譚 文，張欽俊，萬鵬宇，劉學(xué)波，段 翔

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

蛋清是一種以水作為分散介質(zhì)，以蛋白質(zhì)作為分散相的膠體物質(zhì)。雞蛋清中的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為78.3%～88.6%，蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.8%～11.6%，其余為極少的脂質(zhì)、維生素及礦物質(zhì)等。蛋清中的蛋白質(zhì)有40余種，含有人體必需的8 種氨基酸，人體消化吸收率在98%以上，是食品中最理想的蛋白質(zhì)資源之一[1-2]。同時，蛋清蛋白具有優(yōu)良的起泡性，因而被廣泛應(yīng)用于蛋糕、餅干、冰淇淋等食品中，是食品加工行業(yè)中重要的原輔料[3]。與植物蛋白發(fā)泡粉相比，蛋清蛋白發(fā)泡粉具有發(fā)泡性能強(qiáng)、無異味、使用范圍廣等諸多優(yōu)勢。近年來，隨著消費(fèi)者對高品質(zhì)食品的需求逐漸提高，開發(fā)具有高起泡性的蛋清蛋白粉從而改善食品品質(zhì)具有重要意義。

蛋清蛋白優(yōu)良的起泡性來自于其良好的兩親性，這使其在打發(fā)過程中分子結(jié)構(gòu)重新排布并快速分布于水相-氣相界面，使親水、疏水基團(tuán)分別趨向水相與氣相，包裹空氣并維持泡沫的穩(wěn)定性。因此，適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)改性對于蛋白質(zhì)的發(fā)泡以及泡沫穩(wěn)定性具有積極作用[4]。但是，受限于蛋清液的熱敏性與易受外來添加物污染等缺點，傳統(tǒng)高溫高壓等物理場干預(yù)以及需要引入外來物質(zhì)的化學(xué)接枝等蛋白質(zhì)改性方法難以實現(xiàn)工業(yè)化[5]。因此，探究綠色安全、操作便捷的蛋白改性方法對提升蛋清蛋白的起泡特性具有重要的實際意義。球磨處理是一種新型綠色快捷的加工技術(shù)，在食品加工中的應(yīng)用日趨廣泛[6]。球磨處理過程中，碰撞、摩擦和剪切產(chǎn)生綜合作用，促使蛋白分子結(jié)構(gòu)改變而影響其功能特性[7]。Sun Chanchan等[8]研究發(fā)現(xiàn)，與天然乳清蛋白相比，經(jīng)過球磨處理的乳清蛋白濃縮物具有更好的表面疏水性和泡沫穩(wěn)定性。Yu Cuiping等[9]發(fā)現(xiàn)球磨工藝可通過改變貽貝蛋白的結(jié)構(gòu)使更多酶切位點暴露，從而提高其消化率。Liu Bohui等[10]認(rèn)為，適當(dāng)?shù)那蚰スに嚳筛淖兇蠖狗蛛x蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)，提高大豆分離蛋白的凝膠性和持水性。上述研究為闡明球磨工藝對食品蛋白理化和加工性能的影響提供了參考。然而，蛋清蛋白在球磨過程中結(jié)構(gòu)和起泡能力的變化仍鮮有報道。因此，本研究旨在探究球磨工藝對蛋清蛋白起泡特性的影響，并探討其作用機(jī)制，為蛋清蛋白起泡特性的改良與高起泡性蛋清蛋白粉的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋為市售；5,5'-二硫雙(2-硝基苯甲酸)（5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 美國Sigma公司；氫氧化鈉、無水磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQM-2L球磨機(jī)以及直徑分別為10、7、5 mm的瑪瑙研磨球 長沙米琪儀器設(shè)備有限公司；LS55熒光分光光度計 美國PE公司；Q2000差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）儀 美國Waters公司；Vetex70傅里葉變換紅外光譜儀 德國布魯克公司；UV-1200紫外-可見分光光度計 上海美譜達(dá)儀器有限公司；Mastersizer 2000激光粒度儀 英國馬爾文公司；DFA100動態(tài)泡沫分析儀 德國Krüss公司；S-3400N掃描電子顯微鏡、MSP-IS離子發(fā)射儀 日本日立有限公司。

