢測(cè)方法主要包括放射免疫分析法[5]、電泳免疫法[6]、酶聯(lián)免疫吸附法[7]、熒光光譜法[8-9]、電化學(xué)法[10]和質(zhì)譜法[11]等。其中，質(zhì)譜法主要是基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記策略和電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)發(fā)展的生物分析方法[12]。ICP-MS具有分辨率高、靈敏度高、動(dòng)態(tài)范圍寬(9個(gè)數(shù)量級(jí))以及可多元素同時(shí)檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)[13]。近二十年來，基于ICP-MS的分析方法已廣泛應(yīng)用于金屬離子[14]、核酸[15]、肽鏈[16]、蛋白質(zhì)[17-18]、酶分子[19-21]、其他小分子[22-23]以及單個(gè)細(xì)胞[24-25]的檢測(cè)。基于金屬元素螯合物、包含金屬元素的聚合物以及金屬納米顆粒等金屬同位素標(biāo)記的質(zhì)譜分析法也已被廣泛用于生物標(biāo)志物的檢測(cè)[11]。本文總結(jié)了常見腫瘤標(biāo)志物和相關(guān)癌癥類型，并詳細(xì)介紹了癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性抗原(PSA)和甲胎蛋白(AFP) 3種最常見的腫瘤標(biāo)志物及其ICP-MS檢測(cè)方法。由于僅對(duì)一種腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)可能會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果，采用多組分檢測(cè)可有效降低假陽性率，提高診斷特異性。多組分檢測(cè)具有樣品消耗少、分析時(shí)間短、測(cè)試成本低和診斷準(zhǔn)確性高的優(yōu)勢(shì)。因此，生物標(biāo)志物的多組分檢測(cè)受到了越來越多的關(guān)注[26]。結(jié)合激光燒蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜(LA-ICP-MS)和流式細(xì)胞質(zhì)譜儀可以實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)微陣列點(diǎn)、細(xì)胞以及癌癥組織上多種蛋白的同時(shí)測(cè)量。本文也簡要總結(jié)了ICP-MS在多組分生物標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)中的應(yīng)用，并對(duì)多組分分析方法構(gòu)建所面臨的挑戰(zhàn)進(jìn)行了探討。

1 基于ICP-MS檢測(cè)的生物分析方法

質(zhì)譜方法的主要構(gòu)建機(jī)制包括以下步驟：首先以堿基互補(bǔ)配對(duì)、適體與目標(biāo)物特異性結(jié)合及抗原抗體的特異性反應(yīng)等生物相互作用實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的精確識(shí)別，其次，通過修飾穩(wěn)定同位素標(biāo)簽產(chǎn)生ICP-MS信號(hào)?；驹硎菍⑸镄盘?hào)轉(zhuǎn)化為ICP-MS信號(hào)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的定量分析。目前，該方法所涉及的穩(wěn)定同位素標(biāo)簽包括金屬元素螯合物、金屬元素的聚合物以及金屬納米顆粒等[13,27]。根據(jù)生物相互作用的不同，可以將質(zhì)譜分析方法分為免疫分析法和基于核酸的分析方法兩類。

