李瑞雪， 羅浩， 張育泉， 盧琴， 杜娟， 程義局，**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 呼吸與危重癥學(xué)科， 貴州 貴陽 550004； 2.貴陽市公共衛(wèi)生救治中心 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科， 貴州 貴陽 550004)

胸腔積液是指胸膜腔內(nèi)液體異常增多的病癥，在臨床極為常見，病因包括惡性腫瘤、結(jié)核、肺部炎癥、器官功能障礙等[1]。我國(guó)是結(jié)核病疫情國(guó)，結(jié)核病是導(dǎo)致胸腔積液的最主要原因之一[2]。結(jié)核性胸腔積液(tuberculous pleural effusion，TPE)是肺外結(jié)核最常見的癥狀和體征之一，通常表現(xiàn)為急性或亞急性發(fā)作的胸痛、咳嗽、發(fā)熱及呼吸困難等[3]。目前TPE確診的主要依據(jù)仍是在胸水的細(xì)菌培養(yǎng)及胸膜組織中找到結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)、或發(fā)現(xiàn)干酪樣肉芽腫，但其靈敏度及應(yīng)用廣度具有局限性[4]。因TPE的胸水主要為富含淋巴細(xì)胞的滲出液，所以臨床上判斷TPE的最常用方法是進(jìn)行胸水的生化學(xué)檢查[5]。目前，腺苷脫氨酶(adenosine deaminase,ADA)診斷TPE已在臨床被廣泛使用；調(diào)節(jié)活化正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌細(xì)胞因子(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted，RANTES)在結(jié)核發(fā)病機(jī)制中的作用也已成為研究熱點(diǎn)；RANTES在結(jié)核病的免疫反應(yīng)中有著重要作用；不僅能夠促進(jìn)結(jié)核結(jié)節(jié)的形成，其基因的多態(tài)性還與結(jié)核的易感性相關(guān)，有望成為診斷結(jié)核的生物學(xué)因子[6-7]；胸腔積液?jiǎn)魏思?xì)胞(pleural effusion mononuclear cells，PEMC)也可通過參與體內(nèi)的特異性免疫反應(yīng)影響TPE的發(fā)展過程。多項(xiàng)指標(biāo)的聯(lián)合檢測(cè)可提高TPE的診斷率，因此本研究擬通過對(duì)胸水中ADA、RANTES及PEMC的聯(lián)合檢測(cè)，探討其在TPE中的診斷價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標(biāo)本來源 收集2019年10月—2020年8月胸腔積液患者的胸水標(biāo)本86例，分為TPE組(結(jié)核組)45例和惡性腫瘤性胸腔積液組(惡性組)41例。結(jié)核組標(biāo)本要求符合確診標(biāo)準(zhǔn)或/和臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[8-9]，確診標(biāo)準(zhǔn)包括胸膜病理活檢發(fā)現(xiàn)干酪樣壞死或結(jié)核桿菌、胸水發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌2次、胸水發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌1次并且MTB培養(yǎng)陽性1次，臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)包括胸水經(jīng)檢驗(yàn)后提示為滲出液且胸水腺苷脫氨酶明顯升高并滿足γ-干擾素(interferon-gamma,IFN-γ)釋放試驗(yàn)陽性、結(jié)核菌素純蛋白衍生物試驗(yàn)中度陽性或強(qiáng)陽性、MTB抗體陽性3項(xiàng)之一，或抗結(jié)核治療2月后臨床結(jié)核中毒癥狀好轉(zhuǎn)、胸腔積液量明顯減少或消失；惡性組標(biāo)本納入標(biāo)準(zhǔn)符合胸水脫落細(xì)胞中找到腫瘤細(xì)胞，胸膜病理活檢查到相關(guān)惡性腫瘤的病理特征，經(jīng)皮穿刺肺活檢或支氣管鏡刷檢查到惡性細(xì)胞、確診為肺部原發(fā)惡性腫瘤或其他部位轉(zhuǎn)移至胸膜和肺部的腫瘤患者。2組患者一般情況見表1?；颊呔桓嬷敬窝芯肯嚓P(guān)內(nèi)容，并簽署知情同意書。