1.3 方法

1.3.1 球磨處理蛋清蛋白樣品的制備

取新鮮雞蛋清洗，打蛋、分蛋取蛋清，收集蛋清液并將其凍干。將凍干的蛋清蛋白粉末置于剛玉研磨杯中，加入總質(zhì)量與樣品質(zhì)量相當(dāng)?shù)闹睆椒謩e為10、7、5 mm（個數(shù)比1∶2∶4）的瑪瑙研磨球，在室溫避光條件下使用YXQM-2L球磨機(jī)以100 r/min分別研磨0、20、40 min和60 min后，將蛋清蛋白粉儲存在－20 ℃待進(jìn)一步分析。

1.3.2 游離巰基含量的測定

參考Li Huijing等[11]的方法，將40 mg DTNB溶解在10 mL TGE緩沖液（10.4 g Tris、6.9 g Gly和1.2 g乙二胺四乙酸二鈉溶解在1 000 mL去離子水（pH 8.0）中）中制備Ellman's試劑（加入DTNB后需要重新調(diào)節(jié)pH值至8.0）。將凍干后的蛋白樣品溶解于十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）-TGE緩沖液（100 mL TGE緩沖液加入2.5 g SDS）中，使最終的蛋清蛋白質(zhì)量濃度為10 mg/mL，振蕩溶解30 min（每10 min漩渦振蕩一次）。取4 mL蛋清蛋白溶液與0.04 mL Ellman's試劑溶液混合。將混合溶液在室溫下于黑暗條件中振蕩10 min，離心，選取上清液用分光光度計測定其在412 nm波長處的吸光度（空白對照為沒有添加Ellman's試劑和樣品的SDS-TGE緩沖液）。游離巰基含量按式（1）計算。

式中：A412nm為樣品在412 nm波長處的吸光度；ρ為樣品蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；73.53為106/13 600（13 600是Ellman's試劑的摩爾消光系數(shù)/（L/（mol·mL））。

1.3.3 表面疏水性的測定

參照Voutsinas等[12]的ANS探針法測定蛋白表面疏水性。將蛋清蛋白樣品用10 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）分別稀釋至不同質(zhì)量濃度（0.01～0.20 g/100 mL）。取20 μL 8.0 mmol/L磷酸鹽緩沖液配制的ANS溶液添加至4 mL的蛋白樣品溶液中，用熒光分光光度計測定樣品的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長為390 nm，發(fā)射波長為470 nm。以熒光強(qiáng)度與蛋白質(zhì)量濃度之間的初始斜率表征蛋白表面疏水性。

1.3.4 水解度的測定

參照Lamsal等[13]的方法進(jìn)行水解度測定。在20 mL蒸餾水中溶解100 mg蛋清蛋白，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0。50 ℃恒溫振蕩使溶液充分混合。向混合溶液中加入2 mg蛋白水解酶，定時測定溶液pH值，并通過加入0.25 mol/L氫氧化鈉溶液保持pH值恒定，記錄氫氧化鈉溶液的加入量。水解度按式（2）計算。

式中：V為加入氫氧化鈉溶液的體積/mL；c為氫氧化鈉溶液的濃度（0.25 mol/L）；α為α-氨基基團(tuán)的解離度（50 ℃、pH 8.0下α為0.88）；m是蛋清蛋白的質(zhì)量/g；htot是底物中肽鍵的數(shù)量，雞蛋蛋白的htot為8.38。

1.3.5 Zeta-電位和粒徑的測定

樣品溶液用10 mmol/L、pH 7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋至質(zhì)量濃度為2 mg/mL，利用馬爾文激光粒度儀對球磨前后的蛋白樣品溶液的Zeta-電位和粒徑進(jìn)行測定。

1.3.6 熱重分析

通過DSC技術(shù)測定蛋清蛋白樣品的熱力學(xué)參數(shù)。稱取2 mg左右蛋白樣品置于鋁制樣品盤中，掃描溫度范圍為40～180 ℃，將放置樣品的鋁制樣品盤和作為對照組的空鋁制樣品盤放入儀器，以5 ℃/min的速率從30 ℃加熱到180 ℃，通過軟件繪制DSC曲線。

