王 川, 劉原子, 魏亞琴, 毛 婷, 楊宇澤, 俞海山， 張 釗， 萬學瑞

(1.甘肅農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070； 2.陜西梅里眾誠動物保健有限公司，陜西 西安 712034；3. 甘肅省微生物資源開發(fā)利用重點實驗室,甘肅省科學院生物研究所厭氧微生物中心，甘肅 蘭州 730000；4.北京市畜牧總站, 北京 100101)

嗜熱菌是生活在環(huán)境溫度50 ℃以上的一類微生物。騰沖嗜熱厭氧桿菌(Thermoanaerobactertengcongensis)MB4株是科學家在中國云南騰沖地區(qū)熱泉分離得到的1株嗜熱厭氧菌，其最適生長溫度為75 ℃[1]，我國自主對其全基因組進行了測序[2]。CRISPR/Cas系統是一種細菌抵抗外源噬菌體的免疫機制，長期研究發(fā)現在90%的古生菌及40%的細菌基因組中都存在這種系統[3-4]。CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系統由重復間隔序列、前導序列和cas基因組成，其最明顯的結構特征是由一段不連續(xù)的重復序列(Direct repeat, DR)和插入其中的間隔序列(Spacer sequence)構成的重復間隔序列[5-6]，相比常溫菌，這些系統和短的重復序列在嗜熱菌種中更豐富，數目更多。CRISPR/Cas系統根據Cas蛋白分為3種類型即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，這3種類型又可以分為Ⅰ-A到Ⅰ-F、Ⅱ-A和Ⅱ-B、Ⅲ-B幾種亞型[7]。Cas1、Cas2 蛋白在各類型和亞型的CRISPR/Cas系統中普遍存在且高度保守，被視為探究 CRISPR/Cas系統進化關系的支架[8]。不同的CRISPR/Cas系統中其Cas蛋白的功能各不相同，例如核糖核酸酶、解旋酶、聚合酶等[9]。最近有研究證明，CRISPR位點具有基因表達調控的功能[10]。Cas2是一種保守的核酸內切酶，并且發(fā)揮著重要的作用[11-12]，其廣泛分布于所有含有CRISPR序列的微生物基因組中[13-16]。前期進行了騰沖嗜熱厭氧桿菌在不同溫度條件下的轉錄組分析，全局性分析了該菌的嗜熱機制[17]。發(fā)現騰沖嗜熱厭氧桿菌基因組上有3個短的重復序列CRISPR，分別為 C65、C25和C216(數字表示重復數)。騰沖嗜熱厭氧桿菌CRISPR/Cas系統屬于Ⅰ-A和Ⅲ-B亞型，cas2基因屬于Ⅰ-A 亞型[18]。本研究通過生物信息學方法研究Cas2在騰沖嗜熱厭氧菌熱適應過程的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 騰沖嗜熱厭氧桿菌(Thermoanaerobactertengcongensis)由譚華榮研究員惠贈；質粒pET-28a和pBluescriptⅡKS(+)，菌株E.coliDH5α和表達菌株E.coliBL21為本實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 TTE培養(yǎng)基用于騰沖嗜熱厭氧桿菌培養(yǎng)[19]；培養(yǎng)大腸埃希菌DH5α、BL21的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，2×YT培養(yǎng)基用于重組菌的誘導。

1.1.3 主要試劑 限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ購自TaKaRa公司；T4 DNA Ligase購自Thermo fisher公司；鎳柱購自GE公司；氨芐青霉素、卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)、EasyPfu DNA polymerase購自北京全式金生物技術有限公司；質粒DNA小提試劑盒、膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；其他試劑為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 利用primer5參照GenBank中騰沖嗜熱菌MB4(AE008691.1)cas2的序列設計引物，克隆引物見表1。

1.2.2 騰沖嗜熱厭氧桿菌基因組DNA的提取 騰沖嗜熱厭氧桿菌在TTE培養(yǎng)基中75 ℃培養(yǎng)12 h，使用CTAB法提取嗜熱菌基因組DNA。

