田艷花，吳 磊，杜會(huì)枝，楊兆艷，張立偉,

（1.山西大學(xué)分子科學(xué)研究所，中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006；2.山西藥科職業(yè)學(xué)院食品工程系，山西 太原 030031；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801）

在正常情況下，細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝、增殖和分化均受機(jī)體有序調(diào)控，但當(dāng)細(xì)胞發(fā)生癌變時(shí)則不受機(jī)體控制，導(dǎo)致其惡性增殖分化，嚴(yán)重影響機(jī)體正常生理和代謝功能，最終導(dǎo)致機(jī)體死亡。肝癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，其所致死亡率位居所有惡性腫瘤的第二位[1]。目前治療肝癌的主要手段包括手術(shù)、放療和化療。手術(shù)雖可局部切除腫瘤，但不能根除腫瘤細(xì)胞，疾病復(fù)發(fā)的概率非常高[2]；放、化療對(duì)局部腫瘤有效，對(duì)轉(zhuǎn)移性病灶難以發(fā)揮有效的治療作用，同時(shí)會(huì)對(duì)患者正常細(xì)胞和組織造成不可逆?zhèn)?，產(chǎn)生諸多的不良反應(yīng)和副作用[3]。因此，從天然產(chǎn)物中尋找高效、毒副作用小的預(yù)防和治療肝癌的活性成分成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)之一。

君遷子（Diospyros lotusL.）屬于柿科，又名牛奶棗、黑棗和軟棗等，在我國(guó)山東、遼寧、河南、河北、陜西及西南等地廣泛種植。其葉中富含VC、胡蘿卜素、黃酮類(lèi)、酚類(lèi)、谷山醇類(lèi)等活性成分[4]，其中楊梅苷是君遷子葉中最主要的活性成分之一[5]，其基本結(jié)構(gòu)如圖1所示。楊梅苷因特殊的結(jié)構(gòu)而具有較強(qiáng)的抗氧化、抗炎及抗焦慮等功能[6]。Kandalkar等[7]研究發(fā)現(xiàn)從大戟葉中分離得到的楊梅苷能有效清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基和羥自由基。Chen Wei等[8]研究發(fā)現(xiàn)楊梅苷可防止過(guò)氧亞硝酸鹽誘導(dǎo)的DNA損傷和星形膠質(zhì)細(xì)胞毒性。孫桂波等[9]研究發(fā)現(xiàn)楊梅苷可通過(guò)增強(qiáng)抗氧化酶活性、穩(wěn)定線(xiàn)粒體膜電位、抑制Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)和磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶來(lái)保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)急損傷。Domitrovi?等[10]研究發(fā)現(xiàn)楊梅苷可提升CCl4誘導(dǎo)的肝損傷小鼠血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的活性，提升肝臟谷胱甘肽和細(xì)胞色素P450 2E1的表達(dá)水平，抑制肝臟中環(huán)氧合酶2和腫瘤壞死因子-α的過(guò)度表達(dá)，促進(jìn)CCl4中毒后的肝組織再生，從而起到保肝作用。徐容容等[11]研究發(fā)現(xiàn)楊梅苷能顯著促進(jìn)人前列腺癌PC-3細(xì)胞凋亡，進(jìn)而對(duì)PC-3細(xì)胞增殖具有較強(qiáng)的抑制作用。目前已有研究發(fā)現(xiàn)楊梅苷的苷元楊梅酮具有促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡的功效，如Zhang Xiaohong等[12]研究發(fā)現(xiàn)楊梅酮可以破壞線(xiàn)粒體膜電位，誘導(dǎo)凋亡前蛋白Bax向線(xiàn)粒體移位，下調(diào)抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)，并促進(jìn)細(xì)胞色素c從線(xiàn)粒體釋放到胞漿中，加速HepG2細(xì)胞凋亡。Zhang Xiaohong等[13]研究發(fā)現(xiàn)楊梅酮具有抑制HepG2細(xì)胞增殖、降低HepG2細(xì)胞周期蛋白B/Cdc2復(fù)合物活性的作用，并能將HepG2細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，同時(shí)加速細(xì)胞凋亡。Cao Jianping等[14]研究發(fā)現(xiàn)楊梅酮作為天然黃酮類(lèi)化合物可通過(guò)促進(jìn)HepG2細(xì)胞自噬、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和加速HepG2細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤的發(fā)生。綜上所述，楊梅苷的苷元楊梅酮具有抗腫瘤活性，但目前楊梅苷對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的抗腫瘤活性及其作用機(jī)制尚不清晰。因此，本研究以君遷子葉為原料，通過(guò)分離純化獲得高純度的楊梅苷單體，采用噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法測(cè)定不同濃度楊梅苷在不同處理時(shí)間下對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響，并通過(guò)激光共聚焦顯微鏡結(jié)合Hoechst 33342染色觀察經(jīng)楊梅苷處理后的HepG2細(xì)胞的形態(tài)變化；此外，利用流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)楊梅苷對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡、周期阻滯、胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平及單丹璜酰戊二胺（monodansylcadaverine，MDC）平均熒光強(qiáng)度的影響；最后通過(guò)Western blot檢測(cè)不同濃度楊梅苷對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響，以期明確楊梅苷抗肝癌活性及其作用機(jī)制。