1.3.7 傅里葉變換紅外光譜掃描

利用傅里葉變換紅外光譜儀分析蛋清蛋白的二級結(jié)構(gòu)的變化。蛋白質(zhì)樣品與溴化鉀以質(zhì)量比1∶200充分混合并磨成粉狀。取適量上述混合粉末，將其壓成薄片，在波數(shù)4 000～400 cm－1范圍內(nèi)，以空氣為背景分析樣品峰強(qiáng)度。使用Omnic軟件包和PeakFit v4.12軟件分析傅里葉變換紅外光譜數(shù)據(jù)。

1.3.8 起泡性分析

參照Kumar等的方法[14]，使用DFA100動態(tài)泡沫分析儀分析樣品的起泡性能。稱取蛋白樣品100 mg溶解于50 mL去離子水中制備蛋白溶液，將空氣以0.3 L/min的劑量噴注于pH值為8.8的蛋白溶液中，持續(xù)6 s制備泡沫，分別記錄每個樣品的最大泡沫體積Vmax以及泡沫由總體積的75%減少到50%所需要的時間。每組實驗重復(fù)測定3 次。以最大泡沫體積Vmax與初始液體體積Vs的比值反映其起泡性能，具體按式（3）計算，以泡沫持久性值（head retention value，HRV）（泡沫由75%減少到50%所需要的時間）來反映泡沫的穩(wěn)定性。

式中：Vmax為樣品的最大泡沫體積/mL；Vs為樣品的初始液體體積/mL。

1.3.9 掃描電子顯微鏡觀察

通過掃描電子顯微鏡觀察球磨處理前后的蛋白形態(tài)的變化。將蛋白樣品固定在樣品架上，用MSP-IS離子發(fā)射儀處理樣品。使用5 kV的加速電壓，分別在10k、5k、1k放大倍數(shù)下觀察樣品表面形態(tài)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗每組數(shù)據(jù)測定3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 17.0軟件中單因素方差分析法進(jìn)行顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 球磨處理對蛋清蛋白游離巰基含量的影響

蛋白的游離巰基在氧化劑存在時可以被氧化為二硫鍵，后者亦可以在有還原劑或其他作用力存在時還原為游離巰基[15]。因此，游離巰基含量可以反映蛋白分子結(jié)構(gòu)的變化。蛋清的主要蛋白中，只有卵白蛋白具有游離巰基[16]。雖然球磨處理伴隨著機(jī)械擠壓、摩擦等物理作用以及與空氣的充分接觸作用，但是球磨處理對蛋清蛋白的游離巰基沒有顯著影響（圖1）。說明球磨處理過程中沒有形成新的二硫鍵，也沒有二硫鍵的斷裂與重排。這可能與本實驗的處理條件相對溫和有關(guān)（最高球磨時間為60 min）。

圖1 球磨時間對蛋清蛋白游離巰基含量的影響Fig.1 Effect of ball-milling treatment time on free sulfhydryl group content of egg white proteins

2.2 球磨處理對蛋清蛋白表面疏水性的影響

天然蛋白分子變性時，分子結(jié)構(gòu)發(fā)生展開或折疊，使分子疏水基團(tuán)重新分布，表面疏水特性發(fā)生改變。因此，疏水性是反映蛋白分子結(jié)構(gòu)變性程度的直觀指標(biāo)[17]。在蛋清攪拌過程中，蛋白分子會在氣-液界面吸附，疏水基團(tuán)趨向于氣相[18]。由圖2可知，蛋清蛋白表面疏水性隨球磨時間的延長而顯著減小，說明球磨處理會破壞蛋清蛋白的天然結(jié)構(gòu)，促使蛋白結(jié)構(gòu)重新折疊或聚集，導(dǎo)致疏水基團(tuán)更多地被包裹于分子內(nèi)部[19]，從而降低其表面疏水性。通常，蛋白優(yōu)良的起泡性源于其平衡的兩親性，表面疏水基團(tuán)過多，則蛋白溶解性差，難以發(fā)揮加工特性；反之，表面疏水基團(tuán)過少，則不利于蛋白在氣-液界面分布。因此，表面疏水性的變化對于蛋白起泡特性具有顯著影響。

圖2 球磨時間對蛋清蛋白表面疏水性的影響Fig.2 Effect of ball-milling treatment time on surface hydrophobicity of egg white proteins