1.1 免疫分析方法

免疫分析方法是基于抗原抗體的特異性結(jié)合而建立的，其分析對(duì)象主要是蛋白質(zhì)類的生物標(biāo)志物[28]。1959年，放射性免疫分析方法首次被用于檢測(cè)胰島素[5]，該法具有較高的特異性和靈敏度，但放射性污染阻礙了其進(jìn)一步的廣泛應(yīng)用。采用穩(wěn)定同位素標(biāo)簽替換放射性標(biāo)簽，結(jié)合ICP-MS檢測(cè)，不僅可以成功避免放射性污染，而且具有靈敏度高、準(zhǔn)確性高和可多組分檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)。2001年，張新榮教授課題組[29]首次報(bào)道了以Eu的金屬螯合物(DTTA-Eu3+)為標(biāo)簽的質(zhì)譜免疫分析方法，實(shí)現(xiàn)了促甲狀腺激素(TSH)的定量檢測(cè)。除金屬螯合物外，常用的標(biāo)簽還有含金屬的聚合物和金屬納米顆粒等。如圖1所示，一種具有多個(gè)金屬螯合配體的水溶性聚合物標(biāo)簽[30]，在該聚合物的末端設(shè)計(jì)有馬來酰亞胺基團(tuán)，使其可成功地與抗體上的—SH偶聯(lián)。通過改變與配體螯合的鑭系元素種類，即可獲得具有不同ICP-MS信號(hào)的標(biāo)簽。每個(gè)金屬納米顆粒和含金屬聚合物標(biāo)簽中都具有大量的金屬原子[31]，這在很大程度上提高了檢測(cè)方法的靈敏度。金屬納米顆粒的懸浮液與離子溶液在ICP炬中具有相同的霧化效率[32]，表明ICP-MS具有較好的原子化效率，能夠滿足對(duì)各種標(biāo)簽的定量檢測(cè)。通常在ICP-MS采集數(shù)據(jù)之前會(huì)對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行消解，以獲得更準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。

圖1 金屬螯合聚合物標(biāo)記抗體的實(shí)驗(yàn)示意圖[30]Fig.1 Schematic diagram of metal chelating polymer labeling antibody experiment[30]

1.2 基于核酸的分析方法

基于核酸的分析方法主要可分為兩類，第一類是以適體與目標(biāo)物特異性結(jié)合為基礎(chǔ)建立的方法，主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)類疾病標(biāo)志物的檢測(cè)；第二類是以堿基互補(bǔ)配對(duì)原則為基礎(chǔ)建立的方法，主要應(yīng)用于核酸類疾病標(biāo)志物的檢測(cè)。目前，已發(fā)展了大量基于核酸的分析方法用于腫瘤標(biāo)志物的單組分[33-37]或多組分[38]檢測(cè)。適體是通過指數(shù)富集(SELEX)程序?yàn)槟繕?biāo)物篩選出的人工RNA或單鏈DNA。復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)使其與目標(biāo)物具有高度適配性和極高的親和力。如圖2所示，樂曉春課題組[39]分別在磁珠和金納顆粒上修飾適配體，模擬免疫反應(yīng)形成三明治結(jié)構(gòu)，建立了基于適體特異性檢測(cè)凝血酶的分析方法。同理，分別將磁珠和標(biāo)簽與目標(biāo)物部分互補(bǔ)的兩段DNA鏈偶聯(lián)，以堿基互補(bǔ)配對(duì)原則形成磁珠-目標(biāo)物-標(biāo)簽復(fù)合物，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)鏈的定量檢測(cè)[40]。

圖2 基于適配體的ICP-MS生物分析方法示意圖[39]Fig.2 Schematic diagram of aptamer-based ICP-MS bioassay[39]

2 腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)

腫瘤標(biāo)志物主要包括腫瘤細(xì)胞釋放的分子以及與腫瘤相關(guān)正常組織產(chǎn)生的代謝和免疫產(chǎn)物。腫瘤標(biāo)志物可以提供癌癥種類、腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后情況等相關(guān)信息。通過非侵入式方法檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物，可減少患者痛苦，減輕醫(yī)療負(fù)擔(dān)，擴(kuò)大篩查對(duì)象范圍，為癌癥的早期診斷提供有力幫助。常見的腫瘤標(biāo)志物和相關(guān)的癌癥類型見表1[41]。

表1 常見的腫瘤標(biāo)志物和最相關(guān)的癌癥類型Table 1 Common tumor markers and relevant cancer types

