王德成， 管仲瑩

(遼寧中醫(yī)藥大學 附屬第二醫(yī)院，遼寧 沈陽 110034)

下呼吸道感染是臨床常見的感染性疾病，具有較高的發(fā)病率和致死率。近年來，廣譜和超廣譜抗生素的廣泛使用，導致細菌的耐藥性不斷增加，加大了臨床治療難度，增加了醫(yī)療費用[1]。下呼吸道感染致病菌的菌群分布主要以革蘭陰性桿菌為主，且多年來所占比例呈上升趨勢[2]。銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)是最嚴重的院內獲得性感染的病原菌之一[3]，由于抗菌藥物被過度使用及各種有創(chuàng)診療操作的廣泛開展，該菌多重耐藥現(xiàn)狀在世界范圍內日趨嚴重[4]。研究銅綠假單胞菌的耐藥性有助于指導臨床合理使用抗菌藥物，節(jié)約醫(yī)療資源。痰培養(yǎng)是診斷下呼吸道感染最重要的手段[5]。因此，通過痰培養(yǎng)研究下呼吸道致病菌的菌群分布及銅綠假單胞菌的耐藥性，有利于分析病原菌的分布特點，從而指導臨床用藥，為醫(yī)療衛(wèi)生部門提供有力的參考，具有非常重要的意義。本研究對遼寧省各大醫(yī)院痰液標本中分離出的病原菌進行回顧性統(tǒng)計分析并對銅綠假單胞菌進行藥物敏感性分析，以期為臨床醫(yī)生合理使用抗菌藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 病原菌分離自遼寧省各大醫(yī)院2015年1月至2019年12月住院患者下呼吸道8 956例痰液標本。質控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923(StaphyloccocusaureusATCC25923)、大腸埃希菌ATCC25922(EscherichiacoilATCC25922)、銅綠假單胞菌ATCC27853(PseudomonasaeruginosaATCC27853)、糞腸球菌ATCC29212(EnterococcusfaecalisATCC29212)和肺炎克雷伯菌ATCC700603(KlebsiellapneumoniaATCC700603)。菌株分離培養(yǎng)嚴格按照衛(wèi)生部《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進行。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 血培養(yǎng)基(BA)、伊紅-美蘭培養(yǎng)基(EMB)、巧克力培養(yǎng)基(CBA)、TTC-沙氏培養(yǎng)基、苛養(yǎng)菌藥敏瓊脂培養(yǎng)基(HTM)和M-H培養(yǎng)基均由鄭州安圖生物工程有限公司提供；革蘭陰性細菌鑒定卡(VITEK 2美國bioMerieux，Inc)、革蘭陽性細菌鑒定卡(VITEK 2 美國bioMerieux，Inc)、奈瑟菌、嗜血桿菌鑒定卡(VITEK 2美國 bioMerieux，Inc)、革蘭陰性細菌藥敏卡(VITEK 2 compact美國bioMerieux，Inc)、革蘭陽性細菌藥敏卡(VITEK 2 compact 美國bioMerieux，Inc)和肺炎鏈球菌藥敏卡(VITEK 2 compact 美國bioMerieux，Inc)均由法國梅里埃公司提供。

1.1.3 主要儀器與設備 全自動微生物鑒定儀(VITEK 2 Compact，法國梅里埃)；二氧化碳培養(yǎng)箱(371，賽默飛世爾科技中國有限公司)；微生物恒溫培養(yǎng)箱(BJPX-150，山東博科生物產業(yè)有限公司)；生物安全柜(BSC-1500IIA2-X，濟南鑫貝西生物技術有限公司)；顯微鏡(CX-31，奧林巴斯)。

