張 堃， 周 媛， 黃華枝， 廖俊杰， 朱永闖， 李湘?zhèn)ィ?李 林， 黃偉忠， 房保柱， 李文均， 李金天， 廖 斌*

(1. 廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 廣東 廣州 510300；2. 中山大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 廣東 廣州 510275; 3. 華南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生態(tài)科學(xué)研究所, 廣東 廣州 510631)

砷(As)作為毒性較強(qiáng)的致癌物質(zhì)，是一種常見的天然元素，并且廣泛分布于水、土壤、植物等自然環(huán)境以及食物中。砷元素除了自然源的釋放外，眾多人為活動如含砷礦山的開采及冶煉、煤碳的燃燒以及在玻璃制造、飼料加工和染料等生產(chǎn)過程的添加劑等也加速砷元素的釋放[1-2]。然而，水環(huán)境污染被視為砷產(chǎn)生毒害作用的主要途徑之一，當(dāng)砷元素進(jìn)入水體后，大部分被富集在沉積物中[3]，并且這些砷元素長期處于固液面交換的動態(tài)變化中，隨著環(huán)境條件改變或沉積物在微生物的作用下，砷元素會重返表層，經(jīng)由食物、飲用水等途徑對人類健康構(gòu)成威脅，并引起公共健康安全事件[4-7]。2014年生態(tài)環(huán)境部和自然資源部對我國土壤污染狀況展開調(diào)查，結(jié)果顯示，我國土壤重點(diǎn)監(jiān)控的五大重金屬(Cd、Hg、As、Pt和Cr)點(diǎn)位超標(biāo)率均在1%～7%，其中砷元素(As)超標(biāo)率為 3%[8]，我國正面臨著越來越嚴(yán)重的砷污染問題。砷元素(As)主要以不同價態(tài)砷(As(Ⅴ/Ⅲ))存在于自然環(huán)境中，其主要存在形態(tài)為無機(jī)態(tài)砷化物，氧化狀態(tài)主要為砷酸鹽(As(Ⅴ))，而還原態(tài)則為亞砷酸鹽(As(Ⅲ))[9-11]。不同價態(tài)砷元素的環(huán)境遷移性及生物毒性也不盡相同。自然環(huán)境中，微生物對砷元素的價態(tài)和形態(tài)轉(zhuǎn)化具有不可忽視的作用[12]。研究表明，微生物是砷元素生物地球化學(xué)循環(huán)的主要貢獻(xiàn)者，并在砷元素的不同轉(zhuǎn)化過程(如氧化、還原、甲基化及去甲基化等)中發(fā)揮著舉足輕重的作用[13-15]。在厭氧條件下，微生物的活動可以直接或間接影響沉積物中的砷元素及其他的鐵氧化物、硫酸鹽的形態(tài)，進(jìn)而影響砷在環(huán)境中的元素地球化學(xué)行為。眾多研究表明，呼吸性砷還原菌(Dissimilatory Arsenate-Respiring Prokaryotes，DARPs)是砷元素從沉積層溶解和釋放到地表或地下水的主要驅(qū)動力[16]。在厭氧條件下，呼吸性砷還原菌利用各類有機(jī)物(乳酸鹽、甲酸鹽等)或無機(jī)物(氫氣或硫化物)作為電子供體，將低毒性砷(Ⅴ)轉(zhuǎn)化為高毒性砷(Ⅲ)[17]。這些微生物的主要類群為后壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)，如乙酸氧化脫硫單胞菌(Desulfuromonassp. WB3)、桿狀菌(Bacillussp. M17、Bacillussp. JMM-4)、Sulfurihydrogenibiumsp.HGMK-1、腐敗希瓦菌(Shewanellasp.ANA-3)、硫磺單胞菌(Sulfurospirillumdeleyianum)等[18]。因此，能夠直接還原吸附砷酸鹽或礦物質(zhì)，并顯著增強(qiáng)不溶性砷的溶解與釋放的微生物種類較為多樣。本研究對湖南石門砷礦區(qū)底泥進(jìn)行富集培養(yǎng)，利用純培養(yǎng)手段分離獲得1株能夠進(jìn)行厭氧砷還原的菌株ZY1，并發(fā)現(xiàn)其屬于梭菌屬(Clostridium)，隨后對該菌株進(jìn)行基因組測序，對基因組進(jìn)行初步分析，為后續(xù)砷還原的微生物機(jī)理研究提供菌株資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 用于富集分離的底泥樣品(采樣深度約10 cm)采自湖南省石門縣白云鄉(xiāng)雄黃礦(N25°2′57.5″，E113°39′34.1″)。表層覆蓋的用于修復(fù)的新層土壤導(dǎo)致砷的濃度較低，因天然淋濾、礦化和微生物的作用，底泥以及積水呈酸性，水樣pH值4.2。采集的底泥樣品置于無菌的50 mL離心管，低溫運(yùn)輸，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 儀器與試劑 PCR儀(T100，美國伯樂公司)；凝膠成像儀(GEL Logic200 Imaging System，美國伯樂公司)；電泳儀(Mini-Sub Cell GT Cell 170-4486，美國伯樂公司)；厭氧工作站(ELECTROTEK AW 400SG，英國依萊泰科公司)；透射電鏡(LKB 2088-020)；PCR引物(上海捷瑞公司)；DNA聚合酶(RR02AG，寶生物(Takara bio)科技公司)；OMEGA E.Z.N.A.?細(xì)菌DNA提取試劑盒(D5625，美國)；MP細(xì)菌基因組提取試劑盒(FastDNA SPIN Kit for Soil，美國)，制霉菌素等。