圖1 楊梅苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structural formula of myricitrin

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

楊梅苷（純度≥95%）由實(shí)驗(yàn)室自制（君遷子葉熱水回流提取，提取液經(jīng)醇沉、D101大孔樹(shù)脂柱初分離得到活性組分，活性組分通過(guò)Sephadex LH-20柱分離得到化合物1，通過(guò)質(zhì)譜及核磁共振鑒定為楊梅苷，采用高效液相色譜儀測(cè)定其純度為95.18%）；人肝癌細(xì)胞（HepG2細(xì)胞）和人正常肝細(xì)胞（L-02細(xì)胞） 北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù)。

杜氏改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）和雙抗（青霉素/鏈霉素） 日本同仁公司；胰蛋白酶消化液 美國(guó)HyClone公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 美國(guó)Sigma公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和RIPA細(xì)胞裂解液 北京佛博生物科技有限公司；ROS檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程研究所；MDC 上海懋康生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡和周期檢測(cè)試劑盒 上海前塵生物科技有限公司；Bcl-2、Bax、細(xì)胞色素c、Apaf-1、Caspase-3/9、Beclin 1、Atg5、LC3-I、LC3-II和β-actin抗體 美國(guó)CST公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CO2恒溫培養(yǎng)箱、EVOS M7000倒置顯微鏡 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；SW-CJ-2FD超凈臺(tái)上海涵今儀器儀表有限公司；TG18K-II型高速冷凍離心機(jī) 上海趙迪生物科技有限公司；ZE5流式細(xì)胞儀美國(guó)BIO-RAD公司；FV3000激光共聚焦顯微鏡美國(guó)Thorlabs公司；JC-1086C Pro全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀青島聚創(chuàng)環(huán)保儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和樣品制備

將HepG2和L-02細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)基（加體積分?jǐn)?shù)10% FBS和體積分?jǐn)?shù)1%雙抗）中，然后將其置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞鋪滿(mǎn)培養(yǎng)皿底70%～80%時(shí)，將細(xì)胞進(jìn)行傳代，采用對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用DMEM培養(yǎng)基溶解楊梅苷，并加入助溶劑DMSO（終體積分?jǐn)?shù)小于0.05%），配制成1 mol/L的楊梅苷樣品溶液，無(wú)菌膜過(guò)濾備用。

