吳金鴻，楊丹璐，周 密，陳 旭，蔡茜茜，施 依，楊傅佳，汪少蕓,，許璟珅，張 恒

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；2.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108；3.安徽國(guó)肽生物科技有限公司，安徽 合肥 242199）

抗凍蛋白（antifreeze proteins，AFPs），又稱冰結(jié)構(gòu)蛋白或冰結(jié)合蛋白，是一類能控制冰晶生長(zhǎng)和抑制冰晶重結(jié)晶作用的蛋白質(zhì)，可在結(jié)冰或亞結(jié)冰條件下保護(hù)生物體不受傷害[1]。AFPs抗凍活性主要表現(xiàn)在其可以在不改變?nèi)芤喝埸c(diǎn)的前提下非依數(shù)性地降低溶液冰點(diǎn)[2]，并且可以通過(guò)與冰晶結(jié)合抑制冰晶的生長(zhǎng)或重結(jié)晶，減輕冰晶對(duì)細(xì)胞的機(jī)械損傷，從而保護(hù)生物體和生物大分子在低溫下生物活性與結(jié)構(gòu)完整性[3]。AFPs特殊抗凍作用使得其在冷凍食品品質(zhì)調(diào)控、細(xì)菌低溫保護(hù)、植物霜凍保護(hù)、生物礦化、醫(yī)學(xué)器官移植等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值[4]。至今人們?cè)隰~(yú)、昆蟲(chóng)、植物和細(xì)菌等生物體中已發(fā)現(xiàn)多種結(jié)構(gòu)的AFPs[4]，它們具有不同的結(jié)構(gòu)特性與抗凍活性，沒(méi)有共同的演化規(guī)律，并且其作用機(jī)制也存在顯著差異[5]。因此，本文結(jié)合近年來(lái)國(guó)內(nèi)外關(guān)于AFPs抗凍活性及作用機(jī)制的研究進(jìn)展，針對(duì)AFPs如何調(diào)控冰-水界面層結(jié)構(gòu)的理論問(wèn)題，分析和探討了幾種典型的AFPs理論作用機(jī)制模型，揭示了AFPs通過(guò)調(diào)控冰-水界面層結(jié)構(gòu)產(chǎn)生與冰晶結(jié)合或相互作用原理及其驅(qū)動(dòng)力作用特點(diǎn)，從而為深入理解AFPs抗凍活性機(jī)制提供理論參考。

1 AFPs的抗凍活性概述

AFPs具有兩種特殊的功能活性——熱滯活性和重結(jié)晶抑制活性[6]。AFPs所具有的熱滯活性主要表現(xiàn)在具有非依數(shù)性降低冰點(diǎn)的作用。一般當(dāng)溶液溫度達(dá)到水的凝固點(diǎn)0 ℃時(shí)，溶液中冰晶并不生長(zhǎng)，當(dāng)溫度繼續(xù)降低到一定程度時(shí)冰晶開(kāi)始生長(zhǎng)，溶液凍結(jié)，開(kāi)始凍結(jié)的溫度被稱為凝固點(diǎn)，也就是溶液中的冰晶生長(zhǎng)點(diǎn)溫度。當(dāng)溶液溫度升高到冰晶生長(zhǎng)點(diǎn)溫度時(shí)，冰晶并不熔化，直到溫度升高到接近0 ℃時(shí)，冰晶才開(kāi)始熔化，這一溫度是冰晶熔點(diǎn)[7]。AFPs對(duì)溶液體系冰結(jié)晶過(guò)程影響顯著，但對(duì)熔化過(guò)程沒(méi)有影響，因此含有AFPs的溶液體系凝固點(diǎn)顯著降低，與熔點(diǎn)產(chǎn)生了熱滯后現(xiàn)象，兩者之間的差值就是熱滯值[8]。AFPs熱滯活性是冰晶形態(tài)調(diào)控的一種重要作用機(jī)制[7]。如圖1所示，溫度數(shù)軸左側(cè)不含AFPs的水溶液中凝固點(diǎn)與熔點(diǎn)相同，在高于或低于此平衡溫度時(shí)冰晶會(huì)收縮或生長(zhǎng)為扁平圓盤(pán)狀；溫度數(shù)軸右側(cè)含有AFPs的溶液中，AFPs通過(guò)吸附到冰晶表面而使冰晶形成多面晶體形狀，使凝固點(diǎn)降低并且熔點(diǎn)基本不變，同時(shí)在高濃度AFPs存在下冰晶主要沿其六角對(duì)稱結(jié)構(gòu)中的c軸生長(zhǎng)[9]，顯示了AFPs修飾冰晶形態(tài)的功能。Grandum等[10]研究也揭示了在一般水溶液中冰晶通常呈扁圓狀，而在AFPs作用下冰晶形態(tài)變?yōu)榱忮F狀，隨著AFPs濃度升高逐漸轉(zhuǎn)變成針狀。因此，AFPs具有熱滯活性的主要原因是其吸附在冰晶表面造成表層彎曲，修飾和改變了冰晶形態(tài)，阻止體系中的水與已存在的冰晶結(jié)合，導(dǎo)致局部凝固點(diǎn)下降，使整個(gè)體系的凝固點(diǎn)降低，因此冰晶必須在更低的溫度下才能繼續(xù)生長(zhǎng)[11]。

圖1 抗凍蛋白熱滯活性示意圖[7]Fig.1 Schematic diagram of thermal hysteresis activity of AFPs[7]

