馮亞嵐， 李玥珂， 任 陽， 唐麗萍， 黃 榮， 袁 磊， 楊 健*

(1.川北醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南充 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 感染科，江蘇 南充 637000)

包膜(envelope, E)蛋白是成熟黃病毒結(jié)構(gòu)中唯一的糖蛋白，對病毒毒力起著重要調(diào)控作用[1]。大量文獻(xiàn)報道E蛋白突變能夠減弱黃病毒的神經(jīng)毒力[2-3]。與登革病毒、乙腦病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)一樣，寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)隸屬于黃病毒科黃病毒屬[4]。自1947年由烏干達(dá)寨卡森林發(fā)現(xiàn)以來[5]，ZIKV引起多次爆發(fā)流行，世界衛(wèi)生組織已將其列入危害人類健康的主要病原體之一[6]。目前由于ZIKV感染仍無有效治療方法，使得疫苗研發(fā)迫在眉睫。本課題組從事嵌合病毒疫苗的研究，前期研究發(fā)現(xiàn)，嵌合病毒JEV/ZIKV(MR766)具有較強(qiáng)的小鼠腦內(nèi)神經(jīng)毒力，而JEV/ZIKV(PRVABC59)對小鼠無明顯腦內(nèi)神經(jīng)毒力，結(jié)合Li等[7]的研究，推測是MR766中E蛋白的氨基酸突變所致。通過與弱毒株氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，E蛋白中存在多個氨基酸突變，其中T120A突變是其第一位氨基酸突變[8]，并且位于E蛋白結(jié)構(gòu)域II(EDII)，該區(qū)已被證實(shí)對病毒的復(fù)制有重要意義[9]，由此推測E120很可能是影響病毒毒力的重要位點(diǎn)。本研究以嵌合病毒JEV/ZIKV為骨架構(gòu)建其突變病毒JEV/ZIKV (T120A)，探索 E120位點(diǎn)突變對嵌合病毒小鼠腦內(nèi)神經(jīng)毒力的影響，為嵌合病毒的進(jìn)一步減毒以及寨卡病毒的減毒機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株、細(xì)胞、病毒及實(shí)驗(yàn)動物 質(zhì)粒pACNR-JEV-5′(含有乙腦疫苗株nt 1～3 450序列)、質(zhì)粒pACNR-JEV-3′(含有乙腦疫苗株nt3 445～10 977序列)、pACNR-JEV/ZIKV-5′(乙腦疫苗株prM/E編碼序列被寨卡病毒相應(yīng)部位序列取代)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；大腸埃希菌感受態(tài)TOP10、BHK21均為本室保存；乙腦/寨卡嵌合病毒JEV/ZIKV由本實(shí)驗(yàn)室拯救保存；清潔級昆明小鼠由川北醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2 主要試劑 引物由上海生工合成，F(xiàn)2：5′-GCTTGGCAGTTGTCATAG-3′； R3：5′-AGATCTGA-

CTCCGCACACGCCTT-3′； E120F：5′-TGCCAAGTT-

1.2 方法

1.2.1 重疊延伸PCR擴(kuò)增含T120A突變的prM/E片段 以質(zhì)粒pACNR-JEV/ZIKV-5′為模板(含JEV/ZIKV-5′基因片段(nt 1～3 450))，用引物F2和E120R、E120F和R3分別配對擴(kuò)增5′和3′片段。擴(kuò)增條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 3 min，共25循環(huán)；72 ℃ 5 min。膠回收擴(kuò)增片段，各取1 μL等量混合作為模板，進(jìn)行重疊延伸，擴(kuò)增條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 3 min，共10循環(huán)；加入引物F2和R3繼續(xù)擴(kuò)增目的片段。擴(kuò)增條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 3 min，共25循環(huán)；72 ℃ 5 min。膠回收擴(kuò)增的DNA片段。PCR擴(kuò)增流程見圖1。

圖1 重疊延伸PCR擴(kuò)增含T120A突變DNA片段示意圖Fig.1 Construction flow chart of T120A mutated DNA fragments by overlapping PCR

1.2.2 JEV/ZIKV (T120A)感染性克隆的構(gòu)建 以含T120A突變的ZIKV prM/E片段替換pACNR-JEV-5′ (nt 1～3 450)中相應(yīng)區(qū)域，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步連接JEV-3′ (nt 3 445～10 977)片段，得到突變病毒全長的cDNA質(zhì)粒pACNR-JEV/ZIKV (T120A)(圖2)。

圖2 含E120 突變的JEV/ZIKV(T120A)感染性克隆的構(gòu)建Fig.2 Construction flow chart of infection clone of JEV/ZIKV (T120A) virus