1.2.3cas2基因的擴增 以提取的基因組DNA為模板進行擴增。反應條件：95 ℃預變性6 min；95 ℃ 35 s；50.7 ℃ 45 s；72 ℃ 2 min；共35個循環(huán)。將cas2和pET-28a雙酶切，16 ℃連接，將其轉化到DH5α中，提取質粒后酶切鑒定并送至生物公司測序。

表1 試驗分析所用引物

1.2.4 重組蛋白的表達及純化 將測序正確的重組質粒轉化至大腸埃希菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，挑取單菌落過夜培養(yǎng)后按1∶100比例轉接入100 mL 2×YT(Kan+)培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)2.5 h至菌液OD值(600 nm)達到0.4～0.6，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG在26 ℃誘導表達7 h，7 000 r/min離心10 min收集菌體，PBS緩沖液洗滌2次后超聲波破碎30 min(40%功率，工作5 s，間歇5 s)，7 000 r/min離心10 min[20]。收集上清并用GE公司的Ni-NTA柱進行蛋白純化，以誘導前的重組菌株為對照進行SDS-PAGE電泳，分析重組蛋白表達情況。

1.2.5 實時熒光定量PCR 在50、60、75和80 ℃條件下培養(yǎng)騰沖嗜熱厭氧桿菌。RNA提取及RT-PCR方法參照Liu等[19]的文章。引物序列見表1，以16S RNA作為內參基因，用相對定量的方法檢測不同溫度下cas2基因的表達量變化[21]。熒光定量數據的計算方法以2-△△Ct方式計算[22]，采用SPSS軟件進行ANOVA單因素方差分析，P<0.05表示有顯著性差異。

1.2.6cas2及編碼蛋白的生物信息學分析 選取騰沖嗜熱厭氧桿菌(AAM25776.1)、沙門氏菌(AEB71782.1)、嗜酸革蘭桿菌(KJE29018.1)、單核細胞增生李斯特氏菌(KFL19553.1)、嗜鹽桿菌(AXH10449.1)cas2基因，利用在線軟件Prot-Param (http://www.expasy.org/tools) 分析該基因序列編碼蛋白Cas2氨基酸序列組成與理化性質；應用軟件ProtScale (https://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl) 分析其氨基酸殘基疏水性；應用軟件TMHMM Server v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM) 預測跨膜區(qū)；利用軟件SignalP 3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0) 預測蛋白信號肽；利用軟件PredictProtein (https://www.predictprotein.org/home)預測蛋白質二級結構；運用 STRING 數據庫(http:/ /string-db.org)，設置為高置信度0.7，不限制數量，構建與 Cas2相互作用的蛋白網絡。

2 結果與分析

2.1 cas2的克隆和表達載體的構建

通過PCR方法克隆得到了騰沖嗜熱厭氧桿菌cas2基因，測序結果表明cas2大小為264 bp。所得cas2基因序列比對同源性為100%，將cas2連接到pET-28a，轉化大腸埃希菌DH5α，構建的重組質粒pET-28a::cas2經BamHⅠ和XhoⅠ酶切驗證無誤后轉化大腸埃希菌BL21，cas2PCR結果和質粒雙酶切驗證圖譜見圖1。

圖1 cas2基因的PCR擴增產物及重組質粒雙酶切Fig.1 Electrophoresis of PCR products of cas2 gene and recombinant plasmid digested M: DNA分子質量標準DL5000；1: pET-28a載體; 2: pET-28a::cas2重組質粒雙酶切；3: cas2 pcr產物M: DL5000 DNA Marker; 1: pET-28a vector; 2: Double endonuclease digestion product ofpET-28a::cas2；3: PCR products of cas2 gene