1.1.2主要試劑和儀器 人正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(上海朵羽)；KDC-1044型離心機(jī)(安徽中科中佳)，DW-86L338型-70 ℃冰箱(海爾)，Elx800型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰)，ZSXH-625型37 ℃恒溫水浴箱(上海智誠(chéng))，ZW-A型振蕩器(江蘇榮華)，移液器(大龍興創(chuàng))，一次性吸頭、EP管(江蘇康健)。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)本收集 按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程，對(duì)所有符合納入標(biāo)準(zhǔn)的2組患者于治療前行胸腔穿刺術(shù)，抽取新鮮胸腔積液 11 mL待檢。

1.2.2ADA、PEMC測(cè)定 將抽取的2組患者新鮮胸腔積液中6 mL送院內(nèi)生化科，由專業(yè)檢驗(yàn)科人員嚴(yán)格按照檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)送檢胸水中ADA、PEMC濃度進(jìn)行測(cè)定，最后通過醫(yī)院的病歷系統(tǒng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行收集。

1.2.3RANTES測(cè)定 從抽取的2組患者新鮮胸腔積液中取5 mL胸水，3 000 r/min離心15 min，取上清液置于-70 ℃條件下凍存；測(cè)前1 h室溫下復(fù)溶，使用ELISA法測(cè)定胸水中RANTES水平。整個(gè)操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有統(tǒng)計(jì)計(jì)算及繪圖均采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行。本研究數(shù)據(jù)經(jīng)分析后證實(shí)為非正態(tài)分布、方差不齊，采用曼-惠特尼秩和檢驗(yàn)(Mann-WhitneyU檢驗(yàn))。通過繪制受試者工作曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)，計(jì)算出曲線下面積(area under curve，AUC)，以總體符合率最大作為標(biāo)準(zhǔn)，確定臨界值，以此計(jì)算出診斷TPE的ADA、RANTES、PEMC的敏感度、特異度、陽性似然比、陰性似然比。數(shù)據(jù)兩兩聯(lián)合及三者聯(lián)合診斷均以Logistic回歸建立回歸方程，計(jì)算出各自相應(yīng)數(shù)據(jù)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本資料

結(jié)核組患者年齡明顯小于惡性組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，但性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 結(jié)核組和惡性組患者的基本資料

2.2 ADA、RANTES及PEMC水平

結(jié)核組患者胸腔積液中ADA、RANTES及PEMC水平均明顯高于惡性組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 結(jié)核組和惡性組患者胸腔積液中ADA、RANTES及PEMC水平[M(P25,P75)]

2.3 ADA、RANTES、PEMC單項(xiàng)檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)結(jié)核性胸膜炎的診斷價(jià)值

ROC曲線結(jié)果表明，以約登指數(shù)最大切點(diǎn)為臨界點(diǎn)，得出各項(xiàng)指標(biāo)的最佳臨界值、特異度、靈敏度，其中以ADA、3項(xiàng)指標(biāo)兩兩聯(lián)合、3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合時(shí)的診斷特異度較高，均在0.9以上；RANTES、RANTES+PEMC、PEMC+RANTES、ADA+RANTES+PEMC的診斷靈敏度較高，值均大于0.9。ADA+PEMC、PEMC+RANTES及3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合診斷時(shí)，診斷的靈敏度、特異度均高于0.9；除PEMC的AUC為0.671、診斷效能較低外，其余檢測(cè)指標(biāo)的AUC均在0.9以上，診斷效能好。見圖1和表3。

圖1 胸水中ADA、RANTES、PEMC單項(xiàng)及聯(lián)合檢測(cè)診斷TPE的ROC曲線

表3 胸水中RANTES、ADA、PEMC單項(xiàng)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)結(jié)核性胸膜炎的診斷價(jià)值