重結(jié)晶抑制活性是AFPs另一個(gè)重要抗凍特性。重結(jié)晶是指在奧氏熟化作用下冰晶在已經(jīng)形成的晶體顆粒之間進(jìn)行生長(zhǎng)重分配，小冰晶相互結(jié)合，較大冰晶繼續(xù)長(zhǎng)大，最終導(dǎo)致冰晶顆粒增大，連為一體[12]。重結(jié)晶一般在溫度波動(dòng)時(shí)相互接觸的冰晶之間發(fā)生聚集，同時(shí)伴隨冰晶顆粒在界面向不同方向位移，晶體顆粒之間的生長(zhǎng)被重新分布。通過(guò)氫鍵、疏水相互作用和范德華力等分子之間作用力，AFPs吸附在液體冰晶表面，阻礙了冰晶在固-液界面位移及與水分子的結(jié)合[13]。AFPs通過(guò)對(duì)冰-水界面體系的作用，顯著減緩小冰晶相互結(jié)合速率，使溶液體系形成的冰晶體積細(xì)小且均勻，從而減緩或阻止了冰水體系中重結(jié)晶過(guò)程[14]。大冰晶的形成一般對(duì)生物體細(xì)胞組織造成機(jī)械損傷，破壞細(xì)胞膜或細(xì)胞組織，對(duì)生物體產(chǎn)生致命的破壞。因此生物體內(nèi)AFPs重結(jié)晶抑制活性相比于熱滯活性更為重要。

2 AFPs調(diào)控冰-水界面層結(jié)構(gòu)作用的理論模型

不同來(lái)源AFPs在結(jié)構(gòu)或抗凍活性方面雖然存在著明顯差異，抗凍機(jī)理也不完全相同[15]，但研究發(fā)現(xiàn)其作用機(jī)制具有共同相似之處，即AFPs都能通過(guò)一定作用方式結(jié)合在冰-水體系交界面，與不同的冰晶面或水相界面互作，調(diào)控冰晶的形狀與大小，抑制冰晶生長(zhǎng)從而發(fā)揮其抗凍活性[16]。雖然在實(shí)驗(yàn)體系很難得到一個(gè)清楚的AFPs與冰晶在冰-水界面層的作用結(jié)果圖，但隨著計(jì)算機(jī)化學(xué)中分子模擬技術(shù)、物理分析方法體系及新型生物光譜分析手段的應(yīng)用，關(guān)于AFPs調(diào)控冰-水界面層結(jié)構(gòu)的理論機(jī)制模型被不斷完善與更新。結(jié)合國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究報(bào)道，發(fā)現(xiàn)至今為止共有吸附-抑制模型、偶極子-偶極子模型、晶格匹配與占有模型、剛體能量模型、包合物錨定模型、親和相互作用偶聯(lián)團(tuán)聚模型等理論模型被提出并廣泛應(yīng)用于對(duì)AFPs抗凍活性作用機(jī)制的理論解釋。

2.1 吸附-抑制模型

吸附-抑制模型是最早也是目前被認(rèn)可用于解釋AFPs熱滯活性機(jī)制的一種理論模型。在低溫條件下，AFPs具有選擇吸附性，與冰晶混合后吸附在冰晶生長(zhǎng)的表面，冰晶在AFPs分子之間與水結(jié)合，在溶液中被AFPs分子覆蓋的冰晶表面停止生長(zhǎng)[17]，而未被覆蓋的區(qū)域則沿著平面繼續(xù)向前推進(jìn)形成一個(gè)圓形的表面，使其表面曲率增加[18]。

該模型最早是依據(jù)Raymond等[19]對(duì)4 種AFPs與冰晶相互作用的研究結(jié)果得出。該研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)將含有少量氯化鈉的AFPs溶液在－2 ℃下冷凍時(shí)，AFPs不會(huì)在液相中濃縮，而是優(yōu)先與冰相互作用，有很大一部分AFPs殘留在冰中；同時(shí)觀察冰晶形態(tài)發(fā)現(xiàn)，4 種AFPs質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，其中3 種AFPs都使冰晶形態(tài)變?yōu)獒槧罱Y(jié)構(gòu)。水溶液中形成的冰晶通常在垂直于c軸的方向上生長(zhǎng)最快，而含有AFPs的溶液可以抑制冰晶在該方向生長(zhǎng)，說(shuō)明AFPs在平行于c軸的晶面優(yōu)先進(jìn)行吸附。此外，該研究還通過(guò)溶液中AFPs分子的濃度得到吸附結(jié)合到冰晶表面AFPs分子的分布情況，并計(jì)算由冰晶表面結(jié)合的AFPs分子引起的冰晶表面曲率變化，最后由Kelvin效應(yīng)推演得到由于AFPs表面效應(yīng)而降低的溶液平衡凍結(jié)溫度（熱滯活性，ΔT/℃）（公式（1））。

式中：α是分配系數(shù)；ρ是AFPs的質(zhì)量濃度/（mg/cm3）；MW是AFPs的相對(duì)分子質(zhì)量。針對(duì)所研究的4 種AFPs，根據(jù)公式（1）繪制熱滯活性與AFPs質(zhì)量濃度的關(guān)系曲線，曲線的形狀和計(jì)算得到的熱滯活性均與實(shí)際通過(guò)凍結(jié)曲線測(cè)量得到熱滯活性非常接近。