2.1 癌胚抗原

癌胚抗原(CEA)是胚胎發(fā)育過程中由胃腸道細(xì)胞產(chǎn)生的一種分子量約180 kDa的糖蛋白，在健康成年人血液中的表達(dá)水平相對(duì)較低,它是一種廣譜型腫瘤標(biāo)志物，濃度異常升高與大腸癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌和卵巢癌有關(guān)。盡管它不能作為檢測(cè)早期某種惡性腫瘤的特異性標(biāo)志物，但在監(jiān)測(cè)和預(yù)后方面具有重要的臨床價(jià)值，特別是通過連續(xù)CEA測(cè)量來檢測(cè)復(fù)發(fā)性結(jié)直腸癌[42]。

迄今為止，已經(jīng)建立了許多基于ICP-MS檢測(cè)CEA的免疫分析方法，這些方法大多是結(jié)合穩(wěn)定同位素標(biāo)簽策略構(gòu)建。為了控制元素標(biāo)簽與抗體的標(biāo)記效率，標(biāo)記過程中會(huì)加入過量的標(biāo)簽進(jìn)行反應(yīng)，因此必須通過分離多余的標(biāo)簽來降低背景信號(hào)。胡斌教授課題組[62]通過尺寸排阻色譜(SEC)法有效地分離了過量的汞和汞標(biāo)記的抗體。另外，選擇合適的基底材料，將抗體固定到磁珠[63]或微孔板[64]表面，待免疫反應(yīng)結(jié)束后采用磁分離等手段將過量標(biāo)簽去除，再通過洗滌可進(jìn)一步降低背景信號(hào)。考慮到分離、洗滌等步驟操作繁瑣，基于單顆粒模式ICP-MS檢測(cè)的均相免疫方法具有無需分離，操作簡單，檢測(cè)速度快的優(yōu)勢(shì)，故也被用于CEA分析。ICP-MS的單顆粒模式可以記錄由等離子體火炬中的離子閃爍引起的瞬態(tài)信號(hào)，該瞬態(tài)信號(hào)的頻率與標(biāo)記在抗體上的納米粒子數(shù)量相關(guān)。如鄧必陽教授課題組[65]通過記錄ZnSe量子點(diǎn)電離引起的瞬態(tài)信號(hào)頻率成功測(cè)定了血清樣品中CEA濃度。單顆粒模式ICP-MS的兩種分析模式(頻率和強(qiáng)度)相互之間具有很好的相關(guān)性，從而為準(zhǔn)確的免疫測(cè)定提供了一種自驗(yàn)證機(jī)制[66]。同時(shí)記錄單個(gè)金納米顆粒的頻率和強(qiáng)度來進(jìn)行自我驗(yàn)證的均質(zhì)免疫測(cè)定方法，可以實(shí)現(xiàn)更準(zhǔn)確的定量檢測(cè)。

2.2 前列腺特異性抗原與前列腺特異性膜抗原

前列腺特異性抗原(PSA)是一種分子量為33 kDa的糖蛋白酶[43]，是前列腺癌的特異性標(biāo)志物。生化復(fù)發(fā)(BCR)往往早于臨床癥狀出現(xiàn)，被認(rèn)為是最好的前列腺癌復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)因子，BCR的早期檢測(cè)又取決于PSA分析的靈敏度。臨床實(shí)踐表明，監(jiān)測(cè)血清中PSA對(duì)判斷前列腺癌患者術(shù)后是否復(fù)發(fā)非常有效。因此，發(fā)展高靈敏的PSA檢測(cè)方法具有重要意義。