3 討論

在結(jié)核病高發(fā)的地區(qū)，TPE較為常見[10]。研究診斷結(jié)核性胸水相關(guān)的生化學(xué)指標(biāo)的價(jià)值主要在于其價(jià)格低、對(duì)設(shè)備和技術(shù)要求較低、并通過相對(duì)無創(chuàng)的方式，為疾病確診提供具有診斷價(jià)值的依據(jù)。相較其他有創(chuàng)確診方式而言，大部分醫(yī)院均能開展，且患者遭受的痛苦小，易于被患者所接受。根據(jù)Light標(biāo)準(zhǔn)，可將胸腔積液分為漏出液和滲出液，在造成滲出液的病因當(dāng)中，結(jié)核性、惡性腫瘤性胸腔積液均是占比較高的2種滲出液[11]。因此，本研究以惡性腫瘤性胸腔積液作為對(duì)照組，TPE作為實(shí)驗(yàn)組，檢測(cè)ADA、RANTES及PEMC 3項(xiàng)指標(biāo)并判斷它的臨床診斷價(jià)值。

ADA是一種與機(jī)體細(xì)胞免疫活性有關(guān)的核酸代謝酶，可促進(jìn)人體內(nèi)T淋巴細(xì)胞的增殖和分化，在結(jié)核性胸膜炎發(fā)生時(shí)，TB抗原刺激T淋巴細(xì)胞大量增殖和分化，引起患者胸水中ADA活性增加[12]。而在惡性胸腔積液疾病中，T淋巴細(xì)胞的增殖收到抑制，故而導(dǎo)致胸水中ADA濃度較低[13]。ADA活性在結(jié)核患者的血清、胸腔積液和腹水、腦脊液、支氣管肺泡灌洗液中均可升高，具有高敏感性、高特異性，臨床上已將其作為診斷結(jié)核性胸膜炎的重要輔助手段[3,14-17]。Gui等[18]Meta分析了ADA診斷結(jié)核性胸膜炎的價(jià)值，其診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感度和特異度分別為86%和88%，陽性似然比和陰性似然比分別為6.32和0.15，與本研究結(jié)果類似。目前，已普遍將ADA>35～40 U/L作為診斷TPE的標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)前一些研究發(fā)現(xiàn)胸腔積液中的ADA值可隨年齡增長(zhǎng)而降低，故建議在老年結(jié)核的診斷中ADA的臨界值應(yīng)降低，以減少假陰性結(jié)果的數(shù)量[19]。本研究人群年齡偏大，考慮ADA診斷臨界值的偏低可能與之有關(guān)。

RANTES是一種具有趨化作用的小分子蛋白質(zhì)，人體多數(shù)組織在炎癥感染時(shí)，可由CD8+T細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞及上皮細(xì)胞等分泌釋放，已有研究表明RANTES在TH1主導(dǎo)的結(jié)核免疫反應(yīng)中明顯增多，可定向趨化單核巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等向結(jié)核感染部位聚集，參與慢性炎癥及結(jié)核肉芽腫的形成，也可抑制結(jié)核菌細(xì)胞的生長(zhǎng)[7]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)核性組標(biāo)本中RANTES的濃度高于惡性組(P<0.001)，與胡連鋒等[20]、李明輝等[21]研究結(jié)果類似，可認(rèn)為RANTES對(duì)于區(qū)分結(jié)核性及惡性胸腔積液具有一定的臨床價(jià)值。