基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Raymond等[19]認(rèn)為AFPs通過(guò)自身吸附到冰晶表面并通過(guò)Kelvin效應(yīng)抑制冰晶生長(zhǎng)。Kelvin效應(yīng)是指一般情況下冰晶生長(zhǎng)垂直于晶體表面，假如雜質(zhì)分子吸附于冰晶生長(zhǎng)的表面，那么需要附加驅(qū)動(dòng)力（凝固點(diǎn)溫度下降），促使冰晶在雜質(zhì)間生長(zhǎng)[20]。由于表面曲率增大，因表面張力的影響，增加表面積將使體系的平衡狀態(tài)發(fā)生改變，從而使凝固點(diǎn)下降。因此，Raymond等提出的模型為解釋AFPs的熱滯活性提供了一個(gè)重要的理論機(jī)制模型。

此后，有大量研究圍繞吸附-抑制模型，針對(duì)AFPs與冰晶吸附-抑制作用的模型進(jìn)行拓展和完善。de Vries等[21]提出了沿著冰晶生長(zhǎng)主要方向的基面a軸方向上AFPs與冰晶作用的吸附-抑制模型，并提出了吸附-抑制模型非凝集性降低水凝固點(diǎn)的作用機(jī)制（圖2）：吸附在基面上的AFPs分子會(huì)干擾臺(tái)階在基面上的擴(kuò)散，導(dǎo)致臺(tái)階高度彎曲。由于AFPs分子直徑大約是臺(tái)階高度的兩倍，因此AFPs分子在基面臺(tái)階上的吸附阻止了AFPs覆蓋的臺(tái)階區(qū)域的生長(zhǎng)，因此冰晶無(wú)法在其上傳播，僅在吸附的分子之間可能進(jìn)一步生長(zhǎng)，因此呈現(xiàn)彎曲的前沿。這些高度不規(guī)則的前沿導(dǎo)致冰晶表面積與體積的大幅增加，從而導(dǎo)致其凝固點(diǎn)下降，并且下降幅度取決于表面積相對(duì)于體積的變化率。

圖2 吸附-抑制模型降低水凝固點(diǎn)的作用機(jī)制[21]Fig.2 Mechanism of adsorption-inhibition model for lowering freezing point of water[21]

S?nnichsen等[22]進(jìn)一步揭示了在吸附-抑制作用模型中AFPs與冰吸附結(jié)合過(guò)程其分子結(jié)構(gòu)域表面結(jié)構(gòu)特征，其用多維核磁共振確定了III型AFPs分子結(jié)構(gòu)（AFP III），發(fā)現(xiàn)AFP III具有兩個(gè)非常平坦的正交表面，可以同時(shí)與兩個(gè)正交的冰表面結(jié)合，同時(shí)位于AFP III分子C-端的冰結(jié)合位點(diǎn)是平面且非極性的，具有低溶劑可及性和特定的冰結(jié)合殘基（Gln9、Asn14、Thr15、Thr18和Gln44）極性側(cè)鏈原子的特定空間排列特點(diǎn)。側(cè)鏈的取向和可及性僅允許每個(gè)極性基團(tuán)形成一個(gè)氫鍵（Gln9除外），這限制了氫鍵長(zhǎng)度和角度。由于AFP III分子具有較大疏水核心，且非極性成分占比達(dá)到73%，這說(shuō)明AFPs分子中非極性基團(tuán)可能比極性殘基更易接近冰結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致冰結(jié)合位點(diǎn)產(chǎn)生疏水性。該研究指出在吸附-抑制作用模型中，AFPs分子除了氫鍵作用外，也可以通過(guò)分子間疏水作用吸附結(jié)合到冰晶表面。

Kristiansen等[23]根據(jù)吸附-抑制模型，改進(jìn)了定量計(jì)算熱滯活性的理論模型。該模型假設(shè)結(jié)合到冰晶表面的AFPs分子覆蓋度反比于其溶解度，并由此計(jì)算結(jié)合在冰晶表面的AFPs分子之間的空間尺度，最終理論推導(dǎo)得到公式（2）。

式中：ΔT是熱滯活性/℃；σ是界面張力（32 ergs/cm2）；Tm是熔點(diǎn)/K；θ是吸附的AFPs之間的冰-水臨界凸面與平面夾角/（°）；K是與AFPs種類相關(guān)的常數(shù)；[AFP]是溶液中AFPs濃度/（mmol/L）；ΔH是水的溶解熱（3.3×109ergs/cm3）。

公式（2）理論模型重新估算了冰晶表面曲率的變化，并由此得到了I型和III型魚(yú)類AFPs（AFP I、AFP III）的熱滯活性。該理論推導(dǎo)結(jié)果與通過(guò)凍結(jié)曲線或差示掃描量熱實(shí)驗(yàn)測(cè)定得到的AFPs熱滯活性基本吻合，從而證實(shí)了吸附-抑制作用理論模型的合理性。

吸附-抑制模型是目前最被接受的AFPs作用機(jī)制模型[24]。綜上分析，該模型主要機(jī)理為AFPs通過(guò)氫鍵或疏水作用吸附到冰晶表面，通過(guò)Kelvin效應(yīng)增加表面張力、改變冰晶表面曲率來(lái)抑制冰晶的生長(zhǎng)速率和降低凝固點(diǎn)，從而使AFPs具有熱滯活性。但這種模型只能解釋冰晶生長(zhǎng)速度的降低而不能解釋冰晶的生長(zhǎng)停止，同時(shí)AFPs與冰晶兩者之間的具體相互作用方式難以用簡(jiǎn)單的吸附-抑制模型來(lái)解釋。因此，以吸附-抑制模型為基礎(chǔ)，研究者們又提出了偶極子-偶極子模型、晶體占位-晶格匹配模型、剛體能量模型、氫原子結(jié)合模型等，進(jìn)一步解釋AFPs與冰晶的結(jié)合方式以及其抗凍機(jī)制。

