柳燕飛，劉雯雯，郭蕾，張藝，高天旸

(廣東省第二人民醫(yī)院，廣東 廣州 510317)

子宮內(nèi)膜異位癥(EMT)是誘發(fā)不孕不育以及盆腔疾病等的常見病因，異位宮頸內(nèi)皮細(xì)胞具有多位置定植的特點(diǎn)，其中卵巢型EMT、深部浸潤(rùn)EMT以及腹膜型EMT的發(fā)生率最高，且危害性較大[1]。目前EMT仍缺乏有效的治療藥物，傳統(tǒng)的診斷主要采用影像學(xué)診斷及免疫組化技術(shù)，這些方法存在診斷時(shí)間長(zhǎng)、深部組織干擾大以及血清指標(biāo)(如癌胚抗原125)可變性大等缺陷[2]。隨著EMT研究的不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)可通過免疫因子、血管新生以及血清炎癥因子水平鑒別EMT，但對(duì)于不同異位部位EMT的鑒別仍缺乏可靠指標(biāo)[3]?；谏鲜鰡栴}，本研究選擇免疫組化聯(lián)合磁珠化學(xué)發(fā)光方法，對(duì)卵巢型EMT、深部浸潤(rùn)EMT以及腹膜型EMT實(shí)施生物學(xué)診斷研究。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年2月—2020年2月我院收治的90 例患有不同類型子宮內(nèi)膜異位癥患者為研究對(duì)象，經(jīng)B超及內(nèi)鏡檢測(cè)，依據(jù)患病部位不同將其分為卵巢子宮內(nèi)膜異位癥(A組，30 例)、深部子宮內(nèi)膜異位癥(B組，30 例)、腹壁切口子宮內(nèi)膜異位癥(C組，30 例)，所有患者術(shù)前1個(gè)月均無激素治療史。A組，年齡(32.3±4.16) 歲；按子宮內(nèi)膜異位癥分期標(biāo)準(zhǔn)(R-AFS)，Ⅱ期24 例，Ⅲ期6 例；病程(2.12±0.43) 周。B組，年齡(32.84±3.67) 歲；R-AFS分期Ⅱ期25 例，Ⅲ期5 例；病程(2.23±0.46) 周。C組，年齡(32.67±3.33) 歲；R-AFS分期Ⅱ期26 例，Ⅲ期4 例；病程(2.34±0.52) 周。三組患者在年齡、R-AFS分期占比及病程方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，有可比性。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)B超、內(nèi)鏡及手術(shù)切除檢測(cè)均符合《婦產(chǎn)科學(xué)》(第8版)關(guān)于子宮內(nèi)膜異位癥臨床判定標(biāo)準(zhǔn)；無其他宮頸并發(fā)癥(如宮頸肌瘤等)；無其他臟器如肝臟、心臟及腎臟等系統(tǒng)性疾??；經(jīng)R-AFS分期評(píng)估為Ⅱ期或Ⅲ期。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者有其他宮頸疾病并發(fā)癥或?qū)m頸惡性腫瘤等；患有精神障礙性疾病或溝通障礙性疾病；患者及家屬對(duì)治療不知情或未簽訂知情同意書；患者已絕經(jīng)或處于哺乳期。

1.3 檢測(cè)方法

所有患者在內(nèi)鏡及影像學(xué)診斷輔助下，行外科手術(shù)治療及異位子宮病灶組織采集，病灶面積為0.5～1 cm2，嚴(yán)格分離患部及周圍組織。采集分離病灶給予編號(hào)，并嚴(yán)格執(zhí)行我院鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法(SABC)進(jìn)行免疫組化染色，一抗分別為兔抗人CD4+CD25+Treg抗體、兔抗人Foxp3抗體(ab4728，Abcam)、血管緊張素Ⅱ受體-1(AT1R)(ab124505)及兔抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)抗體(ab42802，Abcam)，每例患者重新檢測(cè)一次，經(jīng)4 ℃過夜；二抗為Biotin標(biāo)記的羊抗兔抗體(A0277，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，封閉孵育后加入相同生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，37 ℃孵育30 min后加入SABC顯色劑(武漢博士德生物公司)，并于倒置顯微鏡下進(jìn)行顯色觀察，加入顯色劑10 min后，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)及去離子水洗，晾干加入Harris蘇木素核染10 s，之后水洗并封片?；颊呓邮苤委熎陂g同步進(jìn)行血清采集，用無抗凝劑的采樣器抽外周靜脈血5 mL，3 000 r/min離心10 min后，吸取上層血清分裝為兩管并做好標(biāo)記，一管置于-80 ℃冰箱保存，另一管進(jìn)行化學(xué)發(fā)光法免疫學(xué)檢測(cè)，測(cè)定項(xiàng)目包括雌二醇(E2)(安圖生物)、血清卵泡刺激素(FSH)(西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品上海分公司)、黃體生成素(LH)(安圖生物)及腹腔積液內(nèi)層粘連蛋白(LN)(天津博奧賽斯生物科技有限公司)。各種抗體的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)步驟均嚴(yán)格依照說明書執(zhí)行。

1.4 評(píng)價(jià)指標(biāo)