單核-巨噬細(xì)胞衍生于骨髓的髓系造血干細(xì)胞，包括單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及巨噬細(xì)胞[22]。人體內(nèi)單核細(xì)胞是重要的防御成員，主要在先天免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵的作用，不僅對(duì)很多病原體(如結(jié)核分枝桿菌)都具有強(qiáng)的吞噬能力，而且還參與了體內(nèi)的組織修復(fù)、維持內(nèi)環(huán)境平衡、凋亡及壞死等過程[23]。結(jié)核性胸膜炎時(shí), 結(jié)核菌細(xì)胞壁蛋白可刺激胸腔積液中的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ, IFN-γ可進(jìn)一步激活單核-巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)對(duì)MTB的殺傷力, 因此，在結(jié)核感染時(shí)，胸腔積液中可見到單核細(xì)胞顯著增多[24]。胡慶剛等[25]通過對(duì)106例胸腹水病人的研究發(fā)現(xiàn)，單核細(xì)胞百分比的AUC為0.598，以71.0%為截?cái)嘀?，診斷結(jié)核性胸腹水的靈敏度和特異度分別為86.0%和33.0%，故而認(rèn)為單核細(xì)胞對(duì)于結(jié)核性胸腹水的鑒別診斷意義較小。本研究結(jié)果表明，結(jié)核組標(biāo)本中單核細(xì)胞的占比略高于惡性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與Zhang等[26]研究結(jié)果類似，因此，認(rèn)為單獨(dú)檢測(cè)PEMC對(duì)于TPE的診斷價(jià)值較低。

多指標(biāo)的聯(lián)合診斷可提高結(jié)核性胸膜炎的診斷效能，Zhang 等[26]認(rèn)為，PEMC聯(lián)合PEADA用于診斷TPE的機(jī)制可能為：ADA的亞型ADA2存于單核細(xì)胞中，而TPE患者胸水中ADA2的占比較高,故而PEMC可聯(lián)合ADA用于結(jié)核性胸膜炎的診斷。Lei等[27]通過檢測(cè)100例結(jié)核性胸腔積液及105例非TPE中的單核細(xì)胞及ADA發(fā)現(xiàn)，當(dāng)胸腔積液中單核細(xì)胞計(jì)數(shù)聯(lián)合ADA進(jìn)行診斷時(shí)，其AUC為0.83，較單獨(dú)檢測(cè)單核細(xì)胞的AUC(0.66)高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=3.46，P<0.001)，說明聯(lián)合檢測(cè)對(duì)結(jié)核型胸膜炎的診斷具有臨床價(jià)值。RANTES在人體內(nèi)對(duì)單核細(xì)胞等具有優(yōu)先趨化活性，可以響應(yīng)MTB感染的免疫應(yīng)答，其中單核細(xì)胞的聚集則是結(jié)核肉芽腫形成的關(guān)鍵因素[28]，因此，可將RNATES、PEMC進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，探討其在TPE中的診斷價(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn)，ADA、RANTES、PEMC兩兩聯(lián)合時(shí)，其AUC均高于RANTES、PEMC單獨(dú)檢測(cè)時(shí)；就靈敏度而言，3項(xiàng)指標(biāo)兩兩聯(lián)合時(shí)均明顯高于PEMC單獨(dú)檢測(cè)數(shù)值，其中RANTES+PEMC以及三者共同聯(lián)合時(shí)靈敏度最高。可以看出，就綜合診斷價(jià)值而言，ADA、RANTES、PEMC 3者共同聯(lián)合時(shí)，其診斷效能最好，明顯優(yōu)于3項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)檢測(cè)及兩兩聯(lián)合檢測(cè)時(shí)。

綜上，ADA、RANTES對(duì)于結(jié)核性胸膜炎的診斷具有一定的臨床價(jià)值，但PEMC對(duì)于結(jié)核性胸膜炎的診斷價(jià)值不大；當(dāng)3項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，其診斷效能較單項(xiàng)檢測(cè)時(shí)升高，其中以三者同時(shí)聯(lián)合時(shí)診斷效能最高。因此，臨床上對(duì)TPE進(jìn)行診斷及鑒別診斷時(shí)，可聯(lián)合多項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行判斷，可以提高診斷的正確率。但本研究存在樣本量較少，對(duì)照組單一的不足，檢測(cè)指標(biāo)具一定的局限性，尚需今后更大的數(shù)據(jù)樣本及多種對(duì)照疾病等進(jìn)行探究及證實(shí)。