2.3 球磨處理對蛋清蛋白水解度的影響

由表1可知，天然蛋清蛋白的水解度很低（2.56%），這是由于天然蛋清蛋白具有較緊密的球狀結(jié)構(gòu)，一定程度上阻礙了酶的接觸與催化作用。隨著球磨時間的延長，蛋清蛋白的水解度顯著增加；經(jīng)過60 min球磨處理后，蛋白水解度由處理前的2.56%增加至8.24%，這可能是因為球磨改變了蛋清蛋白的分子結(jié)構(gòu)，使蛋清蛋白暴露出更多的酶切位點，從而對胰蛋白酶的敏感性增加[20]。通常認(rèn)為天然蛋清蛋白的低水解度是其觸發(fā)體內(nèi)食物過敏反應(yīng)的原因之一。本實驗結(jié)果表明，球磨處理后蛋清蛋白水解度顯著增加，有可能導(dǎo)致其致敏性下降。

表1 球磨時間對蛋清蛋白水解度、Zeta-電位和粒徑的影響Table 1 Effect of ball-milling treatment time on degree of hydrolysis,zeta potential and particle size of egg white proteins

2.4 球磨處理對蛋清蛋白Zeta-電位和粒徑的影響

蛋白質(zhì)凈電荷影響泡沫的穩(wěn)定性，蛋白分子表面攜帶的凈電荷越多，分子之間排斥力越大，形成的泡沫穩(wěn)定性越強(qiáng)[21]。因此，Zeta-電位絕對值越高，泡沫體系越穩(wěn)定[22]。同時，粒徑能夠反映蛋白質(zhì)分子間的分散和聚集等變化情況，粒徑越小，說明體系中蛋白分子分散性越好。如表1所示，球磨處理0～40 min，蛋清蛋白的Zeta-電位絕對值沒有顯著變化；當(dāng)球磨時間達(dá)到60 min時，蛋清蛋白的Zeta-電位絕對值顯著下降到9.76 mV。另外，蛋清蛋白粒徑在球磨60 min后達(dá)到最大值228.95 nm。這兩個結(jié)果共同說明，球磨處理60 min時，蛋白分子之間表面電荷數(shù)下降，分子膠束之間發(fā)生聚集。該結(jié)論與上述表面疏水性結(jié)果一致，即蛋白分子結(jié)構(gòu)改變，分子之間趨于聚集，將部分表面疏水基團(tuán)包裹于分子內(nèi)部[23]。

2.5 球磨處理對蛋清蛋白熱力學(xué)性質(zhì)的影響

熱穩(wěn)定性指共聚物在加熱時抵抗聚集的能力，它是衡量共聚物性質(zhì)的指標(biāo)。變性溫度能夠反映蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，與氨基酸組成和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象相關(guān)，焓變能夠反映蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的有序程度[24]。此外，熱穩(wěn)定性也可以反映蛋白質(zhì)三級構(gòu)象的有序程度[25-26]。本研究中，蛋清蛋白球磨后變性溫度和熱變性焓（ΔH）的變化如表2所示。隨球磨時間的延長，變性溫度沒有顯著變化（P＞0.05），表明球磨處理不會引起蛋清蛋白變性溫度的改變。但是，隨著球磨處理時間的延長，ΔH顯著下降，說明球磨會使蛋清蛋白分子結(jié)構(gòu)重排，有序性下降。該特性可能有助于蛋白分子柔性增加，從而更好地在氣-液界面分布。

表2 球磨時間對蛋清蛋白熱特性的影響Table 2 Effect of ball-milling treatment time on thermal properties of egg white proteins

2.6 球磨處理對蛋清蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)通過主鏈上的C＝O和N—H間的氫鍵作用維持，傅里葉變換紅外光譜圖中有酰胺I、II、III 3 組特征吸收譜帶，其波數(shù)分別對應(yīng)1 700～1 600 cm－1、1 550～1 530 cm－1和1 300～1 260 cm－1。其中，酰胺I帶最常用于分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。據(jù)報道，紅外光譜各子峰與各二級結(jié)構(gòu)的對應(yīng)關(guān)系如下：1 615～1 638 cm－1和1 682～1 698 cm－1為β-折疊，1 638～1 645 cm－1為無規(guī)卷曲，1 645～1 662 cm－1為α-螺旋，1 662～1 682 cm－1為β-轉(zhuǎn)角[27]。