1.3.2 細(xì)胞存活率測(cè)定

采用MTT法測(cè)定HepG2和L-02細(xì)胞的存活率。按照5×103個(gè)/孔的細(xì)胞密度將上述兩種細(xì)胞分別接種于96 孔板中，每孔200 μL，在37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞完全貼壁后，棄去上清液，然后加入楊梅苷樣品溶液使楊梅苷終濃度分別為10、50、100、200 μmol/L（楊梅苷實(shí)驗(yàn)組）；同時(shí)設(shè)對(duì)照組（不含楊梅苷），對(duì)照組含有與實(shí)驗(yàn)組等體積的完全培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。在37 ℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)24、48、72 h后，棄去上清液，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），培養(yǎng)4 h，棄上清液，最后每孔加入150 μL DMSO，振蕩15 min，使藍(lán)色結(jié)晶溶解，置于酶標(biāo)儀中，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，并計(jì)算細(xì)胞存活率為50%時(shí)楊梅苷的濃度即半數(shù)抑制濃度（50% inhibiting concentration，IC50）。根據(jù)下式計(jì)算HepG2和L-02細(xì)胞存活率[15]。

式中：A0為對(duì)照組的平均吸光度；A1為楊梅苷實(shí)驗(yàn)組的平均吸光度。

1.3.3 HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平的測(cè)定

利用2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2',7'-dichlorodih ydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）熒光探針，并通過(guò)流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)不同濃度楊梅苷對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS的影響。取對(duì)數(shù)期HepG2細(xì)胞（1×105個(gè)/孔）接種于6 孔板中，2 mL/孔，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，按照1.3.2節(jié)方法加入楊梅苷并設(shè)立對(duì)照組，每孔設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后，每孔加入終濃度5 μmol/L的DCFH-DA熒光探針，避光反應(yīng)20 min，吸去熒光探針，細(xì)胞用PBS洗滌2 次，隨后利用胰蛋白酶將其消化，離心棄去上清液，PBS重懸，利用流式細(xì)胞儀測(cè)定每孔樣品的熒光強(qiáng)度。

1.3.4 Hoechst 33342染色法觀察細(xì)胞形態(tài)

取對(duì)數(shù)期HepG2細(xì)胞（1×105個(gè)/孔）接種在蓋玻片6 孔板中，2 mL/孔，在37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，按照1.3.2節(jié)的方法加入楊梅苷并設(shè)立對(duì)照組，培養(yǎng)48 h后，吸去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌3 次，每孔加入1 mL體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定1 h，棄去固定液，用預(yù)冷的PBS洗滌3 次，然后加入終質(zhì)量濃度為5 mg/L的Hoechst 33342染液，37 ℃避光染色15 min，取出蓋玻片，用濾紙吸干蓋玻片底部，將其置于激光共聚焦顯微鏡（激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為340 nm和488 nm）下觀察并拍照。

1.3.5 HepG2細(xì)胞凋亡率及周期檢測(cè)

對(duì)數(shù)期HepG2細(xì)胞（1×105個(gè)/孔）接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，按照1.3.2節(jié)的方法加入楊梅苷并設(shè)立對(duì)照組，培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，采用PBS洗滌2 次。分別取1×105個(gè)HepG2細(xì)胞，每份樣品加入5 μL Annexin V染液和10 μL碘化丙啶染液，在4 ℃條件下避光染色30 min，通過(guò)流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)HepG2細(xì)胞凋亡率。

用同樣的方式收集細(xì)胞，分別取1×105個(gè)HepG2細(xì)胞，在4 ℃條件下，采用1 mL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液固定，培養(yǎng)12 h，然后將其以1 000 r/min離心5 min，除去固定液，用預(yù)冷的PBS洗滌3 次后，加入100 μL RNA酶（100 μg/mL），在37 ℃下消化30 min，加入100 μL碘化丙啶染色液（50 μg/mL），在4 ℃條件下避光染色30 min，最后通過(guò)流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)HepG2細(xì)胞周期分布。