1.2 方法

1.2.1 標本的采集接收與處理 晨痰采集前1～2 h不可進食，采集標本前用冷開水漱口，用力咳出呼吸道深部的痰液并直接吐入無菌容器中。標本立即送入實驗室，盡快進行涂片和接種。取痰液的膿性部分直接涂片，進行革蘭染色，顯微鏡低倍視野下觀察記錄5個視野的細胞平均數(shù)，每個低倍鏡視野中，鱗狀上皮細胞<10個，白細胞>25個，為合格下呼吸道標本。將濃痰加入含有15～20 mL滅菌生理鹽水試管中，劇烈震蕩5～10 s，然后用接種環(huán)將沉淀于管底的濃痰小片沾出，再放入另一試管內，以同樣的方法反復2次，最后將剩余的濃痰接種在培養(yǎng)基上。將涂片檢查合格的痰標本處理后接種于BA、EMB、CBA和TTC-沙氏培養(yǎng)基，其中CBA置于CO2環(huán)境下，以便分離嗜血桿菌與腦膜炎奈瑟菌，TTC-沙氏培養(yǎng)基用于分離念珠菌和其他酵母菌等。

1.2.2 細菌鑒定與藥敏試驗 挑取分離純化培養(yǎng)的菌落涂片進行革蘭染色，顯微鏡觀察菌體形態(tài)和染色特征形態(tài)，再經(jīng)氧化酶、觸酶試驗、法國梅里埃VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定儀進行菌種鑒定和藥物敏感性試驗(MIC)，結果按美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)標準[6]判讀為敏感(S)、中介(I)、耐藥(R)。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 采用瑞美LIS系統(tǒng)對藥敏試驗結果進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 病原菌分布

2015年1月至2019年12月共收集痰標本8 956株，陽性標本3 878株，陽性率43.3%，其中革蘭陰性桿菌2 673株，占68.9%。銅綠假單胞菌785株，陽性率20.2%。革蘭陽性球菌和革蘭陽性桿菌分別占7.3%和4.2%。真菌所占比例為19.6%。具體情況見表1、圖1、圖2。

表1 3 878株下呼吸道感染病原菌菌株分布

圖1 2015年1月至2019年12月痰標本陽性菌分布圖Fig.1 Distribution of positive bacteria in sputum samples from January 2015 to December 2019

圖2 下呼吸道感染病原菌2 673株革蘭陰性桿菌分布圖Fig.2 Distribution of 2 673 strains of gram negative bacilli causing lower respiratory tract infection

2.2 藥敏結果

銅綠假單胞菌對氨芐西林、呋喃妥英、復方新諾明、頭孢呋辛(酯)、頭孢曲松、頭孢替坦、頭孢唑啉的耐藥性較高，每年的耐藥率均高于95%。而對于阿米卡星、環(huán)丙沙星、頭孢吡肟、頭孢他啶、左氧氟沙星則出現(xiàn)較低的耐藥性，5年的耐藥率均低于50%。銅綠假單胞菌對阿米卡星、哌拉西林、頭孢吡肟、美羅培南、亞胺培南的耐藥率有逐年下降的趨勢，而對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星的耐藥率有逐年上升的趨勢。具體耐藥情況見表2、圖3。

表2 2015年至2019年痰標本分離銅綠假單胞菌對抗菌藥物的耐藥率(%)

圖3 2015年至2019年銅綠假單胞菌對臨床常用抗菌藥物耐藥率的變化趨勢Fig.3 Change trend of resistance rate of Pseudomonas aeruginosa to commonly used clinical antibiotics from 2015 to 2019

3 討 論

下呼吸道感染是臨床常見的感染性疾病，痰培養(yǎng)對于下呼吸道感染的病原菌檢查具有重要的臨床價值，藥敏試驗為臨床合理使用抗生素提供了依據(jù)[7]。通過本研究可以看出，遼寧省下呼吸道感染患者的病原菌主要以革蘭陰性桿菌為主，占68.9%，且有上升趨勢，主要包括銅綠假單胞菌、克雷伯菌屬和不動桿菌屬，與近年來國內外統(tǒng)計資料顯示革蘭陰性桿菌引起下呼吸道感染比例上升已逐漸趨于主導地位的報道一致[6]。真菌占下呼吸道感染病原菌的19.6%，主要以白假絲酵母菌、曲霉菌、熱帶假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌常見。革蘭陽性菌主要為溶血性葡萄球菌、肺炎鏈球菌、紋帶棒桿菌和表皮葡萄球菌。

