白青山， 宋鵬， 于艷， 高慧

(1.唐山市婦幼保健院 消化內(nèi)科， 河北 唐山 063000；2.唐山市婦幼保健院 兒內(nèi)科， 河北 唐山 063000； 3.唐山市婦幼保健院 內(nèi)科， 河北 唐山 063000)

近年來，我國(guó)兒童肥胖發(fā)病率逐年增加，已成為公共衛(wèi)生的一大挑戰(zhàn)[1]。肥胖與多數(shù)疾病密切相關(guān)，如肥胖相關(guān)腎病、糖尿病及非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)等[2]。幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)感染與肥胖關(guān)系密切，二者相互作用可調(diào)節(jié)胰島素抵抗、炎癥因子、脂質(zhì)代謝及腸道菌群等參與NAFLD發(fā)病及進(jìn)展[3]。NAFLD是一種以肝臟細(xì)胞脂肪變性為特征的臨床綜合癥，若不及時(shí)進(jìn)行干預(yù)，極易發(fā)展為肝纖維化、肝硬化等[4]，探究Hp陽性肥胖患者并發(fā)NAFLD的機(jī)制、預(yù)判并發(fā)NAFLD的生物標(biāo)志物具有重要意義。網(wǎng)狀蛋白1C(reticulin 1C，RTN-1C)是一種主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的網(wǎng)狀蛋白，可調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)和功能[5-6]。有研究報(bào)道RTN-1C過表達(dá)可激活細(xì)胞自噬，干擾其表達(dá)則可抑制細(xì)胞自噬[7]。脂噬是一種選擇性自噬，可選擇性識(shí)別脂質(zhì)并將其降解，從而維持細(xì)胞正常的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)，已被證實(shí)與肥胖、NAFLD有關(guān)[8]，關(guān)于RTN-1C與Hp陽性肥胖并發(fā)NAFLD關(guān)系的研究較缺乏。因此，本研究觀察RTN-1C在Hp陽性肥胖患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中的水平，分析其與并發(fā)NAFLD及其嚴(yán)重程度的關(guān)系，探究RTN-1C在Hp陽性肥胖并發(fā)NAFLD的發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2019年1月—2020年5月本院就診的Hp陽性肥胖患兒作為研究對(duì)象，均符合《中國(guó)學(xué)齡兒童青少年超重、肥胖篩查體質(zhì)量指數(shù)值分類標(biāo)準(zhǔn)》[9]中肥胖診斷標(biāo)準(zhǔn)[體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)高于同年齡、性別的兒童的第95百分位數(shù)]并經(jīng)13C-尿素呼氣試驗(yàn)檢查確診為Hp陽性。排除以下情況：應(yīng)用影響血脂、血糖或肝功能藥物；下丘腦、垂體或甲狀腺異常引起的肥胖；糖尿病或空腹血糖高于5.6 mmol/L；肝、腎功能異常(NAFLD除外)；伴惡性腫瘤；有飲酒史。納入Hp陽性肥胖患兒206例，男123例、女83例，年齡7～14歲、中位年齡10歲。參照《兒童非酒精性脂肪肝病診斷與治療專家共識(shí)》[10]診斷NAFLD，根據(jù)是否并發(fā)NAFLD將206例Hp陽性肥胖患兒分為非NAFLD組(n=63)和NAFLD組(n=143)，2組患兒的基線資料見表1。本研究入組的所有患兒的監(jiān)護(hù)人簽署了知情同意書，本研究經(jīng)唐山市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2019-015-001)。

1.2 方法

1.2.1臨床資料收集 收集所有患兒年齡、性別、BMI、疾病史、空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)等資料，同時(shí)計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment of insulin resist，HOMA-IR，計(jì)算公式 HOMA-IR=FBG×FINS/22.5)[11]。

1.2.2NAFLD嚴(yán)重程度判定 根據(jù)B超結(jié)果判斷NAFLD組患兒嚴(yán)重程度，包括：(1)肝臟輕中度腫大且邊緣角圓鈍;(2)肝臟內(nèi)管道結(jié)構(gòu)不清晰;(3)肝臟內(nèi)血流信號(hào)減弱但血管走向正常;(4)肝區(qū)進(jìn)場(chǎng)回聲彌漫性增強(qiáng)、遠(yuǎn)場(chǎng)回聲逐漸減弱；具備任1項(xiàng)定義為輕度，任2項(xiàng)定義為中度，具備任2項(xiàng)且肝右葉包膜和橫膈回聲顯示不清或不完整定義為重度[12]。

