羅婷， 張藝凡， 楚蘭， 陳美秋， 夏聰， 徐凱翎， 劉磊

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是一種由乙酰膽堿受體抗體(acetylcholine receptor antibody，AChR-Ab)介導(dǎo)、細(xì)胞免疫依賴、補(bǔ)體參與的累及神經(jīng)肌肉接頭(neuromuscular junction，NMJ)突觸后膜的自身免疫性疾病，主要臨床表現(xiàn)為部分或全身骨骼肌無力和易疲勞性[1]。目前對(duì)MG尚無有效根治方法，需要長(zhǎng)期隨訪并及時(shí)調(diào)整治療方案，使患者病情達(dá)到由美國(guó)重癥肌無力基金協(xié)會(huì)(Myasthenia Gravis Foundation of America，MGFA)制定的干預(yù)后狀態(tài)(post-intervention status，PIS)分類中的最輕微表現(xiàn)狀態(tài)(minimal manifestation status，MMS)或更好[1]。但因MG發(fā)病機(jī)制不明確，尚缺少有效的觀察指標(biāo)來指導(dǎo)臨床診療方案。目前研究表明，MG主要的發(fā)病機(jī)制可能與機(jī)體的自身免疫平衡被打破，尤其是淋巴細(xì)胞亞群比例的失衡有關(guān)[2]，在部分MG患者胸腺中還存在部分異常具有抗乙酰膽堿受體抗體(acetylcholine receptor antibody，AChR-Ab)的CD4+T細(xì)胞，能促進(jìn)B淋巴細(xì)胞活化和生成AChR-Ab[3]。CD8+作為要主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ(major histocompatibility complex，MHC Ⅰ)類限制性T細(xì)胞識(shí)別輔助受體，具有抑制T細(xì)胞活性和B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的作用，可作為免疫調(diào)節(jié)的標(biāo)志物[4]。自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞具有獨(dú)立生物活性，參與細(xì)胞免疫，在腫瘤、病毒感染等疾病中其重要作用，具有免疫調(diào)節(jié)作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)NK存在潛在調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化能力，在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力(experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG)小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞能激活機(jī)體CD4+淋巴細(xì)胞來輔助活化后的B淋巴細(xì)胞分泌AChR-Ab[3]。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)對(duì)淋巴細(xì)胞與MG病情的相關(guān)性研究相對(duì)較少，因此本研究以90例MG患者作為研究對(duì)象，探討MG患者淋巴細(xì)胞亞群與病情嚴(yán)重程度和AChR-Ab陽(yáng)性率的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2015年4月—2018年12月醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的MG患者90例，要求符合《中國(guó)重癥肌無力診斷和治療中國(guó)專家共識(shí)》[6]中MG的診斷標(biāo)準(zhǔn)、新斯的明實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性、肌電圖檢查及臨床表現(xiàn)確診，為首次發(fā)病或穩(wěn)定后復(fù)發(fā)者；排除近3個(gè)月使用過激素、免疫抑制劑等，排除合并嚴(yán)重的代謝性或其他免疫性疾病，排除合并急慢性肝炎、獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immune deficiency syndrome，HIV)等感染性疾病，排除嚴(yán)重的心肝腎功能障礙及合并Good綜合征等。90例MG患者按照受累肌群分為眼肌組(40例)和全身組(50例)，眼肌組患者男21例、女19例，年齡18～65歲、平均(38.4±6.4)歲，病程3月～4年、平均 (1.4±0.5)年；全身組患者男23例、女27例，年齡18～63歲、平均(40.2±5.9)歲，病程2月～4年、平均(1.4±0.5)年。選取同期醫(yī)院體檢中心40例健康人作為對(duì)照組，男21例、女19例，年齡16～62歲、平均(42.1±6.2)歲。3組受試者性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究為回顧性研究，經(jīng)醫(yī)院道德倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(2017倫審第16號(hào))，所有受試者均口頭同意或簽署書面知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)本采集 MG患者于免疫治療前采集空腹靜脈血5～10 mL，對(duì)照組受試者于健康體檢日抽取空腹靜脈血5～10 mL，2組樣本取3～5 mL加乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝，置于-80 ℃冰箱保存用于檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群；剩余樣本于3 500 r/min離心10 min，取上清液于-80 ℃冰箱中保存用于檢測(cè)血清AchR-Ab。