比較不同類型子宮內(nèi)膜異位癥患者的Foxp3，CD4+CD25+Treg，VEGF及AT1R陽性表達(dá)率。染色細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜呈棕黃色為陽性，陽性表達(dá)率=陽性例數(shù)/總例數(shù)×100%。比較不同類型子宮內(nèi)膜異位癥患者E2，F(xiàn)SH，LH及LN水平變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 不同類型子宮內(nèi)膜異位癥中Foxp3和CD4+CD25+Treg表達(dá)率比較

C組Foxp3及CD4+CD25+Treg陽性表達(dá)率顯著低于其余兩組(P<0.05)，其中A組的陽性率最高；C組AT1R的陽性表達(dá)率顯著高于其余兩組(P<0.05)；B組VEGF的陽性表達(dá)率顯著高于其余兩組(P<0.05)(見表1)。

表1 不同EMTs中Foxp3和CD4+CD25+Treg表達(dá)率比較 例(%)

2.2 不同類型子宮內(nèi)膜異位癥患者各項(xiàng)指標(biāo)比較

B組E2水平顯著高于其余兩組(P<0.05)；A組的FSH水平顯著低于其余兩組(P<0.05)，同時(shí)A組的LH水平顯著高于其余兩組(P<0.05)；C組的LN水平顯著低于其余兩組(P<0.05)，其中B組的LN水平最高(見表2)。

表2 不同類型子宮內(nèi)膜異位癥患者各項(xiàng)檢查指標(biāo)比較

3 討 論

子宮內(nèi)膜異位癥是子宮內(nèi)膜活體組織(如腺體細(xì)胞等)定植于宮頸外不同組織并浸潤(rùn)生長(zhǎng)誘發(fā)的一種疾病[4]。研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，機(jī)體對(duì)異位細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受是EMT發(fā)生的主要原因。章舒等[5]證實(shí)淋巴T細(xì)胞調(diào)節(jié)基因Foxp3啟動(dòng)了T調(diào)節(jié)細(xì)胞的免疫抑制，從而導(dǎo)致異位細(xì)胞無法被機(jī)體免疫清除而誘發(fā)異位生長(zhǎng)，除此之外，異位細(xì)胞生長(zhǎng)中新生血管的產(chǎn)生是異位生長(zhǎng)細(xì)胞營養(yǎng)供應(yīng)的主要來源。有研究[7]證實(shí)，除免疫耐受外，外科剖宮產(chǎn)手術(shù)容易誘發(fā)腹壁型EMT。鐘文萱等[7]采用免疫組化檢測(cè)腹壁異位子宮內(nèi)膜組織和正常子宮內(nèi)膜組織AT1R與血管緊張素Ⅱ受體-2(AT2R)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，與正常子宮內(nèi)膜組織相比，腹壁型EMT患者子宮內(nèi)膜組織的AT1R呈強(qiáng)陽性表達(dá)。目前主要采用化學(xué)發(fā)光技術(shù)及酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測(cè)血清VEGF，LN及E2等以監(jiān)測(cè)EMT的發(fā)病部位[8-9]。但是，因?yàn)檫@些標(biāo)記物在血清或腹腔積液中具有可變性，同時(shí)深部浸潤(rùn)型EMT的生物學(xué)檢測(cè)報(bào)道較少，因此仍需進(jìn)一步深入研究。本研究基于國內(nèi)外相關(guān)報(bào)道，從免疫調(diào)節(jié)及血管新生角度對(duì)不同生物分子在不同類型EMT中的表達(dá)進(jìn)行研究，結(jié)果顯示A組Foxp3及CD4+CD25+Treg的陽性表達(dá)率顯著高于其余兩組(P<0.05)，初步說明免疫抑制調(diào)節(jié)對(duì)卵巢型EMT的發(fā)生起重要作用。C組AT1R陽性率顯著高于其余兩組(P<0.05)，初步說明AT1R對(duì)腹壁型EMT的發(fā)生有重要作用。B組VEGF陽性率顯著高于其余兩組(P<0.05)，初步說明深部浸潤(rùn)型EMT患者的發(fā)生過程中VEGF起關(guān)鍵作用。子宮內(nèi)膜腺體細(xì)胞是分泌E2的重要細(xì)胞，因此E2水平監(jiān)測(cè)對(duì)深部浸潤(rùn)型EMT患者的鑒定具有重要輔助價(jià)值。本研究B組的E2水平顯著高于其余兩組(P<0.05)。A組的FSH水平顯著低于其余兩組(P<0.05)，同時(shí)A組的LH水平顯著高于其余兩組(P<0.05)，說明了卵巢型EMT患者由于異位細(xì)胞生長(zhǎng)，可抑制FSH的分泌，間接解決了黃體抑制排卵導(dǎo)致的不孕不育。C組的LN水平顯著低于其余兩組(P<0.05)，說明內(nèi)層腹腔積液粘連細(xì)胞在深部浸潤(rùn)型EMT中呈現(xiàn)高表達(dá)。

綜上所述，在目前缺乏特定性生物標(biāo)記分子的條件下，可通過多項(xiàng)技術(shù)的聯(lián)合對(duì)不同類型子宮內(nèi)膜異位癥進(jìn)行鑒別，同時(shí)聯(lián)合檢測(cè)Foxp3，CD4+CD25+Treg，LH，E2，LN，F(xiàn)SH及AT1R，可有效鑒別不同類型EMT。