2.2 Cas2蛋白誘導表達及SDS-PAGE電泳

pET-28a::cas2重組菌株經IPTG誘導，超聲破碎后進行純化，得到蛋白Cas2并進行SDS-PAGE電泳檢測。SDS-PAGE分析表明，誘導前無特異條帶，誘導后出現特異條帶，純化后在10 ku附近出現單一條帶(圖2)。

圖2 Cas2表達產物的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the Cas2 expressed productM: 蛋白分子質量標準；1: 誘導后的pET-28a::cas2菌液；2: 純化后的pET-28a::Cas2蛋白; 3:未誘導的pET28a::cas2菌液M: Protein molecular weight Marker； 1: pET-28a::cas2 induced with IPTG; 2: Purification recombinant expressed protein of Cas2; 3: pET-28a::cas2 not induced with IPTG

2.3 cas2在不同溫度下的轉錄分析

將50 ℃的表達量定義為1，結果顯示在60、75和80 ℃表達量是相對于50 ℃表達量的22.2、39.3和12.8倍(圖3)?？梢钥闯鲈?0到75 ℃，cas2表達量隨溫度升高而升高，cas2基因在60 ℃和75 ℃高表達，說明cas2表達量與溫度有關。

圖3 cas2在50、60、75和80 ℃下的表達分析Fig.3 The expression analysis of cas2 under50, 60, 75 and 80 ℃ 16S RNA作為內參基因，50 ℃時表達量作為116S RNA was used as internal control, and the transcription at 50 ℃ was arbitrary assigned as relative 1

2.4 cas2基因及其編碼蛋白氨基酸的生物信息學分析分子特征

cas2基因序列及編碼蛋白序列的分子特征：通過在線軟件EXPASY分析得到騰沖嗜熱厭氧桿菌cas2完整ORF全長264 bp，編碼84個氨基酸，蛋白分子質量約為9.9 ku，等電點為9.31，分子式為C473H691N115O120S1。通過生物信息學分析比較了cas2基因在騰沖嗜熱厭氧桿菌、沙門氏菌、嗜酸革蘭桿菌、單核細胞增生李斯特氏菌和嗜鹽桿菌所編碼氨基酸的基本理化性質(表2)。

表2 cas2基因及編碼蛋白的生物學特征

2.5 cas2基因編碼蛋白質的疏水性分析

結果顯示，Cas2蛋白的最大疏水性為1.733，最小為-1.233；不穩(wěn)定系數為40.16，脂肪系數為96.31，最終親水性的平均值(GRAVY)為0.280(見圖4A)，且不存在跨膜區(qū)域(見圖4B)。

圖4 騰沖嗜熱厭氧桿菌Cas2蛋白疏水性分析和跨膜結構預測Fig.4 Hydrophobicity analysis and prediction of transmembrance structures of Cas2 protein of Thermoanaerobacter tengcongensisA: Cas2蛋白的疏水性分析； B: Cas2蛋白的跨膜結構預測A: Analysis of hydrophilic/hydrophobic properties of Cas2； B: Prediction of transmembrance structures of Cas2

2.6 騰沖嗜熱厭氧桿菌Cas2蛋白二級結構分析

使用SOPMA軟件對Cas2蛋白的二級結構進行預測，發(fā)現該蛋白主要由α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)則卷曲4 種常見的蛋白質二級結構組成。其中β-折疊所占比例最高，為34.52%；其次是α-螺旋，所占比例為28.57%；β-轉角和無規(guī)則卷曲所占比例分別為13.10%和23.81%(圖5)。

圖5 騰沖嗜熱厭氧桿菌Cas2蛋白二級結構預測Fig.5 Prediction of secondary structure of Cas2 protein in Thermoanaerobacter tengcongensisA：α-螺旋；B：β-折疊；C：β-轉角；D：無規(guī)則卷曲A： represents the alpha helix; B： represents beta fold; C： represents beta turn；D： represents the Random curls