1.1.3 培養(yǎng)基 ① 1號培養(yǎng)基(富集培養(yǎng)基)：(NH4)2SO40.1 g， NaCl 1.0 g， MgSO4·7H2O 0.05 g， Na2SO4·2H2O 100 μL (3 mg/L)；葡萄糖1.8 g，復(fù)合維生素400 μL，微量元素溶液 100 μL，pH 3， 蒸餾水1 000 mL。② 2號培養(yǎng)基(分離培養(yǎng)基)：富集培養(yǎng)基配方中加入1.56 g Na2AsO4·7H2O。③ 3號培養(yǎng)基(梭菌增菌培養(yǎng)基)(g/L)：蛋白胨10，牛肉浸出粉10，酵母提取物3，可溶性淀粉1，葡萄糖5，氯化鈉5，醋酸鈉3，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5，瓊脂0.5。復(fù)合維生素溶液(mg/L)：對氨基苯甲酸5，生物素 5，維生素B25，鹽酸吡哆醇1, 維生素B15，煙酸5，維生素B55，硫辛酸5，維生素B120.1；微量元素溶液：FeCl2·4H2O 1.5 g，CoCl2·6H2O 190 mg，MnCl2·4H2O 100 mg，ZnCl270 mg，H3BO262 mg，Na2MoO4·2H2O 36 mg，NiCl2·6H2O 24 mg，CuCl2·2H2O 17 mg, 蒸餾水定容至1 000 mL,pH 3。在上述培養(yǎng)基中加入瓊脂糖制成相應(yīng)的固體培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 厭氧砷還原細(xì)菌的厭氧富集與分離 ①樣品厭氧富集：50 g底泥樣品置于裝有300 mL 1號液體培養(yǎng)基的500 mL厭氧瓶中，并向瓶內(nèi)鼓入混合氣(N2/CO2/H2)。為使底泥樣品與培養(yǎng)基充分混合，每日搖勻2次，培養(yǎng)40 d。厭氧培養(yǎng)的實(shí)驗條件：溫度30 ℃、濕度40%。②砷還原菌的分離：厭氧工作站中，將1 mL富集培養(yǎng)物與冷卻至40 ℃的2號固體培養(yǎng)基混勻倒入平板，凝固后倒置培養(yǎng)，待培養(yǎng)皿中長出菌落，挑取單菌落進(jìn)行三區(qū)劃線法培養(yǎng)，獲得純培養(yǎng)菌株。并接種在3號固體培養(yǎng)基上快速培養(yǎng)，同時進(jìn)行菌株鑒定。2號與3號培養(yǎng)基均加入采樣點(diǎn)酸性廢水過濾原液(濾膜孔徑0.22 μm)100 mL。