2.2 偶極子-偶極子模型

偶極子-偶極子模型是主要從冰的晶體結(jié)構(gòu)出發(fā)，著眼于AFPs如何阻止冰晶a軸向生長(zhǎng)而提出的一種作用機(jī)制模型。該模型認(rèn)為AFPs可以基于AFPs分子中的α-螺旋極性與水分子極性的相互作用來(lái)阻止冰晶在基面（垂直于c軸）方向（a軸）上的生長(zhǎng)。蛋白質(zhì)中多肽鏈形成α-螺旋對(duì)親水、疏水氨基酸殘基的排列順序有一定要求。通常情況下α-螺旋因這種排列而同時(shí)具有親水性和疏水性，并可簡(jiǎn)化為一個(gè)偶極子。對(duì)于最常見(jiàn)的冰的晶系——六方晶系（圖2）而言，其某個(gè)生長(zhǎng)方向的外層水分子也可以看作是一個(gè)偶極子[25]。因此，在偶極子-偶極子相互作用力下AFPs將被吸引到冰晶的生長(zhǎng)a軸上，其α-螺旋上的親水氨基酸殘基，尤其是Thr會(huì)與冰晶的水分子形成氫鍵，從而阻礙冰晶進(jìn)一步生長(zhǎng)[26]。

偶極子-偶極子模型最早由Yang等[27]基于對(duì)一種冬季比目魚(yú)體內(nèi)的一類甲胎蛋白（I型AFPs，RCSB ID：1J5B）的抗凍作用機(jī)制研究結(jié)果所證實(shí)，其研究指出，冬季比目魚(yú)來(lái)源的這種AFPs富含Ala，且它們二級(jí)結(jié)構(gòu)上僅有一個(gè)α-螺旋（圖3），在α-螺旋與水分子的偶極相互作用驅(qū)動(dòng)下AFPs貼近冰晶與游離水的界面層，與冰晶、游離水同時(shí)形成氫鍵后通過(guò)Kelvin效應(yīng)抑制了冰晶的進(jìn)一步生長(zhǎng)。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)[26]，若將冬季比目魚(yú)AFPs中幾個(gè)Thr突變?yōu)镾er，則其作用活性將顯著降低，但此種突變并不會(huì)顯著改變蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)及偶極性。該模型將冬季比目魚(yú)AFPs與冰的結(jié)合穩(wěn)定性解釋為二者之間氫鍵的形成，即AFP與冰之間若能形成更多氫鍵則二者的結(jié)合就更牢固。Graham等[28]最近以一種跳蟲(chóng)體內(nèi)的AFPs為研究對(duì)象，分析了其中幾種同源AFPs結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明這幾種AFPs均以α-螺旋上特定氨基酸殘基（Ala、Val、Pro等）與冰面形成氫鍵。分析結(jié)果在一定程度上證實(shí)了偶極子-偶極子模型理論，并顯示α-螺旋結(jié)構(gòu)對(duì)AFPs抗凍活性具有關(guān)鍵作用。

圖3 冬季比目魚(yú)I類AFPs結(jié)構(gòu)[27]Fig.3 Structure of AFP I in winter flounder[27]

偶極子-偶極子理論模型對(duì)在I型AFPs干擾下冰晶外形角度參數(shù)發(fā)生變化這一現(xiàn)象作出了合理的解釋，即軸向抑制結(jié)晶與另兩個(gè)軸冰晶的生長(zhǎng)相對(duì)獨(dú)立。但該模型也存在一些問(wèn)題，比如對(duì)于以β-片層為主要二級(jí)結(jié)構(gòu)的AFPs，該模型就不能很好地解釋將蛋白推向冰-水界面層的驅(qū)動(dòng)力。該模型主要考慮整個(gè)AFPs分子與冰晶層的整體相互作用而忽略了不同的氨基酸殘基與冰晶具體作用方式。例如將該AFPs活性區(qū)域的Thr突變?yōu)镾er后活性下降，如果僅從偶極子作用角度出發(fā)并不能解釋為什么同為親水殘基，Thr有更強(qiáng)活性。

2.3 晶體占位-晶格匹配模型

晶體占位模型認(rèn)為AFPs部分親水殘基與冰晶表層形成氫鍵，而這些氫鍵占據(jù)了晶體表面后晶胞（晶體中最小單元）中氧原子的位置，因而在AFPs吸附的生長(zhǎng)a軸向上冰晶體生長(zhǎng)受阻。在作用過(guò)程中，AFPs會(huì)使冰晶體各個(gè)棱向生長(zhǎng)速度不同而致使晶體截面發(fā)生變化，趨向于變?yōu)榱呅危▓D4）。

圖4 AFPs對(duì)冰晶生長(zhǎng)作用示意圖[29]Fig.4 Schematic diagram of the effect of AFPs on ice crystal growth[29]