1.2.2流式細(xì)胞法檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞亞群 取2組受試者全血0.5 mL分別裝100 μL于A～E流式管，分別加標(biāo)記抗體(美國(guó)Becton Dickinson)，其中A管加CD8-APC(CD8-allophycocyanin)、CD45RA-FITC(CD45-fluorescein isothiocyanate)、CD45RO-PE(CD45-P-phycoerythrin)及CD3-PerCP(CD3-peridinin chlorophyll protein)各5 μL，B管加CD4-APC、CD45RA-FITC、CD45RO-PE及CD3-PerCP各5 μL，C管加CD56-APC、CD3-PerCP及CD16-PE均5 μL，D管加CD19-FITC、CD5-APC及CD1d-PE各5 μL，E管為CD4-FITC和CD25-APC各10 μL、CD127-PE 5 μL ，每管分別設(shè)置對(duì)照，各管混勻后實(shí)驗(yàn)室室溫下避光放置20 min；A～D管及其對(duì)照管中各加溶血素2 mL，混勻、避光放置5 min，1 200 r/min離心5 min并取沉淀；沉淀中加2 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)清洗，1 200 r/min離心5 min并取沉淀，重復(fù)操作3次，在最終得到的細(xì)胞沉淀加1%甲醇固定，重懸細(xì)胞至細(xì)胞液達(dá)到500 μL，采用CyFlow Robby 6型流式細(xì)胞儀(廣州吉源生物有限公司)檢測(cè)并能保證每管中至少能獲得3×104個(gè)細(xì)胞為有效結(jié)果，T淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果采用二維點(diǎn)陣圖判斷，分別計(jì)算CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD19+及NK細(xì)胞(CD16+CD3-CD56+)所占比例。

1.2.3酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)MG患者血清AchR-Ab陽(yáng)性率 采用ELISA試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司)對(duì)MG患者血清AChR-Ab進(jìn)行檢測(cè)，取出試劑于20 ℃室溫下放置0.5 h，所有樣品和試劑在使用前需短暫離心30 s，分別以1 ∶100和1 ∶25對(duì)樣品稀釋液和洗滌液進(jìn)行稀釋；在酶標(biāo)板孔中加陰性(100 μL)、陽(yáng)性對(duì)照(100 μL)及稀釋的待測(cè)標(biāo)本(100 μL)，留3個(gè)空白對(duì)照孔并加樣本稀釋液、混勻，25 ℃恒溫箱中放置1 h，孵育結(jié)束后取出，吸去孔板中液體，采用稀釋后的洗滌劑清洗孔板，按300 μL/孔加洗滌劑浸泡清洗3 min，重復(fù)洗3次；每個(gè)孔板中加入試劑盒中底物A、B，20～25 ℃避光放置0.5 h終止；采用酶標(biāo)儀測(cè)量各孔的光密度(optical density，OD)值(波長(zhǎng)為450 nm)，應(yīng)用Gen5分析軟件分析檢測(cè)結(jié)果。參照試劑盒說明，以O(shè)D≥0.21為AChR-Ab陽(yáng)性，OD<0.21為AChR-Ab陰性，每個(gè)樣本至少檢測(cè)3次。

1.2.4MG患者評(píng)分[7-9]所有MG患者首次就診時(shí)采用重癥肌無力定量評(píng)分(quantitative myasthenia gravis score，QMGS)和重癥肌無力絕對(duì)和相對(duì)評(píng)分(absolute and relative score of myasthenia gravis，ARS-MG)對(duì)MG病情嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)價(jià)，QMG評(píng)分按照4個(gè)程度分別計(jì)0～3分，共13個(gè)項(xiàng)目、總分0～39分；ARS-MG評(píng)分按照5個(gè)程度分別計(jì)0～4分，共8個(gè)項(xiàng)目、總分0～32分；2組患者評(píng)分分值越高，受累肌群越多，肌無力癥狀越重；評(píng)分均由主治醫(yī)師進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 T淋巴細(xì)胞亞群