1.2.2 菌株ZY1的初步鑒定 ①菌體形態(tài)觀察：利用透射電鏡對菌株的形態(tài)進(jìn)行觀察。選取生長1 d的菌落制成懸浮液，2%磷鎢酸鈉水溶液染色0～1 min，取適量懸液置于載物銅網(wǎng)上，自然干燥后電鏡觀察。②生理生化性質(zhì)測定：a.菌株生長曲線：將1 mL種子液接入裝有200 mL 3號液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，厭氧30 ℃，濕度40%，測定菌株ZY1的生長曲線。b.最適pH：以1%(體積分?jǐn)?shù))的接種量，將菌株接種于pH值分別為2.96、4.00、5.02、5.72、6.42、7.09、7.84、8.90、9.22的1號液體培養(yǎng)基中，濕度40%，30 ℃條件下觀察其生長狀況。c.NaCl耐受：將菌株劃線接種于含有0%～4.5%鹽濃度pH 8的3號固體培養(yǎng)基上，30 ℃，濕度40%，培養(yǎng)觀察。d.菌株對不同砷元素(V/Ⅲ)耐受：將菌株分別接種于As(V)濃度為0～200 mmol/L(10 mmol/L梯度遞增)和三價砷濃度分別為0.66、1.32、1.98、2.64、3.3、3.96 mmol/L pH 8的3號液體培養(yǎng)基中，30 ℃，濕度40%條件下培養(yǎng)，觀察菌株對不同價態(tài)砷元素的耐受性。

1.2.3 菌株ZY1的分子生物學(xué)鑒定 ①核酸提取：菌株ZY1的DNA使用OMEGA E.Z.N.A.?細(xì)菌DNA提取試劑盒提取[19]，操作過程做少許調(diào)整，加溶菌酶37 ℃預(yù)熱10 min后，選擇加入少許(10 mg)玻璃珠，破碎無需太過劇烈。②16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增：通過細(xì)菌16S rRNA通用引物(27f/1492r[20])16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增，50 μL反應(yīng)體系與PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)[21]，送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行PCR產(chǎn)物測序。③基因序列比對分析：登錄EzBioCloud (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)網(wǎng)站，將上海生工生物工程有限公司測序返回的16S rRNA基因序列進(jìn)行比對分析其相似性[22]。