Knight等[29]基于對(duì)大西洋魚(yú)（Dissostichus mawsoni）血液中兩種抗凍糖蛋白（antifreeze glycopeptide，AFGP）的研究結(jié)果證實(shí)了晶體占位模型。這兩種蛋白分子結(jié)構(gòu)中有4～5 個(gè)重復(fù)單元且均富含Ala，同時(shí)在每個(gè)重復(fù)單元（Ala-Ala-Thr）中蘇氨酸殘基上以糖苷鍵與一個(gè)二糖結(jié)合。重復(fù)單元與冰結(jié)合位點(diǎn)呈平行軸向排列，每?jī)蓚€(gè)結(jié)合位點(diǎn)距離為9.31 ?，而冰晶生長(zhǎng)軸上重復(fù)距離則為4.519 ?，近似為蛋白結(jié)合位點(diǎn)距離的一半（圖5）。圖5結(jié)構(gòu)模型中上方的AFGP與冰晶層在一個(gè)平面上的若干水分子以氫鍵結(jié)合，此結(jié)合恰好代替了冰晶層中最外面一層晶胞，形成牢固而不可逆的結(jié)合。此外，該模型研究還提出Raymond的過(guò)冷水模型[30]中的雙錐面并不是嚴(yán)格意義上具有合理參數(shù)的晶體學(xué)平面結(jié)構(gòu)，而是AFPs吸附聚集形成的平面，這也解釋了共聚冰晶在融化時(shí)表面蝕面形成，即在共聚冰晶融化過(guò)程中由于水分子與AFPs脫離共聚晶體的速度不同，表面有蝕面形成的現(xiàn)象。

圖5 抗凍糖蛋白與冰晶結(jié)合結(jié)構(gòu)模型示意圖[29]Fig.5 Schematic diagram of antifreeze glycoprotein and ice crystal binding structure model[29]

Marks等[31]研究指出AFPs疏水性殘基在其與冰面結(jié)合時(shí)起到重要作用。該研究基于分子動(dòng)力學(xué)模擬研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)一種細(xì)菌AFPs（MpAFP）在與冰晶作用時(shí)整體結(jié)構(gòu)中水分子具有高度有序的結(jié)構(gòu)，在蛋白的疏水基團(tuán)周圍形成網(wǎng)格狀的外殼，并且與其親水基團(tuán)形成氫鍵。這一結(jié)果支持晶體占位模型，并且指出了疏水性殘基除了疏水外對(duì)整體結(jié)合也有一定貢獻(xiàn)。

晶體占位理論模型作為偶極子-偶極子模型的補(bǔ)充和延伸，從分子層面很好地解釋了AFPs為何能牢固地結(jié)合到冰晶體上，也補(bǔ)充解釋了AFPs干擾下冰晶體生長(zhǎng)為雙錐的原因。這種模型不僅適用于I型魚(yú)AFPs，也適用于很多其他的AFPs，尤其是具有重復(fù)性α-螺旋和β-片層結(jié)構(gòu)的AFPs。但這種模型對(duì)于那些三級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù)雜和有多種二級(jí)結(jié)構(gòu)包括螺旋、環(huán)、自由尾的AFPs抗凍機(jī)理并不能很好地進(jìn)行解釋，因?yàn)榄h(huán)等二級(jí)結(jié)構(gòu)在起抗凍作用時(shí)有更復(fù)雜的行為。此外，此模型尚不能完美解釋AFPs移動(dòng)到冰-水界面層的驅(qū)動(dòng)力。

晶格匹配模型是晶體占位模型先導(dǎo)，其理論機(jī)制基本一致，并由de Vries等[21]于1984年提出。Knight等[32]在2009年作出了補(bǔ)充說(shuō)明，他將AFPs限制冰晶整體生長(zhǎng)的作用歸結(jié)為“臺(tái)階固定”（圖4A）和“表面固定”（即蛋白盡可能鋪滿冰晶表面），并認(rèn)為冰晶在生長(zhǎng)中會(huì)形成新的表面，而冰晶伴隨著新表面的形成會(huì)不可逆吸附更多AFPs，直到冰晶體被完全不能生長(zhǎng)的表面包圍。這解釋了AFPs不可逆吸附于冰晶的過(guò)程中為何效果會(huì)隨時(shí)間和濃度發(fā)生改變，因?yàn)閮煞N固定模式可以認(rèn)為是分步進(jìn)行，即AFPs一般先選擇性吸附到特定冰晶結(jié)合面形成臺(tái)階固定，然后隨著AFPs吸附濃度的增加，又進(jìn)一步形成了表面固定，最終使冰晶生長(zhǎng)完全停止。

Berger等[33]研究了幾種AFPs活躍亞型對(duì)不活躍亞型的協(xié)同作用，其研究結(jié)果顯示，不同的AFPs在與冰晶結(jié)合的過(guò)程中會(huì)選擇性地優(yōu)先與冰晶的棱面或錐面結(jié)合。這一結(jié)果一定程度上支持Knight等[32]的“臺(tái)階固定”的觀點(diǎn)，即單類AFPs在起作用時(shí)，其對(duì)冰晶結(jié)合面的選擇性將導(dǎo)致臺(tái)階的形成。

2.4 剛體能量模型

剛體能量模型提出在冰水體系中AFPs在冰-水界面層具有較低的勢(shì)能，即認(rèn)為熵能是AFPs運(yùn)動(dòng)至冰層表面的驅(qū)動(dòng)力；而AFPs到達(dá)冰-水界面層后的作用機(jī)制則由晶格匹配等理論解釋，即到達(dá)冰-水界面層后與冰中的水分子發(fā)生不可逆結(jié)合而錨定在晶體表面。