結(jié)果提示，全身組MG患者外周血CD4+、CD4+/CD8+及NK細(xì)胞比例分別高于對(duì)照組和眼肌組，但CD8+細(xì)胞比例分別低于對(duì)照組和眼肌組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；眼肌組MG患者外周血CD4+/CD8+及NK細(xì)胞比例高于對(duì)照組(P<0.05)，但CD4+、CD8+細(xì)胞比例與對(duì)照組比較、差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組受試者外周血淋巴細(xì)胞亞群水平

2.2 QMG評(píng)分和ARS-MG評(píng)分

全身組MG患者QMG評(píng)分和ARS-MG評(píng)分均高于眼肌組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 全身組和眼肌組MG患者QMG和ARS-MG評(píng)分

2.3 MG患者外周血淋巴細(xì)胞亞群與病情評(píng)分的相關(guān)性

結(jié)果提示，MG患者外周血CD4+、CD4+/CD8+及NK細(xì)胞比例分別與QMG、ARS-MG評(píng)分呈正相關(guān)(P<0.05)，CD8+細(xì)胞比例與QMG、ARS-MG評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 MG患者血清淋巴細(xì)胞亞群與病情評(píng)分的相關(guān)性

2.4 MG患者血清AChR-Ab水平

全身組MG患者血清AChR-Ab陽(yáng)性率高于眼肌組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 全身組和眼肌組MG患者血清AChR-Ab表達(dá)

2.5 MG患者外周血淋巴細(xì)胞亞群與血清AChR-Ab陽(yáng)性率的相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果表明，MG患者AChR-Ab陽(yáng)性率分別與外周血CD4+(r=0.721，P<0.001)、CD4+/CD8+(r=0.641，P<0.001)及NK細(xì)胞比例(r=0.655，P<0.001)呈正相關(guān)，CD8+與AChR-Ab陽(yáng)性率呈負(fù)相關(guān)(r=-0.744，P<0.001)。

3 討論

MG是一種自身免疫性的慢性疾病，病情遷延難愈、反復(fù)發(fā)作，多數(shù)患者需長(zhǎng)期服用免疫抑制類藥物來控制病情，但長(zhǎng)期服用免疫抑制藥物可引發(fā)機(jī)體免疫功能紊亂以及嚴(yán)重不良反應(yīng)的發(fā)生[10]。因此，需要長(zhǎng)期跟蹤隨訪患者，定量評(píng)估治療合理性并及時(shí)調(diào)整治療方案，從而使患者獲得更好的療效并減少?gòu)?fù)發(fā)率和不良反應(yīng)的發(fā)生。MG的發(fā)病機(jī)制取決于T細(xì)胞、B細(xì)胞以及補(bǔ)體和細(xì)胞因子，其中抗原特異性T細(xì)胞及其功能性亞群的激活是MG發(fā)病的始動(dòng)環(huán)節(jié)，是產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)[11]。CD3是T細(xì)胞表面的一種分化抗原，由γ、δ、ε、ζ4種成分或γ、δ、ε、ζ、η5種成分的跨膜蛋白組成，表達(dá)于成熟T淋巴細(xì)胞表面，是總T細(xì)胞群的特征性表面標(biāo)志[12]。CD3分子與T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)組成TCR/CD3復(fù)合物，當(dāng)TCR特異性識(shí)別并結(jié)合抗原后，CD3分子參與將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至T細(xì)胞胞內(nèi)，作為誘導(dǎo)T細(xì)胞活化的第一信號(hào)[13]；基于上述機(jī)制，抗CD3單克隆抗體被廣泛研究應(yīng)用于治療各種器官移植后急性排斥反應(yīng)以及如1型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病，并取得了一定的療效[14-16]。Kuhn等[17]研究表明，在治療1型糖尿病過程中，CD3特異性抗體可能通過誘導(dǎo)效應(yīng)T細(xì)胞凋亡，恢復(fù)效應(yīng)T細(xì)胞與調(diào)節(jié)T細(xì)胞的平衡而產(chǎn)生治療作用；但Xu等[18]研究表明，在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力(experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG)動(dòng)物模型中，連續(xù)5 d注射抗CD3單抗后并未能改善小鼠的臨床體征及臨床評(píng)分，實(shí)驗(yàn)組小鼠AChR-Ab滴度與對(duì)照組亦無明顯差異，猜測(cè)CD3特異性抗體不能使MG的致病T細(xì)胞產(chǎn)生耐受。由此可見，盡管T細(xì)胞在MG發(fā)病機(jī)制中有重要作用，但是CD3+T細(xì)胞并不能很好地反映MG的病理生理進(jìn)展?fàn)顟B(tài)，尤其是在臨床中對(duì)于部分使用了如環(huán)胞霉素A、他克莫司等針對(duì)T細(xì)胞藥物的MG患者。此時(shí)，探討CD3+T細(xì)胞亞群的改變可能對(duì)判定體內(nèi)免疫紊亂及病情嚴(yán)重程度更有意義。按照表型的不同，CD3+T細(xì)胞可進(jìn)一步分為CD3+CD4+CD8-和 CD3+CD4-CD8+T細(xì)胞，即CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞[19]。正常情況下，CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞相互拮抗而維持平衡，兩者之間互為協(xié)調(diào)和對(duì)立，變化不同步[20]。在自身免疫性疾病中，因自身免疫耐受已被打破，細(xì)胞亞群及比值發(fā)生紊亂[21]。因此，通過對(duì)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞等亞群的分析可以了解體內(nèi)免疫紊亂的情況。在MG的發(fā)病機(jī)制中，各淋巴細(xì)胞亞群的激活水平仍不清楚。本研究評(píng)估了MG患者T細(xì)胞、NK細(xì)胞亞群與病情嚴(yán)重程度(QMG、ARS-MG)與AChR-Ab陽(yáng)性率之間的關(guān)系，鑒于CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞與CD3+T細(xì)胞之間的依存及包含關(guān)系，本研究未納入CD3+進(jìn)行分析。