1.2.4 菌株ZY1全基因組分析 ①基因組 DNA 的提取及測序：將菌株 ZY1于3號固體培養(yǎng)基上 30 ℃、濕度40%培養(yǎng)24 h，收集菌體用無菌水清洗后，使用QIAGEN細(xì)菌基因提取試劑盒提取細(xì)菌總基因組DNA，并送至廣州基迪奧生物科技有限公司，利用Illumina HiSeq 4 000進(jìn)行基因組測序。②全基因組de novo拼接與結(jié)果評估：原始數(shù)據(jù)(rawdata)經(jīng)過FastQC(v0.11.8)[23]和 cutadapt(v1.18)[24]過濾，獲得Clean data，隨后利用SOAPdenovo進(jìn)行組裝[25]。對初步組裝得到的結(jié)果利用GapCloser進(jìn)行修補(bǔ)[26]，減少結(jié)果中N的數(shù)量；利用SSpace軟件對Scaffolds進(jìn)行延伸，最終獲得組裝的菌株ZY1基因組[27]；將拼接得到的基因組與其近緣基因組通過MUMmer[28]進(jìn)行全局比對，將比對結(jié)果通過MUMmerplot繪制點(diǎn)陣圖；利用BUSCO對基因組組裝質(zhì)量進(jìn)行分析[29]；采用CG View Server進(jìn)行基因組圈圖繪制。③菌株ZY1功能基因注釋與分析：利用GeneMark對基因組進(jìn)行ORF預(yù)測[30]，利用diamond(v0.7.9)進(jìn)行基因注釋[31]。主要通過COG和KEGG兩個數(shù)據(jù)庫，將菌株ZY1基因組利用COG和KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋。④菌株ZY1與砷相關(guān)的基因鑒定：根據(jù)關(guān)鍵詞“arsen”，從全部的COG、KEGG、NCBI-nr數(shù)據(jù)庫中篩選全部潛在的氨基酸序列，通過手動篩選，將序列分成4個不同的基因家族，得到砷相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫。將步驟④預(yù)測得到的菌株ZY1基因組核酸序列與砷相關(guān)基因蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行tblastx程序比對，將比對結(jié)果進(jìn)行篩選(e-value ≤1e-5，覆蓋度>40%，準(zhǔn)確度>40%)。最后通過預(yù)測得到的ORF在基因組Scaffold上的坐標(biāo)，將菌株ZY1基因組中的As相關(guān)基因定位到菌株ZY1基因組中。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株ZY1的生理生化特征

菌株ZY1在2號固體培養(yǎng)基上菌落白色或透明，圓形凸起，黏稠，產(chǎn)氣泡，革蘭染色陽性。菌株ZY1長度為5 μm左右，長桿狀，有芽胞，具側(cè)生鞭毛(圖1)。經(jīng)過培養(yǎng)優(yōu)化，菌株ZY1在不同培養(yǎng)基上的生長周期不同，其中1號培養(yǎng)基至少1周長出菌落，2號培養(yǎng)基至少25 d，3號培養(yǎng)基20 h長出明顯菌落。

圖1 菌株ZY1的透射電鏡圖Fig.1 The transmission electron microscopy (TEM) of ZY1

菌株ZY1經(jīng)過3號培養(yǎng)基培養(yǎng)，在600 nm波長下，檢測菌液OD值發(fā)現(xiàn)，菌株ZY1靜止期約為第0至10 小時，對數(shù)生長期約為第10至20小時，平臺期約為第20小時后(圖2)。

圖2 菌株ZY1的生長曲線圖Fig.2 The growth curve of ZY1

pH耐受試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pH為6.4和7.1的培養(yǎng)基在第4天時可以觀察到菌株ZY1的生長，pH值為5.0、7.8和8.9的培養(yǎng)基約兩周后菌株ZY1生長，其他約4周后生長，從而確定菌株ZY1最適pH生長范圍為6.4～7.1。菌株ZY1的NaCl耐受范圍為0%～3%，但不同鹽濃度對菌株ZY1的生長時間有所影響，隨著鹽度的增加菌株ZY1的生長周期延長。在砷元素(As(V/Ⅲ)耐受實(shí)驗中，菌株ZY1能夠耐受100 mmol/L 五價砷(As(V))，而三價砷(As(Ⅲ))的耐受濃度僅為1.98 mmol/L。

此外，菌株ZY1的16S rRNA基因序列與菌株北極梭菌(ClostridiumarbustiSL206T)的相似性為99.0%，通過MEGA軟件采用鄰接法(Neighbour-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。菌株ZY1與ClostridiumpasteurianumDSM 525T聚類在一起，且Maximum-Likelihood(ML)和Maximum Parsimony(MP)方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹也支持這一聚類關(guān)系，并形成穩(wěn)定的分支(圖3)。因此，菌株ZY1應(yīng)歸屬于梭菌屬(Clostridium)。

圖3 菌株ZY1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree showing the relationship of ZY1 with some other clostridium based on 16S rRNA genes