這種模型是Knight[34]引用Asthana等[35]的觀點(diǎn)而提出，此研究討論了小顆粒在有固體表面的液體中是否能被固體表面黏附。該模型指出，AFPs在整個(gè)體系中可以看作小顆粒，因此可將AFPs在體系中的熱力學(xué)行為描述為顆粒與晶體生長(zhǎng)的相互作用。這種作用具體表現(xiàn)依據(jù)黏附自由能的正負(fù)性來(lái)判斷，當(dāng)黏附自由能Δσ（公式（3））數(shù)值為負(fù)時(shí)，AFPs顆粒就會(huì)自發(fā)被冰晶體所“吞噬”。圖6即表現(xiàn)了這種過(guò)程，當(dāng)顆粒黏附自由能為負(fù)值時(shí)，顆粒就會(huì)有被晶體界面黏附進(jìn)而“吞噬”的熱力學(xué)趨勢(shì)[35]。

圖6 剛體能量模型示意圖[35]Fig.6 Schematic diagram of rigid body energy model[35]

式中：σsp、σpl、σsl分別表示晶體與顆粒界面、顆粒與液體界面、晶體與液體界面的界面能/（J/m2）。

剛體能量模型較好地解釋了使AFPs運(yùn)動(dòng)至冰-水界面層的驅(qū)動(dòng)力，但是并不能解釋AFPs的全部作用機(jī)理。Knight[34]曾指出即使AFPs與冰晶和與水的作用力相當(dāng)，界面能降低的趨勢(shì)也會(huì)使AFPs聚集在冰晶表面。換言之，只要是Δσ＜0的小顆粒都會(huì)有這種性質(zhì)。Knight這種理論觀點(diǎn)可作為吸附-抑制理論的一個(gè)補(bǔ)充說(shuō)明，但也說(shuō)明需要額外的模型來(lái)解釋為何冰晶在“吞噬”AFPs后無(wú)法繼續(xù)生長(zhǎng)。

Knight等[32]在晶格匹配模型中對(duì)抗凍作用與AFPs濃度關(guān)系問(wèn)題的解釋可認(rèn)為是對(duì)晶體占位模型和此模型的后續(xù)補(bǔ)充。后續(xù)有更多研究不斷通過(guò)應(yīng)用分子動(dòng)力學(xué)模擬手段來(lái)模擬這個(gè)過(guò)程中體系的變化來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。例如，Liu Kai等[36]在2016年使用分子動(dòng)力學(xué)方法模擬了AFPs在即將結(jié)冰的水層中的行為，如圖7所示，模擬之前體系分為冰層和水層兩層，AFP在水層上部，模擬之后AFP在體系中的位置下移，周圍及后方水分子呈無(wú)序狀態(tài)，表明AFP移動(dòng)到與冰-水界面層后起到了抗凍作用，在宏觀上證實(shí)了AFPs有向界面層移動(dòng)的趨勢(shì)。對(duì)于接觸界面層后，更深入的分析則與其他幾種模型，如晶體占位模型等契合。

圖7 AFPs對(duì)冰層的影響[36]Fig.7 Effect of AFPs on ice layer[36]

2.5 包合物錨定模型

近年來(lái)，在AFPs與冰-水界面層相互作用研究中，不少研究者提出了包合物錨定模型。該模型主要對(duì)冰晶結(jié)合域水合作用特征進(jìn)行分析[37-38]。包合物錨定模型認(rèn)為，AFPs通過(guò)疏水作用使水分子按晶格方式排列，并通過(guò)氫鍵錨定水分子晶格[39-40]。錨定的水分子晶格又通過(guò)匹配特定的冰晶表面使AFPs 與冰晶結(jié)合[41]。

Garnham等[42]在研究來(lái)源于南極細(xì)菌（Marinomonas primoryensis，MP）的一種Ca2+-依賴性AFPs抗凍作用機(jī)制時(shí)提出并證實(shí)了包合物錨定模型。該研究指出，這種AFPs中與抗凍活性相關(guān)分子結(jié)構(gòu)區(qū)域具有一個(gè)由Ca2+結(jié)合序列中的Thr-Gly-Asx基元形成的長(zhǎng)而平坦的冰結(jié)合區(qū)（ice-binding site，IBS），且沿Ca2+結(jié)合側(cè)的長(zhǎng)度延伸。該IBS具有疏水性，通過(guò)疏水效應(yīng)將水分子排列成一個(gè)冰狀晶格，并使晶格通過(guò)氫鍵錨定在AFPs上（圖8）。這些錨定的水分子允許AFPs通過(guò)匹配一個(gè)或多個(gè)特定的冰平面來(lái)固定冰。研究發(fā)現(xiàn)高度活躍（即具有較高熱滯活性或重結(jié)晶抑制活性）的AFPs能夠使水分子吸附到多個(gè)冰平面，其中一個(gè)冰平面是基面；而適度活躍的AFPs能夠使水分子吸附到多個(gè)冰平面，但不能被吸附到基面。因此，從實(shí)驗(yàn)和分子水平上揭示了疏水作用和氫鍵在AFPs結(jié)合冰晶過(guò)程中共同的重要作用，由此提出并說(shuō)明了包合物錨定模型。

圖8 MP-AFP的冰結(jié)合區(qū)及其包合物錨定模型結(jié)構(gòu)[42]Fig.8 Marinomonas primoryensis (MP)-AFP ice-binding site and its inclusion anchoring model structure[42]