在分離出的病原菌中，銅綠假單胞菌占相當大的比例，約為20.2%。近年來，由于β-內酰胺類抗菌藥物、免疫抑制劑和腫瘤化療藥物的廣泛使用以及各種侵入性操作的增多，該菌引起的醫(yī)院感染日益突出[8]。銅綠假單胞菌具有多種天然和獲得性耐藥機制，耐藥性強，耐藥機制復雜，且具有極強的環(huán)境適應能力，分布廣泛，可導致呼吸系統(tǒng)、血液系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)感染[9]。銅綠假單胞菌的耐藥機制主要有通過主動外排機制、藥物滲透障礙(由于產生了細菌生物被膜所導致)、產生細菌生物被膜以及產生由染色體或質粒介導的β-內酰胺酶、氨基糖苷類鈍化酶及DNA旋轉酶等產生耐藥現(xiàn)象[10]。

臨床治療銅綠假單胞菌嚴重感染的標準方案是將一種抗假單胞菌的β-內酰胺類(如哌拉西林)和氟喹諾酮類(如左氧氟沙星、環(huán)丙沙星)或氨基糖苷類(如阿米卡星、妥布霉素、慶大霉素)聯(lián)合應用，聯(lián)合用藥能產生附加或協(xié)同殺菌作用，同時可減少耐藥的發(fā)生。其中阿米卡星是聯(lián)合用藥的首選藥物[11-12]。藥敏結果顯示，遼寧省的銅綠假單胞菌耐藥性較高的藥物主要有氨芐西林、呋喃妥英、復方新諾明、頭孢呋辛(酯)、頭孢曲松、頭孢替坦、頭孢唑啉。因此建議臨床減少使用這類抗生素，降低其耐藥性。而對阿米卡星、環(huán)丙沙星、頭孢吡肟、頭孢他啶、左氧氟沙星的耐藥率相對都比較低。銅綠假單胞菌對阿米卡星、哌拉西林、頭孢吡肟、美羅培南、亞胺培南的耐藥率有逐年下降的趨勢，而對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星的耐藥率有逐年上升的趨勢。阿米卡星除對銅綠假單胞菌有較好的抑制作用外，報道顯示，其他一些革蘭陰性菌(如大腸埃希菌、耐碳青霉烯類革蘭陰性菌等)對其均有較高的敏感性[13-14]。阿米卡星已被臨床用于重癥肺炎的治療[15]。頭孢吡肟、美羅培南、亞胺培南對其他革蘭陰性菌作用不盡相同，有報道顯示[16]，大腸埃希菌對美羅培南、亞胺培南均有較高的敏感性，但對頭孢吡肟卻有較高耐藥性；鮑氏不動桿菌對頭孢吡肟敏感性較高，但對美羅培南、亞胺培南的耐藥性卻較高。

呼吸道感染病原菌診斷的重要手段是痰培養(yǎng)，也是臨床醫(yī)師選用有效抗菌藥物的重要依據(jù)[17]。因此，臨床醫(yī)師對于呼吸道感染性疾病患者在治療前應給予痰培養(yǎng)，然后依據(jù)本地區(qū)病原菌特點進行經(jīng)驗性用藥，得知痰培養(yǎng)藥敏結果后再調整抗菌藥物。同時，在臨床實踐工作中，臨床醫(yī)務人員應與細菌室工作人員密切配合，保證微生物診斷的結果與質量。細菌室工作人員應定期對檢驗結果進行統(tǒng)計分析，為臨床合理選用抗菌藥物提供依據(jù)。為了避免耐藥菌株的逐年上升和產生超級細菌的現(xiàn)象，應避免抗生素的濫用，共同營造一個和諧的醫(yī)療環(huán)境。