2.2 菌株ZY1基因組信息

為了進(jìn)一步了解分離菌株ZY1的代謝潛能和其逆境條件下的生存機(jī)制，對其進(jìn)行基因組測序并進(jìn)行相關(guān)分析。測序獲得原始數(shù)據(jù)(rawdata)1.87 Gb，質(zhì)控獲得干凈數(shù)據(jù)(clean data)1.36 Gb。經(jīng)過拼接和修補(bǔ)，獲得菌株ZY1基因組大小為4.4 M，基因組包括31個Scaffolds，最長的Scaffold為570 737 bp，N50為318 327 bp，GC含量30.6%，基因預(yù)測得到4 210個基因，平均長度861 bp，將序列中耐砷和與砷轉(zhuǎn)化的相關(guān)基因分成了4個不同的基因家族(表1)。

表1 細(xì)菌中耐砷和砷轉(zhuǎn)化的相關(guān)基因

將上述預(yù)測得到的菌株ZY1基因組核酸序列與砷代謝相關(guān)基因蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行tblastx程序比對(表2)。梭狀芽胞桿菌(Clostridiumsp.)ZY1的基因組信息中注釋到3個arsA和3個arsR，推測菌株ZY1具有五價砷的能力，通過多個arsR基因不斷調(diào)節(jié)還原，多個arsA編碼合成ATP酶的ArsA蛋白，為亞砷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)過程提供大量的能量，從而極大地增強(qiáng)了解毒作用。

表2 菌株ZY1砷代謝相關(guān)基因與相關(guān)數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果

隨后對菌株ZY1基因組與近緣巴氏芽胞梭菌(ClostridiumpasteurianumCP1、ClostridiumpasteurianumATCC 6013)的基因組進(jìn)行全局比對[28]，結(jié)果表明，大部分序列均能與參考基因組較好地匹配(圖4)，并且?guī)缀醺采w參考基因組的所有區(qū)間，菌株ZY1基因組完整、可靠。

圖4 菌株ZY1基因組與參考基因組全基因組對比分析Fig.4 The alignments between draft genomes of strain ZY1 and the reference strains 紅點(diǎn)代表正向匹配參考基因組，藍(lán)點(diǎn)代表反向匹配參考基因組ZY1 genome sequences against that of reference genome are plotted as red dots and reverse are plotted as blue ones

利用BLASTx將KEGG、NCBI-nr功能數(shù)據(jù)庫與得到的開放閱讀框(ORF)進(jìn)行序列比對實(shí)現(xiàn)功能注釋。結(jié)果表明，KEGG和NCBI-nr數(shù)據(jù)庫均呈現(xiàn)較高的功能注釋率，分別達(dá)到94.1%和92.7%。利用CGView Server做出菌株ZY1的基因組圈圖(圖5)，其中最外兩層分別表示前導(dǎo)鏈和后隨鏈中預(yù)測得到的基因，第三層表示全基因組的GC含量，第四層表示GC skew(綠色代表正值，洋紅色代表負(fù)值)。

圖5 全基因組圈圖Fig.5 Graphical map of the ZY1 chromosome

2.3 菌株ZY1全基因組功能注釋

在基因預(yù)測的基礎(chǔ)上，與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的蛋白序列進(jìn)行比對，得到相對應(yīng)的基因功能信息，從而了解基因功能和其代謝通路的詳細(xì)信息。在已預(yù)測的4 210個基因中，有3 902個基因注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫中，占預(yù)測基因數(shù)的92.7%。結(jié)果表明，菌株ZY1的代謝通路相關(guān)基因的顯著聚集從高到低依次為碳水化合物代謝(Carbohydrate metabolism)、氨基酸代謝(Amino acid metabolism)、輔酶因子和維生素代謝(Metabolism of cofactors and vitamins)、能量代謝(Energy metabolism)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)(Membrane transport)和核酸代謝(Nucleotide metabolism)，膜轉(zhuǎn)運(yùn)與輔酶因子和維生素代謝等表明對環(huán)境脅迫微生物表現(xiàn)出較強(qiáng)的適應(yīng)能力。此外，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Signal transduction)、細(xì)胞能動性(Cell motility)、脂肪代謝(Lipid metabolism)和氨基酸代謝(Metabolism of other amino acids)也占據(jù)較高的豐度(圖6)。