此后，先后有不少研究者進(jìn)一步解釋和拓展了包合物錨定理論模型。Chakraborty等[43]在研究云杉蚜蟲(chóng)sbwAFP與冰-水界面層相互作用機(jī)制中，通過(guò)分子模擬研究發(fā)現(xiàn)，由蘇氨酸殘基排列形成甲基側(cè)鏈（THR階梯），同時(shí)蘇氨酸羥基與少量接近THR階梯的那些高度有序的水分子形成強(qiáng)氫鍵，使sbwAFP圍繞IBS通過(guò)氫鍵作用錨定包合水并實(shí)現(xiàn)在冰晶基面上固定（圖9）。

圖9 sbwAFP分子中THR階梯側(cè)鏈結(jié)構(gòu)及其包合物錨定模型結(jié)構(gòu)[43]Fig.9 sbwAFP THR ladder side chain structure and its inclusion complex anchor model structure[43]

吸附的sbwAFP-冰復(fù)合物在特定熱滯值范圍內(nèi)經(jīng)歷動(dòng)態(tài)交換形成氫鍵結(jié)合的復(fù)合物。Chakraborty等[44]通過(guò)自由能計(jì)算分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)sbwAFP對(duì)不同冰面的結(jié)合親和力順序?yàn)榛妫纠庵妫纠忮F面，而且平面特異性主要與包合水的數(shù)量及其瞬時(shí)波動(dòng)密切相關(guān)，且包合水與sbwAFP的IBS和冰表面形成雙氫鍵，從而將AFP錨定在冰表面。在基面上，由于冰表面氧原子重復(fù)距離和IBS處蘇氨酸重復(fù)距離的周期性是精確匹配的，因此錨定包合物-水的排列非常穩(wěn)定。在棱鏡平面吸附的情況下，IBS處蘇氨酸重復(fù)距離與氧原子重復(fù)距離之間的匹配度較低，而在錐體平面吸附的情況下該匹配最低，因此錨定包合物-水陣列的穩(wěn)定性隨棱鏡和錐平面吸附而逐漸降低。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，蘇氨酸殘基的甲基側(cè)鏈在穩(wěn)定被固定的包合水中起主要作用。其周圍的水合作用在低溫下變得非常顯著，從而穩(wěn)定了錨定的包合物-水陣列，而包合水與sbwAFP的IBS和冰表面形成的雙氫鍵是這種穩(wěn)定性的結(jié)果。

此外，Hudait等[45]使用分子模擬技術(shù)也發(fā)現(xiàn)高活性昆蟲(chóng)AFPs，如TmAFP、CfAFP和RiAFP具有TxT（T表示蘇氨酸；x表示非保守氨基酸）重復(fù)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的冰結(jié)合基序。該結(jié)合序列可使AFPs將水分子錨定在冰結(jié)合面上，從而使AFPs與冰晶結(jié)合。Sun Tianjun等[46]研究發(fā)現(xiàn)一種富含丙氨酸的四螺旋束二聚體的AFPs分子晶體結(jié)構(gòu)核心保留了大約400 個(gè)水分子，其冰結(jié)合殘基指向分子內(nèi)部，并將內(nèi)部水分子協(xié)調(diào)成兩個(gè)相交的多角形網(wǎng)絡(luò)，使螺旋束之間接觸減少，并通過(guò)AFPs分子內(nèi)部的主鏈羰基錨定到半包合水單分子膜上而穩(wěn)定。有序的水分子向外延伸到蛋白質(zhì)表面，與冰晶結(jié)合面進(jìn)行結(jié)合，從而形成AFPs吸附到冰上的包合物錨定模型。Cheng Jing等[47]利用分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)研究了牙鲆AFPs及其兩個(gè)突變體在氣相、溶劑化和水溶液等條件下吸附在冰晶基面上的作用模型。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些AFPs中的Asp、Asn和Thr殘基在冰的結(jié)合中起重要作用；突變體氫鍵的數(shù)量越多，其抗凍活性就越大；同時(shí)范德華相互作用和疏水效應(yīng)在冰結(jié)合中也起重要作用，且冰的表面有一個(gè)有利于疏水基團(tuán)分配到冰表面的包合結(jié)構(gòu)。

上述這些包合物錨定理論模型較好地揭示了冰-水界面層中的AFPs與其周圍的水分子形成的水合作用在AFPs與冰晶結(jié)合過(guò)程中起到重要作用，并說(shuō)明AFPs可通過(guò)氫鍵與疏水效應(yīng)作用形成包合物，同時(shí)得到的水合結(jié)構(gòu)的間隔能很好地將AFPs結(jié)合于冰晶棱面和基面上[41]。

2.6 親和相互作用偶聯(lián)團(tuán)聚模型

相關(guān)研究顯示，AFPs與冰晶相互作用過(guò)程中AFPs不僅與冰晶作用，而且可與冰晶界面層處其他組分發(fā)生親和作用，影響或改變AFPs-冰晶復(fù)合體的分子結(jié)構(gòu)[48]。研究指出，當(dāng)AFPs-冰晶復(fù)合體與其他分子的親和相互作用達(dá)到一定程度時(shí)，AFPs-冰晶復(fù)合體就會(huì)團(tuán)聚起來(lái)，從而使冰核變大，表面自由能降低，冰晶生長(zhǎng)被促進(jìn)，AFPs呈破壞作用；反之，若親和相互作用小，AFPs-冰晶復(fù)合體不團(tuán)聚，AFPs僅起到抑制重結(jié)晶的作用，并有利于超低溫保存。另外冷凍保護(hù)劑的組成和濃度、降溫和復(fù)溫速度、AFPs類型和濃度、最初冰晶數(shù)目，以及被凍細(xì)胞表面特征等，都可能影響親和相互作用的強(qiáng)烈程度[1]。這種作用模式就是親和相互作用偶聯(lián)團(tuán)聚模型。