1.3.6 MDC熒光檢測(cè)HepG2細(xì)胞自噬

按照1.3.5節(jié)操作步驟將細(xì)胞培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，棄去上清液，然后加入楊梅苷樣品溶液使楊梅苷終濃度分別為10、50、100、200 μmol/L，干預(yù)48 h后，吸去含楊梅苷的上清液，用Wash Buffer洗滌2 次，然后加入10 μL 50 μmol/L MDC染色液，在4 ℃條件下，避光孵育30 min，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2 次，將所得的樣品置于流式細(xì)胞分析儀中檢測(cè)每個(gè)樣品細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度。

1.3.7 Western blot檢測(cè)HepG2細(xì)胞凋亡和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)量

采用Western blot法分析不同濃度楊梅苷對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響。將對(duì)數(shù)期的HepG2細(xì)胞接種于直徑60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿（2.5×105個(gè)/皿），在37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)24 h，按照1.3.2節(jié)的方法加入楊梅苷并設(shè)置對(duì)照組，培養(yǎng)48 h后，加入100 μL RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，利用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。測(cè)定蛋白濃度后，吸取20 μL蛋白樣品上樣于質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%～10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，進(jìn)行電泳分離，冰浴下將其轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉封閉液中，25 ℃搖床孵育1 h，加入對(duì)應(yīng)的一抗后4 ℃孵育12 h。次日換為辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的二抗孵育1 h，采用電致化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）顯影，然后通過(guò)凝膠成像檢測(cè)Bcl-2、Bax、Apaf-1、細(xì)胞色素c、Caspase-3/9、Beclin 1、Atg5、LC3-I、LC3-II和β-actin蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果采用Image Lab軟件對(duì)相應(yīng)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用Statistix 8.0軟件對(duì)每組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析；采用SAS 8.0軟件，并利用Duncan法對(duì)結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析；采用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度楊梅苷對(duì)L-02和HepG2細(xì)胞存活率的影響

利用不同濃度的楊梅苷分別處理L-02和HepG2細(xì)胞24、48 h和72 h，其對(duì)L-02和HepG2細(xì)胞存活率的影響如圖2所示。

圖2 楊梅苷對(duì)L-02細(xì)胞和HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effect of myricitrin on the survival rates of L-02 cells and HepG2 cells

由圖2A可知，用10～200 μmol/L的楊梅苷處理正常肝細(xì)胞（L-02細(xì)胞）24、48 h和72 h，L-02細(xì)胞存活率均無(wú)顯著變化（P＞0.05），表明楊梅苷在10～200 μmol/L的濃度范圍內(nèi)對(duì)正常肝細(xì)胞（L-02）無(wú)損害作用。通過(guò)倒置顯微鏡進(jìn)一步觀察L-02細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)10～200 μmol/L的楊梅苷處理L-02細(xì)胞后，細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量與對(duì)照組相比均未發(fā)生明顯變化（圖2B），進(jìn)一步證明楊梅苷在濃度為10～200 μmol/L下對(duì)正常肝細(xì)胞無(wú)毒。進(jìn)一步研究在該濃度（10～200 μmol/L）范圍內(nèi)楊梅苷對(duì)人肝癌細(xì)胞（HepG2細(xì)胞）存活率的影響，由圖2C可知，在處理時(shí)間相同的情況下，不同濃度的楊梅苷對(duì)HepG2細(xì)胞存活率影響顯著不同（P＜0.05），隨楊梅苷濃度的增加，HepG2細(xì)胞存活率呈顯著降低趨勢(shì)（P＜0.05），且呈濃度依賴(lài)關(guān)系。另一方面，相同濃度的楊梅苷分別處理HepG2細(xì)胞24、48、72 h后，HepG2細(xì)胞存活率顯著不同（P＜0.05），處理24 h的HepG2細(xì)胞存活率顯著高于48 h和72 h（P＜0.05），處理48 h和72 h的HepG2細(xì)胞存活率無(wú)顯著差異（P＞0.05）。通過(guò)回歸擬合分析得到楊梅苷處理HepG2細(xì)胞24、48、72 h后的IC50分別為344.99、176.41、142.81 μmol/L，結(jié)果表明同濃度的楊梅苷處理細(xì)胞時(shí)間越長(zhǎng)，IC50越小，對(duì)HepG2細(xì)胞的殺傷能力越強(qiáng)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示楊梅苷對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用，其抑制作用與楊梅苷濃度和作用時(shí)間呈正相關(guān)。