2.7 騰沖嗜熱厭氧桿菌Cas2蛋白質相互作用分析

使用 STRING 數據庫搜索與 Cas2(TTE2659) 相互作用的蛋白質信息，設置為高置信度 0.7，不限制數量，構建Cas2蛋白相互作用網絡，結果顯示Cas2 (TTE 2657)與 Cas1(TTE 2658)、Cas4 (TTE 2659)、Cas3 (TTE 2660)、Cas5 (TTE 2661)、Cas7 (TTE 2662)、Cas6 (TTE 2664)、 Cas8a (TTE 2666)和 Cas6a (TTE 2667)等存在互作關系(圖6)。

圖6 騰沖嗜熱厭氧桿菌Cas2蛋白互作蛋白網絡Fig.6 Cas2 protein interaction protein network of Thermoanaerobacter tengcongensis

2.8 cas2基因的遺傳進化分析

選取不同嗜性的菌株包括腸炎沙門菌(Salmonellaentericasubsp.entericaserovarTyphi)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)、青春雙岐桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)、嗜鹽桿菌(Arcobacterhalophilus)、嗜酸菌(Delftiaacidovorans)、嗜熱芽胞桿菌(Geobacilluskaustophilus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)和騰沖嗜熱厭氧桿菌(Thermoanaerobactertengcongensis)；嗜熱芽胞桿菌(Anoxybacillussp. B7M1)和單核細胞增生李斯特氏菌(ListeriamonocytogenesFSL F6-684)等菌株，以這些菌株的cas2基因建立系統進化樹，菌株信息結果騰沖嗜熱厭氧桿菌cas2基因與嗜熱芽胞桿菌(An-oxybacillussp. B7M1)同源性最高(圖7)。

圖7 cas2基因系統進化樹Fig.7 Phylogenetic tree of cas2

3 討 論

CRISPR系統對外源DNA的入侵具有獲得性免疫功能，這種免疫功能又被稱為干擾作用，其發(fā)揮功能分為適應、表達和干擾三個階段[23]。除了Ⅲ-C型，Ⅲ-D型和Ⅳ型CRISPR系統外，在CRISPR系統的適應階段主要是由Cas1和Cas2發(fā)揮作用[24]。Cas1是一種整合酶，Cas2是mRNA干擾素的同源物，兩者能識別入侵的外源病毒或質粒DNA的PAM序列[25]，在Cas2蛋白復合物作用下，Cas1切割識別的DNA序列并在其他酶的輔助下整合到CRISPR序列中，從而完成外源DNA的捕獲[26]。

本研究從生物信息的角度出發(fā)分析騰沖嗜熱厭氧桿菌cas2及其編碼蛋白的理化性質，結果顯示Cas2蛋白為9.9 ku左右的親水性蛋白，不存在跨膜區(qū)域，氨基酸組成以Ile(14)、Ser(14)、Phe (12)為主，且該蛋白主要由α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)則卷曲4 種常見的蛋白質二級結構組成。使用 STRING 數據庫搜索與 Cas2 相互作用的蛋白質信息結果顯示Cas2與 Cas1、Cas4、Cas3、Cas5、Cas7、Cas6、 Cas8a 和Cas6a等存在互作關系，值得注意的是上述Cas蛋白構成 CRISPR-Cas I-A 亞型系統，說明Cas2發(fā)揮作用是一個復雜的過程。本研究發(fā)現騰沖嗜熱厭氧桿菌在50～75 ℃時，cas2表達量隨溫度升高而升高，cas2基因在60 ℃和75 ℃條件下高表達，暗示cas2表達量與溫度有關。根據cas2基因建立的進化樹顯示騰沖嗜熱厭氧桿菌與厭氧菌芽胞桿菌同源性高，說明Cas2蛋白在嗜熱菌中發(fā)揮著特殊的作用。本研究結果對騰沖嗜熱厭氧桿菌CRISPR及其相關蛋白質在熱穩(wěn)定性機制中的研究提供了重要的信息，為今后嗜熱菌嗜熱機制的研究提供參考。