親和相互作用偶聯(lián)團(tuán)聚模型很好地解釋了AFPs在超低溫保存中具有雙重作用。例如，一方面，AFPs在結(jié)合冰晶后所暴露的疏水面能夠與細(xì)胞膜磷脂雙分子層發(fā)生相互作用，對(duì)細(xì)胞起低溫保護(hù)作用[1]；另一方面，研究表明，II型AFPs是從C型動(dòng)物凝集素（一類含有鈣離子依賴糖識(shí)別域的蛋白質(zhì)）中的碳水化合物識(shí)別區(qū)演化而來(lái)，因此II型AFPs可結(jié)合細(xì)胞膜上的糖蛋白[49]。體外實(shí)驗(yàn)證明，AFPs活性可通過(guò)一系列低分子化合物來(lái)增強(qiáng)或減弱。一種含有碳水化合物的細(xì)菌AFPs，既具有抗凍活性，又具有冰核活性（促進(jìn)冰晶生長(zhǎng)活性）；去除碳水化合物部分，冰核活性也隨之消失[50]。

親和相互作用偶聯(lián)團(tuán)聚模型進(jìn)一步揭示了其他組分對(duì)于AFPs與冰-水界面層相互作用過(guò)程的影響。這種影響是產(chǎn)生冰核效應(yīng)還是抑制冰晶生長(zhǎng)效應(yīng)，還有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 語(yǔ)

AFPs所具有的獨(dú)特抗凍活性一直以來(lái)廣泛引起人們關(guān)注，因其不僅對(duì)低溫生物體（如細(xì)胞結(jié)構(gòu)）有著至關(guān)重要的生理作用，而且在食品工業(yè)、醫(yī)藥領(lǐng)域、生物材料保存、抗凍性相關(guān)轉(zhuǎn)基因植物選育及抗凍材料開(kāi)發(fā)等方面有著巨大的應(yīng)用價(jià)值。然而，至今由于其種類和結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，關(guān)于其在冷凍環(huán)境下到底如何調(diào)控冰-水界面層結(jié)構(gòu)，以什么樣方式與冰晶結(jié)合或互作從而實(shí)現(xiàn)其抑制冰晶生長(zhǎng)，產(chǎn)生熱滯活性和重結(jié)晶抑制活性一直以來(lái)未得到清晰而系統(tǒng)的解析。本文基于對(duì)以上問(wèn)題的探討，對(duì)國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究進(jìn)行了綜述，從幾種典型的理論模型分析中，揭示了AFPs通過(guò)調(diào)控冰-水界面層結(jié)構(gòu)產(chǎn)生結(jié)合或相互作用驅(qū)動(dòng)力作用特點(diǎn)，解析了AFPs產(chǎn)生熱滯活性和重結(jié)晶抑制活性的主要作用模式及其機(jī)理。其中吸附-抑制模型主要機(jī)理為AFPs通過(guò)氫鍵或疏水作用吸附到冰晶表面，通過(guò)Kelvin效應(yīng)增加表面張力與改變冰晶表面曲率的變化抑制冰晶的生長(zhǎng)速率和降低凝固點(diǎn)，從而使AFPs具有熱滯活性；偶極子-偶極子模型認(rèn)為AFPs可以基于AFPs分子中的α-螺旋極性與水分子極性的相互作用來(lái)阻止冰晶在基面（垂直于c軸）方向（a軸）上的生長(zhǎng)；晶體占位-晶格匹配模型提出了AFPs與冰晶表層形成氫鍵或疏水作用，以及AFPs選擇性吸附到特定冰晶結(jié)合面形成臺(tái)階固定及表面固定，從而使AFPs吸附到冰晶體上并阻止其生長(zhǎng)；剛體能量模型較好地解釋了黏附自由能是使AFPs運(yùn)動(dòng)至冰-水界面層的主要驅(qū)動(dòng)力；包合物錨定理論模型較好地揭示了冰-水界面層中的AFPs與其周圍的水分子形成的水合作用促進(jìn)AFPs在冰晶棱面和基面上結(jié)合；親和相互作用偶聯(lián)團(tuán)聚模型揭示了其他組分對(duì)于AFPs與冰-水界面層相互作用過(guò)程的影響，其作用既可以產(chǎn)生冰核效應(yīng)也會(huì)產(chǎn)生抑制冰晶生長(zhǎng)效應(yīng)。

當(dāng)然，每種理論模型都還有其不完善和不足之處，今后還需要應(yīng)用更多的理論化學(xué)、物理化學(xué)、食品工程科學(xué)、計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)以及原位分析的先進(jìn)光譜成像技術(shù)（如冷凍電鏡）來(lái)探究AFPs在復(fù)雜體系中對(duì)冰-水界面層結(jié)構(gòu)調(diào)控機(jī)制，為開(kāi)發(fā)更多具有應(yīng)用價(jià)值的AFPs種類及促進(jìn)其在食品、醫(yī)藥等工業(yè)領(lǐng)域中應(yīng)用提供理論參考。