近年來，納米顆粒(NPs)被廣泛應(yīng)用于生物分析領(lǐng)域，多種類型的納米顆粒也在質(zhì)譜分析中被用作標(biāo)簽，包括貴金屬納米顆粒，納米團(tuán)簇(NCs)和量子點(diǎn)(QD)等[31]。基于納米顆粒(例如TiO2NPs[67])標(biāo)記的ICP-MS檢測(cè)方法也被用于PSA檢測(cè)。為進(jìn)一步提高檢測(cè)方法的靈敏度，Sanz-Medel課題組[68]報(bào)道了一種基于金屬離子沉積的信號(hào)擴(kuò)增方法。如圖3所示，待PSA夾心型免疫后，Mn摻雜的ZnS量子點(diǎn)作為成核位點(diǎn)，將溶液中的金離子催化還原為單質(zhì)金，檢測(cè)擴(kuò)增后的納米標(biāo)簽即可實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。與直接標(biāo)記大粒徑的金屬納米顆粒相比，該方法可成功規(guī)避免疫反應(yīng)時(shí)由大粒徑引起的位阻效應(yīng)。

圖3 基于Mn摻雜的ZnS QDs標(biāo)簽結(jié)合金增強(qiáng)檢測(cè)PSA的原理示意圖[68]Fig.3 Schematic diagram of PSA detection based on Mn-doped ZnS QDs tag combined with gold enhancement[68]

前列腺特異性膜抗原(PSMA)是一種細(xì)胞表面蛋白，在侵襲性前列腺癌腫瘤中高度表達(dá)[69]，其水平升高與腫瘤體積增加和生存期縮短有關(guān)。王秋泉教授課題組[44]設(shè)計(jì)了一種近紅外和電感耦合等離子體質(zhì)譜雙功能探針，采用兩種模式分別成像和定量了PSMA及其剪接變體。

圖4 基于金納米顆粒和銀納米顆粒標(biāo)簽檢測(cè)總AFP和AFP-L3的原理示意圖[72]Fig.4 Schematic diagram of total AFP and AFP-L3 detection with gold nanoparticles and silver nanoparticles labeling[72]

2.3 甲胎蛋白

甲胎蛋白(AFP)是分子量約70 kDa的糖蛋白，在胎兒發(fā)育早期由肝臟和卵黃囊產(chǎn)生，出生后其表達(dá)水平降低。AFP濃度的升高通常與肝細(xì)胞再生、肝癌和胚胎癌有關(guān)。肝細(xì)胞癌(HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，生存率很低。在臨床上，血清中AFP的檢測(cè)可結(jié)合肝超聲檢查對(duì)高危患者進(jìn)行HCC篩查和診斷，監(jiān)測(cè)部分HCC患者腫瘤進(jìn)展和協(xié)助腫瘤分期等[45]。

張新榮教授課題組[70]和胡斌教授課題組[71]分別報(bào)道了基于金納米顆粒和鑭系元素?fù)诫s的上轉(zhuǎn)換納米顆粒[71]為標(biāo)簽的AFP免疫分析方法。臨床分析表明，AFP具有AFP-L1、AFP-L2和AFP-L3三種亞型，血清中AFP-L1主要來自于良性肝病，AFP-L2主要來自孕婦，AFP-L3主要與HCC相關(guān)，當(dāng)AFP-L3占總AFP的10%以上時(shí)，肝癌的發(fā)生率大于95%。因此，對(duì)AFP-L3占總AFP的比值檢測(cè)具有重要意義。最近，本課題組[72]以膠體金納米顆粒(AuNP)和膠體銀納米顆粒(AgNP)作為標(biāo)記(圖4)，通過不同的識(shí)別方法同時(shí)檢測(cè)了總AFP和AFP-L3，檢出限(LOD)分別為0.1 ng·mL-1和0.2 ng·mL-1。

3 腫瘤標(biāo)志物的多組分同時(shí)檢測(cè)

上述生物分析方法大多每次只檢測(cè)一種腫瘤標(biāo)志物，但大多數(shù)腫瘤標(biāo)志物不止對(duì)應(yīng)一種癌癥(如CEA與多種癌癥相關(guān))，且大多數(shù)癌癥也不止對(duì)應(yīng)一種腫瘤標(biāo)志物，僅檢測(cè)一種腫瘤標(biāo)志物可能會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果。采用多組分檢測(cè)可有效降低假陽性率，提高診斷特異性。與單組分檢測(cè)相比，多組分檢測(cè)具有樣品消耗少、分析時(shí)間短、測(cè)試成本低和診斷準(zhǔn)確性高的優(yōu)勢(shì)。因此，生物標(biāo)志物的多組分檢測(cè)受到了越來越多的關(guān)注[26]。