圖6 菌株ZY1各功能基因KEGG Categories注釋結(jié)果Fig.6 KEGG pathway categories classification of strain ZY1

根據(jù)KEGG代謝通路統(tǒng)計前20的功能分類豐度結(jié)果(圖7)，從各功能基因大類中細(xì)分可知，代謝通路中，嘌呤代謝(Purine metabolism)、嘧啶代謝(Pyrimidine metabolism )、氨基糖和核甘糖代謝(Amino sugar and nucleotide sugar metabolism)、卟啉和葉綠素代謝(Porphyrin and chlorophyll metabolism)、果糖和甘露糖代謝(Fructose and mannose metabolism)、糖酵解/糖質(zhì)新生(Glycolysis/Gluconeogenesis)(產(chǎn)生少量能量)等代謝在代謝通路中占據(jù)主要的豐度，表明菌株ZY1在環(huán)境中為了抵抗寡營養(yǎng)環(huán)境通過自身不斷迅速合成代謝和繁殖提高其生存能力，通過各類代謝獲得能量作為生存儲備。

圖7 KEGG代謝通路統(tǒng)計排名前20的各功能分類豐度Fig.7 Number of genes assigned to KEGG functional pathway for strain ZY1

2.4 菌株ZY1代謝通路預(yù)測分析

為了進(jìn)一步了解菌株ZY1的生長原因，基于基因組學(xué)信息分析，從能量代謝和脅迫響應(yīng)兩方面探究其代謝途徑、產(chǎn)物，描述其代謝過程。

2.4.1 碳代謝 通過分析碳代謝(Carbon metabolism)所有基因，發(fā)現(xiàn)菌株ZY1可能利用葡萄糖、磷酸果糖、磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸。①可以利用丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase)將丙酮酸降解為丁酮二酸，但不能再降解為檸檬酸；②利用蘋果酸脫氫酶(Malate dehydrogenase)和延胡索酸水合酶(Fumarate hydratase)將丙酮酸降解為延胡索酸；③由丙酮酸脫氫酶(Pyruvate dehydrogenase)或丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶(Pyruvate-ferredoxin oxidoreductase)催化脫羧生成乙酰輔酶A，再由乙酰輔酶A羧酶(Acetyl-CoA carboxylase)催化生成丙二酰輔酶A;④生成乙酰輔酶A后，利用乙酰輔梅A?；D(zhuǎn)移酶生成乙?；o酶A。大部分微生物能夠通過TCA循環(huán)(Tricarboxylic acid cycle)將糖類、脂肪、蛋白質(zhì)徹底降解成CO2，但是由于缺失檸檬酸合成酶(Citrate synthase),導(dǎo)致草酰乙酸(Oxaloacetate)不能被降解生成檸檬酸，使TCA循環(huán)中斷，不能徹底氧化有機(jī)底物。菌株ZY1屬于梭菌屬，該屬無固碳能力，基因通路顯示在Wood-Ljungdahl通路中，由于缺失甲酸鹽加氫酶(Formate dehydrogenase)而無法固定CO2。

2.4.3 硫代謝 菌株ZY1含有兩種潛在的硫代謝方式：①通過硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)將胞外的硫酸鹽轉(zhuǎn)移至胞內(nèi)(cys)，再通過硫酸鹽腺苷酰轉(zhuǎn)移酶(sulfate adenylyl transferase)將硫酸鹽(Sulfate)轉(zhuǎn)化為APS(腺苷酰硫酸，Adenylyl sulfate)，通過合成酶合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸酯(3′-phosphoadenosine 5′-phosphosulfate，PAPS)；②將硫酸鹽轉(zhuǎn)化為腺苷酰硫酸，再通過腺苷酰硫酸還原酶(Adenylylsulfate reductase)還原腺苷酰硫酸為亞硫酸鹽，通過sir基因合成亞硫酸鹽還原酶還原亞硫酸鹽得到硫化物，硫化物再由半胱氨酸合成酶(Cysteine synthase)(cys、MET、ATCYSC)合成L-半胱氨酸，或者硫化物由met基因編碼的胱硫醚γ-合成酶(Cystathionine gamma-synthase)生成L-高半胱氨酸(L-Homocysteine)。