1.2.3外周血單個(gè)核細(xì)胞中RTN-1C水平檢測(cè) 采用Ficoll密度梯度離心法[13]分離外周血中單個(gè)核細(xì)胞?；純焊闻KB超檢查當(dāng)日抽取空腹肘部靜脈血10 mL，磷酸鹽緩沖溶液稀釋，置于Ficoll分離液中低溫環(huán)境下2 000 r/min 離心20 min，吸取外周血單個(gè)核細(xì)胞層，用磷酸鹽緩沖溶液重懸細(xì)胞，1 500 r/min離心10 min，重復(fù)上述操作2次，吸取單個(gè)核細(xì)胞。用蛋白質(zhì)免疫印跡法[14]檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞中RTN-1C水平：用放射免疫沉淀(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解緩沖液裂解單個(gè)核細(xì)胞，獲取總蛋白，用二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒定量；用10%SDS-PAGE分離膠電泳，120 V至溴酚藍(lán)跑出膠面，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；兔抗人RTN-1C單克隆抗體(1 ∶1 000，武漢維克賽斯科技有限公司，批號(hào)07521)4 ℃孵育過夜，山羊抗兔二抗(1 ∶5 000，北京百奧萊博科技有限公司，批號(hào)0590)室溫下孵育1 h；用化學(xué)底物發(fā)光液曝光顯影，用Image J軟件讀取實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 基線資料

2組Hp陽性肥胖患兒在年齡、性別、BMI、TG和HDL-C水平方面比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。NAFLD組FBG、FINS、HOMA-IR、TC、LDL-C、ALT及AST水平均高于非NAFLD組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 非NAFLD組和NAFLD組Hp陽性患兒基線資料的比較

2.2 RTN-1C水平

NAFLD組Hp陽性患兒外周血RTN-1C水平低于非NAFLD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.984，P<0.001)。見圖1。

注：A為蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果，B為外周血RTN-1C水平定量結(jié)果；(1)與非NAFLD組比較，P<0.001。

2.3 Hp陽性肥胖患兒并發(fā)NAFLD的相關(guān)因素分析

應(yīng)用lasso回歸篩選自變量，選取λ最小值時(shí)，進(jìn)入模型的自變量有BMI、FBG、TC、LDL-C、ALT及RTN-1C；將Hp陽性肥胖患兒是否并發(fā)NAFLD作為因變量，BMI、FBG、TC、LDL-C、ALT及RTN-1C作為自變量納入多因素Logistic回歸分析。結(jié)果顯示FBG、TC、LDL-C及ALT是Hp陽性肥胖患兒并發(fā)NAFLD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，RTN-1C是Hp陽性肥胖患兒并發(fā)NAFLD的獨(dú)立保護(hù)因素(P<0.05)。見表2。

表2 Hp陽性肥胖患兒并發(fā)NAFLD的Logistic回歸分析

2.4 RTN-1C與Hp陽性肥胖患兒并發(fā)NAFLD的關(guān)系

RTN-1C診斷Hp陽性肥胖患兒并發(fā)NAFLD的ROC曲線下面積、最佳截?cái)帱c(diǎn)、敏感度和特異度分別為0.923(95%CI為0.878～0.956)、0.86、77.62%和96.83%(圖2)。用限制性立方樣條擬合Logistic回歸分析RTN-1C與Hp陽性肥胖患兒并發(fā)NAFLD的關(guān)系，當(dāng)節(jié)點(diǎn)個(gè)數(shù)為3時(shí)，AIC值最小(AIC=134.278)，分析結(jié)果顯示RTN-1C與Hp陽性肥胖患兒并發(fā)NAFLD有關(guān)(χ2=46.69，P<0.001)，且呈線性關(guān)系(非線性檢驗(yàn)χ2=2.65，P=0.103)。以RTN-1C診斷Hp陽性肥胖患兒并發(fā)NAFLD的最佳截?cái)帱c(diǎn)做為參考點(diǎn)，當(dāng)RTN-1C<0.86時(shí)，并發(fā)NAFLD風(fēng)險(xiǎn)增加；當(dāng)RTN-1C>0.86時(shí)，并發(fā)NAFLD風(fēng)險(xiǎn)降低(圖3)。