多組分分析方法的設(shè)計(jì)需考慮兩個(gè)要素：①設(shè)計(jì)可區(qū)分的標(biāo)記探針；②提高方法的靈敏度，補(bǔ)償因待測(cè)物增加而降低的信噪比。目前，基于不同鑭系元素或納米顆粒為標(biāo)記的方法已被大量用于同時(shí)檢測(cè)多組分miRNA類[73-75]和蛋白質(zhì)類[47]腫瘤標(biāo)志物。如Lobinski課題組[76]利用高分辨率尺寸排阻色譜法結(jié)合5種不同鑭系元素實(shí)現(xiàn)了對(duì)5個(gè)癌癥生物標(biāo)志物(AFP、hCG、CEA、CA125和CA19-9)的檢測(cè)。本課題組[77]以3種納米顆粒(AuNP、AgNP和PtNP)為標(biāo)記，采用單顆粒ICP-MS的同時(shí)檢測(cè)了3種胰腺癌標(biāo)記物(CA125、CEA和CA199)。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合激光燒蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜(LA-ICP-MS)檢測(cè)手段可實(shí)現(xiàn)在單個(gè)微陣列點(diǎn)[78]、蛋白質(zhì)印跡膜[79-80]、細(xì)胞[81]以及癌癥組織上[61]的蛋白質(zhì)多組分分析；結(jié)合流式細(xì)胞質(zhì)譜儀可實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)細(xì)胞上多種蛋白的同時(shí)檢測(cè)[25,82]。結(jié)合信號(hào)放大手段可進(jìn)一步提高方法靈敏度，如RCA[18,83]、PCR、DNA核酶催化[84]和雙鏈特異性核酸酶擴(kuò)增[38]等。張新榮教授課題組[85]將疊氮修飾的鑭系金屬螯合物與具有大量炔烴DNA支架(PCR技術(shù)合成)發(fā)生點(diǎn)擊反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了信號(hào)放大，與單元素標(biāo)簽相比，該方法檢出限大約降低了2個(gè)數(shù)量級(jí)。

4 結(jié)論與展望

ICP-MS具有分辨率高、靈敏度高、動(dòng)態(tài)范圍寬以及可多元素同時(shí)檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)?；诮饘僭仳衔?、包含金屬元素的聚合物以及金屬納米顆粒等標(biāo)記策略，結(jié)合ICP-MS的生物分析方法已廣泛應(yīng)用于腫瘤標(biāo)記物的檢測(cè)。將其用于多組分標(biāo)志物檢測(cè)，可提高疾病診斷的準(zhǔn)確率，同時(shí)節(jié)約測(cè)量成本和減輕患者痛苦。但這些方法仍然存在一定的局限性，例如：基于鑭系元素螯合物標(biāo)記的方法靈敏度低；基于金屬納米顆粒標(biāo)記的方法非特異性吸附高，往往需要復(fù)雜的封閉程序來減少背景信號(hào)；多組分檢測(cè)方法還存在交叉反應(yīng)及待測(cè)物數(shù)量增加導(dǎo)致靈敏度降低的缺點(diǎn)。盡管如此，基于元素標(biāo)記的ICP-MS檢測(cè)生物分析方法仍然具有非?？捎^的發(fā)展前景，在未來我們可以：①發(fā)展基于ICP-MS檢測(cè)的新型創(chuàng)新策略；②將ICP-MS與其他技術(shù)(例如大數(shù)據(jù)分析)相結(jié)合，獲得更準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果；③發(fā)展靈敏度更高和更可靠的定量分析方法，將實(shí)驗(yàn)室研究成果轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用技術(shù)。