2.2 不同濃度楊梅苷對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

在正常情況下，機(jī)體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡，適量ROS能提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力，并且增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力[16]。但當(dāng)細(xì)胞受到外界應(yīng)激原刺激時(shí)，胞內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS，過(guò)量的ROS對(duì)細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和核酸造成氧化損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[17]。為進(jìn)一步探究楊梅苷是否能引起HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化，本研究利用DCFH-DA熒光探針檢測(cè)不同濃度楊梅苷對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響，其平均熒光強(qiáng)度可直觀反映胞內(nèi)ROS水平，結(jié)果如圖3所示。不同濃度楊梅苷（10～200 μmol/L）處理HepG2細(xì)胞，其胞內(nèi)ROS水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），且楊梅苷濃度越大，HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平越高。表明楊梅苷能顯著提高HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞凋亡。

圖3 不同濃度楊梅苷對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響Fig.3 Effect of myricitrin at different concentrations on ROS levels in HepG2 cells

2.3 不同濃度楊梅苷對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響

由2.2節(jié)結(jié)果可知，楊梅苷能顯著提高HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平，大量研究表明過(guò)量的ROS會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18-19]。為進(jìn)一步驗(yàn)證楊梅苷是否能夠誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，本實(shí)驗(yàn)采用Hoechst 33342染色法對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行染色，利用激光共聚焦顯微鏡觀察染色后的HepG2細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果如圖4所示。與對(duì)照組相比，楊梅苷（10～200 μmol/L）干預(yù)后的HepG2細(xì)胞數(shù)量明顯減少，不規(guī)則細(xì)胞數(shù)增多，細(xì)胞核的藍(lán)色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。表明楊梅苷可通過(guò)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡而抑制其生長(zhǎng)，從而達(dá)到抗肝癌的效果。

圖4 激光共聚焦顯微鏡下觀察不同濃度楊梅苷對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響（100×）Fig.4 Effect of myricitrin at different concentrations on HepG2 cell morphology observed by laser confocal microscope (100 ×)

2.4 不同濃度楊梅苷對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡率的影響

目前大量研究已經(jīng)證明楊梅苷具有抗氧化和清除自由基的能力[20]，對(duì)癌細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，并能加速癌細(xì)胞的凋亡[21]。因此，本研究在MTT和Hoechst 33342實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用流式細(xì)胞分析儀進(jìn)一步探究不同濃度楊梅苷對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡率的影響，結(jié)果如圖5所示。隨楊梅苷濃度增加，HepG2細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.05），且呈濃度依賴(lài)效應(yīng)。當(dāng)楊梅苷濃度為10、50、100、200 μmol/L時(shí)，HepG2細(xì)胞凋亡率分別為（15.14±1.05）%、（25.74±1.38）%、（35.16±2.04）%和（55.75±1.99）%，與對(duì)照組相比，凋亡率分別增加12.60%、23.20%、32.62%和53.21%。表明楊梅苷可抑制HepG2細(xì)胞增殖，加速細(xì)胞凋亡，且濃度越大，促凋亡效果越顯著。

圖5 不同濃度楊梅苷對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 Effect of myricitrin at different concentrations on apoptosis in HepG2 cells