淋巴細(xì)胞作為機(jī)體免疫的核心細(xì)胞，通過與主要組織相容性復(fù)合體遞呈的多態(tài)抗原反應(yīng)被激活使CD4+T細(xì)胞激活分泌細(xì)胞因子，輔助T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樾?yīng)細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞生成抗體等作用發(fā)揮其細(xì)胞免疫及體液免疫作用[22]。CD8+T細(xì)胞分為T抑制細(xì)胞和細(xì)胞毒細(xì)胞，具有抑制細(xì)胞免疫及體液免疫、殺傷靶細(xì)胞的功能[23]。CD4+及CD8+相互誘導(dǎo)、相互制約形成一個(gè)復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)，一旦失調(diào)會(huì)導(dǎo)致自身機(jī)體免疫紊亂，因此在免疫應(yīng)答的調(diào)控及免疫自身穩(wěn)態(tài)等方面具有重要的臨床意義[20]。細(xì)胞免疫在MG患者起病和發(fā)病過程中起到重要作用，Homma等[24]研究發(fā)現(xiàn)，通過分離MG患者T淋巴細(xì)胞，建立了AChR反應(yīng)性細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞株表達(dá)CD3+CD4+，是Th亞群的代表細(xì)胞，說明CD4+T細(xì)胞參與了MG致病性抗體產(chǎn)生。而在Yan等[25]動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，EAMG模型中CD4-CD8-和CD4+CD8+均處于被抑制狀態(tài)。以上結(jié)果提示淋巴細(xì)胞在MG的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。本研究得出，MG患者CD4+、CD4+/CD8+均高于對(duì)照組，CD8+低于對(duì)照組，再次證明MG患者中存在免疫調(diào)節(jié)紊亂和失衡，免疫平衡紊亂可能與MG發(fā)病有關(guān)；MG患者CD4+、CD4+/CD8+、CD8+細(xì)胞具有差異，提示CD4+升高、CD8+降低可能是全身型MG患者致病的原因之一，且可能與眼肌型向全身型進(jìn)展密切相關(guān)。因此，淋巴細(xì)胞可以作為臨床上評(píng)估病情嚴(yán)重程度的客觀指標(biāo)。