圖2 RTN-1C診斷Hp陽性肥胖患兒并發(fā)NAFLD的ROC曲線

圖3 RTN-1C與Hp陽性肥胖患兒并發(fā)NAFLD的限制性立方樣條圖

2.5 RTN-1C與NAFLD嚴(yán)重程度的關(guān)系

輕度(n=62)、中度(n=50)和重度(n=31)NAFLD患兒RTN-1C水平分別為(0.89±0.11)、(0.80±0.08)和(0.71±0.07)，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=44.745，P<0.001)。輕度NAFLD患兒RTN-1C水平分別高于中度和重度NAFLD患兒，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=7.289、13.162，P<0.01)；中度NAFLD患兒RTN-1C水平高于重度NAFLD患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=6.604，P<0.01)；NAFLD患兒RTN-1C水平與NAFLD嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.671，P<0.001)。

3 討論

長(zhǎng)期Hp感染會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗及炎癥反應(yīng)，易誘發(fā)肥胖和NAFLD[15]。此外，肥胖患者多伴有胰島素抵抗、游離脂肪酸增多、炎癥因子及脂肪細(xì)胞因子代謝紊亂等，上述因素均在NAFLD發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[16]。因此，Hp陽性肥胖患兒更易并發(fā)NAFLD。外周血單個(gè)核細(xì)胞中相關(guān)蛋白或基因與肝臟疾病密切相關(guān)，可在一定程度上反映肝臟的脂肪變性、炎癥等程度[17-18]。本研究通過比較非NAFLD組和NAFLD組Hp陽性肥胖患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中的RTN-1C水平，結(jié)果顯示NAFLD組Hp陽性肥胖患兒RTN-1C水平低于非NAFLD組，該結(jié)果提示RTN-1C或許與Hp陽性肥胖并發(fā)NAFLD有關(guān)。

既往研究表明FBG、TC、LDL-C及ALT均是NAFLD發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[19-24]。為避免混雜因素影響，本研究對(duì)血糖水平做了一定限制，未將糖尿病或空腹血糖高于5.6 mmol/L的患兒納入研究，以避免上述因素影響本研究分析結(jié)果。采用多因素Logistic回歸分析影響Hp陽性肥胖患兒并發(fā)NAFLD的相關(guān)因素，結(jié)果顯示FBG、TC、LDL-C及ALT是Hp陽性肥胖患兒并發(fā)NAFLD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與上述文獻(xiàn)結(jié)果一致。本研究結(jié)果還顯示RTN-1C是Hp陽性肥胖患兒并發(fā)NAFLD的獨(dú)立保護(hù)因素。此外，限制性立方樣條擬合多因素Logistic回歸分析結(jié)果還顯示當(dāng)RTN-1C<0.86時(shí)，并發(fā)NAFLD風(fēng)險(xiǎn)增加；當(dāng)RTN-1C>0.86時(shí)，并發(fā)NAFLD風(fēng)險(xiǎn)降低。RTN-1C在細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用，其不僅可調(diào)節(jié)自噬體積累，還可調(diào)節(jié)LC3水平，促進(jìn)自噬小體形成[25]。此外，RTN-1C還可靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路調(diào)節(jié)線粒體形態(tài)及活性，促進(jìn)線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜形成，加速線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的脂質(zhì)交換[7]。推測(cè)RTN-1C表達(dá)水平高，更能激活細(xì)胞脂噬，從而將細(xì)胞內(nèi)多余脂質(zhì)降解，維護(hù)細(xì)胞的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)，外周血單個(gè)核細(xì)胞中RTN-1C表達(dá)水平可反映脂噬程度，進(jìn)而反映肝臟內(nèi)脂肪變性程度。

本研究比較了輕、中、重度NAFLD患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中RTN-1C表達(dá)水平，結(jié)果顯示隨NAFLD病情加重，外周血單個(gè)核細(xì)胞中RTN-1C表達(dá)水平逐漸降低，且與NAFLD嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，上述結(jié)果均表明RTN-1C與NAFLD進(jìn)展有關(guān)，但關(guān)于其病理生理機(jī)制仍需開展基礎(chǔ)研究進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，RTN-1C與Hp陽性肥胖患兒并發(fā)NAFLD有關(guān)，檢測(cè)其水平有利于判斷NAFLD發(fā)病情況，RTN-1C表達(dá)水平低提示并發(fā)NAFLD風(fēng)險(xiǎn)較高，RTN-1C與NAFLD嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。本研究上存在一定不足，一是納入研究樣本量偏小，且為單中心研究；二是在樣本選取上存在一定偏倚，上述不足均可能影響分析結(jié)果，因此下一步將開展大樣本、多中心研究以彌補(bǔ)上述不足。