2.5 不同濃度楊梅苷對(duì)HepG2細(xì)胞周期的調(diào)控

為探究楊梅苷對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制是否與細(xì)胞周期阻滯有關(guān)，本研究考察了不同濃度楊梅苷對(duì)HepG2細(xì)胞周期分布規(guī)律的影響，結(jié)果如圖6所示。當(dāng)楊梅苷濃度在10～200 μmol/L時(shí)，隨楊梅苷濃度增加G0/G1期的細(xì)胞比例顯著降低（P＜0.05），而G2/M期的細(xì)胞比例顯著增加（P＜0.05），且呈濃度依賴(lài)性。當(dāng)楊梅苷濃度為50 μmol/L和100 μmol/L時(shí)，S期細(xì)胞比例無(wú)顯著差異（P＞0.05），而高濃度（200 μmol/L）楊梅苷處理的HepG2細(xì)胞，其S期細(xì)胞比例均顯著高于對(duì)照組和低濃度楊梅苷處理組（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明楊梅苷對(duì)HepG2細(xì)胞周期有調(diào)控作用，可將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，高劑量的楊梅苷還可使HepG2細(xì)胞阻滯于S期，從而抑制HepG2細(xì)胞的增殖。

圖6 不同濃度楊梅苷對(duì)HepG2細(xì)胞周期分布的影響Fig.6 Effect of myricitrin at different concentrations on cell cycle distribution in HepG2 cells

2.6 不同濃度楊梅苷對(duì)HepG2細(xì)胞自噬的影響

2.4節(jié)和2.5節(jié)結(jié)果表明楊梅苷可通過(guò)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，調(diào)控細(xì)胞周期，起到抑制HepG2細(xì)胞增殖的作用。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步探究楊梅苷可否通過(guò)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬從而抑制其增殖。自噬體和溶酶體均為酸性液泡，MDC作為嗜酸性的染色劑，能與細(xì)胞中酸性液泡發(fā)生特異性結(jié)合而產(chǎn)生熒光，熒光強(qiáng)度的大小能直觀反映藥物對(duì)細(xì)胞自噬作用的強(qiáng)弱[22-23]。本研究采用MDC染色法檢測(cè)不同濃度楊梅苷對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度的影響，其結(jié)果如圖7所示。與對(duì)照組相比，樣品組HepG2細(xì)胞中MDC平均熒光強(qiáng)度隨楊梅苷濃度的增加顯著增強(qiáng)（P＜0.05），當(dāng)楊梅苷濃度為10、50、100、200 μmol/L時(shí)，HepG2細(xì)胞中MDC平均熒光強(qiáng)度較對(duì)照組分別提高了0.26、0.43、0.74、1.20 倍。表明楊梅苷可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬，從而抑制HepG2細(xì)胞增殖。

圖7 不同濃度楊梅苷對(duì)HepG2細(xì)胞自噬的影響Fig.7 Effect of myricitrin at different concentrations on autophagy in HepG2 cells

2.7 不同濃度楊梅苷對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

在真核生物中，線(xiàn)粒體作為能量和代謝的中心，為細(xì)胞的生命活動(dòng)提供必要的基礎(chǔ)能量，同時(shí)也作為細(xì)胞凋亡的控制中心，在各種信號(hào)通路中起著關(guān)鍵性作用[24-25]。線(xiàn)粒體通路中的Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮“主開(kāi)關(guān)”作用。Bax的作用與之相反，通過(guò)改變細(xì)胞膜電位促進(jìn)細(xì)胞色素c釋放和凋亡酶激活因子（Apaf-1）表達(dá)量增加，促使細(xì)胞色素c和Apaf-1形成多聚體，激活Caspase家族和自噬效應(yīng)蛋白（Beclin 1），導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[26-27]。為進(jìn)一步探究楊梅苷對(duì)HepG2細(xì)胞抗腫瘤作用的分子機(jī)制，采用Western blot檢測(cè)不同濃度楊梅苷對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量，結(jié)果如圖8所示。與對(duì)照組相比，楊梅苷實(shí)驗(yàn)組中Bax、細(xì)胞色素c、Caspase-9和Caspase-3相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)（P＜0.05），50、100、200 μmol/L楊梅苷實(shí)驗(yàn)組中Apaf-1相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)（P＜0.05）；楊梅苷實(shí)驗(yàn)組Bcl-2相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)（P＜0.05），且呈濃度依賴(lài)性。以上結(jié)果表明楊梅苷能激活線(xiàn)粒體介導(dǎo)的凋亡通路，上調(diào)促凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平，下調(diào)抑制凋亡的相關(guān)蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而抑制HepG2細(xì)胞增殖，加速細(xì)胞凋亡，起到抗肝癌的作用。