由表3可知，隨著球磨時間的延長，蛋清蛋白β-折疊結(jié)構(gòu)相對含量顯著增加，α-螺旋結(jié)構(gòu)相對含量先降低后升高，而β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)相對含量先升高后降低。β-折疊和α-螺旋結(jié)構(gòu)占二級結(jié)構(gòu)的70%左右，這與Sheng Long等[28]的研究結(jié)果一致，表明蛋清蛋白具有較高的有序性和穩(wěn)定性。多數(shù)蛋白變性時，二級結(jié)構(gòu)的改變通常表現(xiàn)為α-螺旋相對含量下降[29]，β-折疊結(jié)構(gòu)相對含量有一定上升，這些都表明蛋清蛋白在受到球磨作用后，其疏水性基團(tuán)逐漸減少，而親水性基團(tuán)逐漸增多[30]，這與圖2表面疏水性結(jié)果一致。當(dāng)球磨時間超過40 min后，α-螺旋相對含量開始增加，其原因可能是過度球磨處理使蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集，這與上述Zeta-電位和粒徑的結(jié)果一致。

表3 不同球磨時間下蛋清蛋白的二級結(jié)構(gòu)含量Table 3 Secondary structure contents in egg white proteins with different ball-milling treatment times

2.7 球磨處理對蛋清蛋白起泡特性的影響

蛋白質(zhì)的起泡特性與其在氣-液兩相界面上形成膜的性質(zhì)相關(guān)。本實驗以最大泡沫體積Vmax與初始液體體積Vs的比值反映其起泡性能，以HRV反映其泡沫的穩(wěn)定性。Vmax和HRV結(jié)果如圖3所示，隨著球磨時間的延長，起泡性沒有顯著變化。其原因可能是，雖然球磨處理降低了蛋白分子的表面疏水性及其在氣-液界面分布的趨勢，但球磨處理后蛋白分子的柔性增加，有助于調(diào)整分子結(jié)構(gòu)更好地分布于泡沫表面。值得注意的是，隨著球磨時間的延長，蛋清蛋白的泡沫穩(wěn)定性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在處理40 min時達(dá)到最大值33.5 s，比對照組（球磨0 min）的8 s提高了近3 倍。根據(jù)上述分子分子結(jié)構(gòu)分析，其原因是球磨處理40 min時蛋白分子表現(xiàn)出更好的分子柔性，使更多的蛋白參與泡沫形成過程，增加了氣泡膜的厚度，有助于維持泡沫的形態(tài)而阻止其破裂或聚集。反之，過度球磨處理（60 min）致使蛋白泡沫穩(wěn)定性下降，根據(jù)以上對分子結(jié)構(gòu)的分析，這是過度球磨處理引起蛋白分子表面電位下降，分子膠束間排斥力降低，從而使泡沫容易發(fā)生聚集所致。

圖3 球磨時間對蛋清蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of ball-milling treatment time on foaming capacity and foam stability of egg white proteins

2.8 球磨處理對蛋清蛋白微觀結(jié)構(gòu)的影響

通過掃描電子顯微鏡觀察球磨前后蛋清蛋白微觀結(jié)構(gòu)的變化。如圖4所示，對照組的樣品呈現(xiàn)出海綿狀結(jié)構(gòu)，含有大量孔隙，這種多孔結(jié)構(gòu)是由冷凍干燥過程中冰晶升華形成的[31]。經(jīng)過球磨處理后，蛋白質(zhì)樣品坍縮成具有不規(guī)則、剛性結(jié)構(gòu)的粗顆粒，且隨著球磨時間的延長，碎片化和絮狀加劇。這是由于球磨中壓平、聚集和斷裂的作用縮小了蛋白質(zhì)之間的間隙[12]。

圖4 球磨處理0 min（A）、20 min（B）、40 min（C）和60 min（D）的蛋清蛋白掃描電子顯微鏡結(jié)果Fig.4 Scanning electron micrographs of egg white proteins subjected to ball-milling treatment for 0 (A), 20 (B), 40 (C) and 60 min (D)

3 結(jié) 論

球磨處理改變了蛋清蛋白結(jié)構(gòu)，其能夠降低蛋清蛋白表面疏水性，降低Zeta-電位絕對值，增大水解度及粒徑；此外，球磨處理改變了蛋清蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)，雖對蛋清起泡性無顯著影響，但對泡沫穩(wěn)定性有顯著影響。綜上，球磨處理具備綠色安全、無添加物、能耗低、操作簡便等優(yōu)勢。