2.4.4 脅迫響應(yīng) 在低pH、低磷且氧化脅迫嚴(yán)重的條件下，微生物會通過自身的抵抗機(jī)制克服不利環(huán)境，維持自身代謝。如宏基因組分析表明，為抵抗低pH脅迫，微生物可以通過吸收陽離子提高細(xì)胞內(nèi)部的滲透壓，以抵抗外部大量H+。將菌株ZY1全基因組基因預(yù)測得到的開放閱讀框(ORF)與收集得到的砷相關(guān)功能基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)了11個砷相關(guān)功能基因，其中包括成簇的ars基因家族。

2.5 菌株ZY1砷還原相關(guān)基因

根據(jù)菌株ZY1砷相關(guān)基因信息，初步判斷菌株ZY1的砷還原調(diào)控機(jī)制屬于只有ars基因簇調(diào)控的砷解毒機(jī)制，由于測序原因，arsC、2個arsA和2個arsR的具體位置無法確定，依據(jù)全基因組信息可確定其他ars基因的位置，繪制基因調(diào)控機(jī)制圖(圖8)。其中為主要參與砷還原的基因簇，arsR負(fù)責(zé)調(diào)控其他的ars基因，砷酸鹽由磷酸鹽通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，由arsC編碼的五價砷還原酶將砷酸鹽還原成亞砷酸鹽，arsB/acr3編碼三價砷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，同時arsA編碼ATP還原酶，為轉(zhuǎn)運(yùn)過程提供能量，arsD增強(qiáng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與亞砷酸鹽的結(jié)合，最終將亞砷酸鹽排出胞外，完成解毒過程。實(shí)驗表明，菌株ZY1具有較好的五價砷耐受能力。

圖8 菌株ZY1的砷還原功能基因簇Fig.8 ars-regulated mechanism of ZY1

3 討 論

砷元素作為一種普遍存在的有毒且致癌的化學(xué)元素，廣泛分布于各類環(huán)境，如地殼、土壤、海水、河水及大氣中。除地質(zhì)變化因素外，更重要的是人為因素，例如金屬礦的開采和冶煉、砷產(chǎn)品的加工與使用、煤的燃燒等，導(dǎo)致砷元素污染不斷加重。因此，砷污染已經(jīng)成為較為嚴(yán)重的重金屬污染之一，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槿蛐缘膯栴}。微生物作為自然環(huán)境中重要的一員，對各種元素及營養(yǎng)物質(zhì)具有重要的轉(zhuǎn)換作用，具有對砷元素循環(huán)的潛質(zhì)。某些特殊微生物類群具有極強(qiáng)的砷元素適應(yīng)性，甚至還以砷元素作為必要的生長能源，甚者直接將胞內(nèi)積累的砷及其化合物，通過自身的氧化還原或甲基化作用對砷元素的不同形態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。利用富集篩選出的抗耐砷微生物，通過多種途徑轉(zhuǎn)化砷及其化合物，進(jìn)而降低砷元素的環(huán)境毒性，減輕不同環(huán)境砷元素污染問題，實(shí)現(xiàn)砷元素污染的微生物修復(fù)。