圖8 不同濃度楊梅苷對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.8 Effect of myricitrin at different concentrations on the relative expression levels of apoptosis-related proteins in HepG2 cells

2.8 不同濃度楊梅苷對(duì)HepG2細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響

細(xì)胞自噬被過(guò)多激活，則會(huì)引發(fā)細(xì)胞II型程序性死亡[28]。細(xì)胞自噬平衡被打破與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，細(xì)胞自噬過(guò)程涉及多個(gè)關(guān)鍵因子，Beclin 1是一個(gè)重要的抑癌蛋白，在細(xì)胞自噬啟動(dòng)過(guò)程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)能下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，上調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá)，最終加速腫瘤細(xì)胞凋亡[29]。Atg5是一種常見(jiàn)的自噬相關(guān)蛋白，能促進(jìn)自噬發(fā)生和細(xì)胞色素c釋放，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[30]。LC3-I和LC3-II是自噬體經(jīng)典的標(biāo)志蛋白，在自噬發(fā)生過(guò)程中，LC3-I轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3-II[31]。本研究進(jìn)一步采用Western blot檢測(cè)楊梅苷處理的HepG2細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量，其結(jié)果如圖9所示。與對(duì)照組相比，不同濃度楊梅苷（10～200 μmol/L）處理的HepG2細(xì)胞的Beclin 1、Atg5和LC3-II相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.05），而LC3-I相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)（P＜0.05）。除楊梅苷濃度為10 μmol/L和50 μmol/L時(shí)Atg5相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異（P＞0.05）外，其余細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量均與楊梅苷濃度呈正相關(guān)。以上結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)楊梅苷可促進(jìn)HepG2細(xì)胞自噬，從而抑制HepG2細(xì)胞增殖，達(dá)到抗肝癌的作用。

圖9 不同濃度楊梅苷對(duì)HepG2細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.9 Effect of myricitrin at different concentrations on the relative expression levels of autophagy-related proteins

通過(guò)上述結(jié)果可知，當(dāng)HepG2細(xì)胞受到楊梅苷干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平提升，誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，Hoechst 33342染色結(jié)果證實(shí)楊梅苷處理后HepG2細(xì)胞核具有較強(qiáng)的藍(lán)色熒光，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示楊梅苷均能顯著提高HepG2細(xì)胞的凋亡率和胞內(nèi)MDC平均熒光強(qiáng)度，并將HepG2細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，從而抑制HepG2細(xì)胞增殖；Western blot結(jié)果表明楊梅苷能上調(diào)Bax、細(xì)胞色素c、Apaf-1、Caspase-9、Caspase-3、Beclin 1、Atg5和LC3-II的相對(duì)表達(dá)量，下調(diào)Bcl-2和LC3-I的相對(duì)表達(dá)量，表明楊梅苷的抗肝癌機(jī)制與激活線(xiàn)粒體介導(dǎo)的凋亡通路、細(xì)胞周期阻滯和提升胞內(nèi)ROS水平和促進(jìn)細(xì)胞自噬有關(guān)。楊梅苷誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡和自噬的途徑如圖10所示。

圖10 楊梅苷誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡和自噬的相關(guān)途徑Fig.10 Apoptosis and autophagy induced by myricitrin in HepG2 cells

3 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明楊梅苷可通過(guò)激活線(xiàn)粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路、阻滯細(xì)胞周期、提升胞內(nèi)ROS水平并促進(jìn)細(xì)胞自噬來(lái)誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡，降低其存活率，從而起到抗肝癌作用。研究結(jié)果可為楊梅苷作為天然抗肝癌藥物的開(kāi)發(fā)提供理論參考。