NK細(xì)胞是一種異質(zhì)性多功能免疫細(xì)胞，受白細(xì)胞介素2(interleukin-2，IL-2)及干擾素等因子的調(diào)控，具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用，參與了自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展過程，現(xiàn)認(rèn)為NK細(xì)胞數(shù)量減少和功能缺陷是導(dǎo)致MG患者機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能紊亂的重要原因之一[26]。NK細(xì)胞具有獨(dú)立生物活性，是細(xì)胞免疫的代表，可對(duì)腫瘤和病毒感染細(xì)胞進(jìn)行直接殺傷作用[5]。NK細(xì)胞在白細(xì)胞介素12(interleukin-12，IL-12)培養(yǎng)條件下可分泌白細(xì)胞介素10(interleukin-10，IL-10)、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)，而淋巴細(xì)胞輔助性T(T helper cell，Th1)細(xì)胞中也主要分泌IFN-γ，因此認(rèn)為NK細(xì)胞與具有相似功能，IFN-γ可增加主要組織相容性復(fù)合體II(major histocompatibility complex，MHC II)類分子的表達(dá)，可誘導(dǎo)B細(xì)胞成熟，輔助產(chǎn)生AChR-Ab，誘導(dǎo)MG的產(chǎn)生[27]。研究發(fā)現(xiàn)在EAMG小鼠體內(nèi)，NK細(xì)胞能激活機(jī)體CD4+T細(xì)胞來輔助活化后的B淋巴細(xì)胞分泌AChR-Ab[5]；葛夢(mèng)茹[26]研究發(fā)現(xiàn)，病情加重的MG患者中CXCR5+NK細(xì)胞比例較對(duì)照組顯著增高，病情緩解的MG患者中CXCR5+NK細(xì)胞比例卻較加重組有明顯下降趨勢(shì)。本研究結(jié)果得出實(shí)驗(yàn)組NK細(xì)胞較對(duì)照組升高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。因此，NK細(xì)胞可能與MG的病情密切相關(guān)，其有可能成為衡量MG癥狀嚴(yán)重程度的一個(gè)潛在指標(biāo)，但具體的發(fā)病機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。

MG的臨床表現(xiàn)可為全身多組肌群均可受累，1958年Osserman首次提出重癥肌無力分型，在臨床上得到廣泛的應(yīng)用，但缺乏客觀判斷指標(biāo)，不利于臨床觀察與比較。因此，2000年MGFA提出新的臨床分型及QMG評(píng)分，對(duì)MG患者受累肌群肌無力嚴(yán)重程度具有客觀的評(píng)價(jià)，不同MGFA分型的MG患者治療前后采用QMG評(píng)分進(jìn)行病情評(píng)估具有較高敏感性，更能客觀、細(xì)致地反映出病人病情以及治療前后的變化與波動(dòng)，有利于進(jìn)行預(yù)后分析與療效判斷[28]。QMG評(píng)分和ARS-MG評(píng)分是臨床上常用對(duì)MG患者病情嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)估的客觀量化指標(biāo)，在近年來的研究中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，評(píng)估指標(biāo)可靠[9]。就患者淋巴細(xì)胞亞群與QMG評(píng)分和ARS-MG評(píng)分進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果表明CD4+、CD4+/CD8+、NK細(xì)胞與QMG評(píng)分和ARS-MG評(píng)分呈正相關(guān)，CD8+與QMG評(píng)分和ARS-MG評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，提示CD4+、CD4+/CD8+、NK升高，而CD8+降低，MG病情更嚴(yán)重。臨床上可通過淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)值對(duì)MG患者進(jìn)行病情評(píng)估。

在以往研究中，AChR-Ab陽(yáng)性率與MG患者病情嚴(yán)重程度無相關(guān)性，僅在臨床分型上有一定差異，袁東風(fēng)等[29]研究中全身型MG患者AChR-Ab陽(yáng)性率達(dá)85%以上，眼肌型MG患者介于60%～85%。本研究結(jié)果顯示，全身組MG患者AChR-Ab陽(yáng)性率高于眼肌組，與以往研究結(jié)果一致。另外，本研究通過Spearman相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)CD4+、CD4+/CD8+、NK細(xì)胞與AChR-Ab呈正相關(guān)，CD8+與AChR-Ab呈負(fù)相關(guān)，提示CD4+、CD4+/CD8+、NK升高，而CD8+降低，MG患者的病情相對(duì)較重，AChR-Ab更傾向于陽(yáng)性，其具體發(fā)生機(jī)制有待進(jìn)一步研究。 因此，淋巴細(xì)胞亞群水平可能作為評(píng)價(jià)MG患者病情嚴(yán)重程度和AChR-Ab陽(yáng)性率的重要參考指標(biāo)，并指導(dǎo)臨床診療方案。