本研究針對湖南石門砷礦區(qū)底泥開展砷化物轉(zhuǎn)化微生物資源的富集培養(yǎng)研究，利用純培養(yǎng)分離獲得1株能夠進(jìn)行厭氧砷還原的菌株ZY1，基于16S rRNA基因以及部分生理生化結(jié)果初步判定菌株屬于梭菌屬(Clostridium)?；蚪M分析結(jié)果表明，菌株ZY1具有較好的初級代謝能力，同時，菌株ZY1可以通過兩種途徑響應(yīng)pH、重金屬和氧化脅迫：一種是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABC transporters)、雙組分系統(tǒng)(Two-component system)、鞭毛裝配(Flagellar assembly)、細(xì)菌趨藥性(Bacterial chemotaxis)，通過感受比較不同環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)濃度改變自身的運(yùn)動方向和持續(xù)時間，可以通過適當(dāng)排除體內(nèi)有毒物質(zhì)適應(yīng)艱難的環(huán)境；第二種是通過細(xì)胞重生，嘌呤、嘧啶代謝和核糖體中的氨?；?轉(zhuǎn)移核糖核酸(Aminoacyl-tRNA biosynthesis)、同源重組(Homologous recombination)基因的大量存在，表明菌株ZY1的重生能力較強(qiáng)。梭菌屬(Clostridium)作為厭氧微生物類群，在特殊生境中進(jìn)化出適應(yīng)特殊環(huán)境的功能。

梭狀芽胞桿菌(Clostridiumsp. ZY1)的基因組信息中注釋到3個arsA和3個arsR，可增強(qiáng)其對砷的解毒作用。另外，arsM為甲基砷相關(guān)基因，雖然在培養(yǎng)菌株ZY1的溶液中并未檢測到甲基砷的存在，但說明了菌株ZY1具有將三價砷轉(zhuǎn)化為甲基砷的潛能，有研究表明一些細(xì)菌起始并無甲基化現(xiàn)象，如大腸埃希菌(E.coli)、假單胞菌(Pseudomonassp.)、黃桿菌(Flavobacteriumsp.)、變形桿菌(Proteussp.)經(jīng)高濃度的砷元素6個月誘導(dǎo)下，可以將無機(jī)砷轉(zhuǎn)為甲基態(tài)砷化物[32]。因此，推測菌株ZY1的arsM基因可能是來源于自身的基因演化。

菌株ZY1所屬的梭菌屬(Clostridium)的ars基因簇耐砷原理并未有文獻(xiàn)進(jìn)行深刻分析。2000年，Jones等[33]在研究微生物調(diào)節(jié)砷還原和砷的溶解性時，從富集培養(yǎng)物中得到1株有五價砷還原作用的梭狀芽胞桿菌(Clostridiumsp. CN-8)，隨后Langner等[34]在探究厭氧條件下微生物還原水溶性五價砷時，對水鐵礦吸附五價砷的研究中再次利用梭狀芽胞桿菌(Clostridiumsp. CN-8)進(jìn)行研究。2007年，Stolz等[35]研究畜禽養(yǎng)殖過程中使用硝羥苯胂酸增加砷污染的過程中，發(fā)現(xiàn)梭狀芽胞桿菌Clostridiumsp. OhILAs能將硝羥苯胂酸轉(zhuǎn)化為低毒的五價砷化物。2016年，Li等[36]在研究砷與硝酸鹽污染的地下水環(huán)境時，發(fā)現(xiàn)梭狀芽胞桿菌Clostridiumsp. pxl2能夠氧化二價鐵離子并降低硝酸鹽濃度，同時降低環(huán)境中的三價砷化合物的濃度。但是對于梭菌屬(Clostridium)的砷元素的轉(zhuǎn)化機(jī)理研究并不深入。本研究分離獲得的梭狀芽胞桿菌(Clostridiumsp. ZY1)表現(xiàn)出五價砷還原能力和代謝潛能。隨著現(xiàn)代測序成本的不斷降低，梭菌屬有很多菌株的基因型已經(jīng)被測出，但對于該類群的ars基因調(diào)控原理是否與其他菌屬的有所不同，需要進(jìn)一步探究。