1.2.3 突變病毒cDNA質(zhì)粒的酶切鑒定 分別用BspEI和XhoI、BamHI和HindIII雙酶切，HindIII單酶切JEV/ZIKV(T120A)突變病毒全長cDNA質(zhì)粒，37 ℃ 水浴2 h，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4 突變病毒的拯救及傳代 用XhoI酶切處理質(zhì)粒pACNR-JEV/ZIKV (T120A)，酶切完全后加入綠豆核酸酶30 ℃作用30 min，再加入終濃度0.01%的SDS滅活該酶，用PCR試劑盒回收。以線性化的JEV/ZIKV (T120A)為模板，按體外轉(zhuǎn)錄試劑盒操作制備RNA，加入DNA酶反應(yīng)20 min后，回收純化的RNA，電轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，接種于T25培養(yǎng)瓶，37 ℃ 5% CO2孵箱培養(yǎng)5～6 d，反復(fù)凍融3次，收集上清，離心，分裝，標(biāo)記為P1代病毒，-80 ℃保存。取P1代病毒接種單層BHK21細(xì)胞，吸附1 h，換2%維持液，于37 ℃ 5% CO2孵箱培養(yǎng)，直至40%細(xì)胞出現(xiàn)病變，再次收集上清，分裝，-80 ℃保存。

1.2.5 病毒的測序鑒定 用RNA回收試劑盒提取突變病毒基因組RNA，再按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作，制備cDNA，運(yùn)用引物F2和R3配對進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 3 min，共30 循環(huán)；72 ℃ 10 min。膠回收擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，送至大連寶生物公司測序。

1.2.6 病毒蝕斑試驗(yàn) 首先，接種BHK21細(xì)胞于六孔板內(nèi)，待每孔細(xì)胞融合達(dá)80%時，再接種病毒37 ℃ 吸附1 h。接著用2% BSA和終濃度為10 g/L的低熔點(diǎn)瓊脂糖覆蓋各孔，37 ℃ 5% CO2恒溫孵箱中放置5 d。最后，用4%甲醛固定30 min，10 g/L的結(jié)晶紫染色15 min，水沖洗，晾干后計(jì)數(shù)并比較蝕斑的大小。

1.2.7 突變病毒生長曲線繪制 按感染復(fù)數(shù)M.O.I=0.01接種突變病毒，每隔1 d收取200 μL上清液，-80 ℃凍存直至細(xì)胞全部病變。收集的上清通過蝕斑實(shí)驗(yàn)計(jì)算相應(yīng)病毒滴度。重復(fù)上述試驗(yàn)2次，繪制病毒生長曲線。同時，設(shè)嵌合病毒JEV/ZIKV為對照。

1.2.8 神經(jīng)毒力LD50檢測 取病毒JEV/ZIKV(T120A)(6.5×105pfu/mL)、JEV/ZIKV(0.95×106pfu/mL)分別腦內(nèi)注射3周齡(12～14 g)清潔級昆明小鼠，試驗(yàn)分5組，每組6只，每只腦內(nèi)接種10倍系列稀釋病毒液0.03 mL。觀察14 d，記錄小鼠死亡數(shù)量，Reed-Muench法計(jì)算病毒LD50，并繪制生存曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 重疊延伸PCR擴(kuò)增含E120 突變的prM/E片段

以質(zhì)粒pACNR-JEV/ZIKV-5′為模板(含JEV/ZIKV-5′基因片段nt 1～3 450)，用引物F2和120R配對擴(kuò)增含E120突變的prM/E片段，擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為900 bp，引物120F和R3配對擴(kuò)增產(chǎn)物約為1 300 bp，以重疊延伸產(chǎn)物為模板，用引物F2和R3配對擴(kuò)增產(chǎn)物約2 200 bp(圖3A)，與理論值相吻合。

2.2 pACNR-JEV/ZIKV (T120A)-5′質(zhì)粒的酶切鑒定

將pACNR-JEV/ZIKV (T120A)-5′質(zhì)粒分別進(jìn)行AscI+KasI、KasI+BglII、BglII+BspEI雙酶切，均獲得與理論值大小相符的2條片段(圖3B)。

2.3 pACNR-JEV/ZIKV(T120A)全長質(zhì)粒的酶切鑒定

質(zhì)粒pACNR-JEV/ZIKV(T120A)經(jīng)BamHI單酶切，獲得片段大小約13.6 kb，BspEI+XhoI雙酶切，獲得片段大小約7.5和6.1 kb，HindIII單酶切，獲得片段大小約6.0、3.3、2.0、1.4、0.6、0.3 kb，與理論值相符(圖3C)。

圖3 pACNR-JEV/ZIKV(T120A)酶切鑒定Fig.3 Restriction endonuclease analysis of pACNR-JEV/ZIKV(T120A)A～C：含E120 突變的JEV/ZIKV(T120A)感染性克隆的構(gòu)建及鑒定。A：含E120突變prM/E重疊延伸PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；B：pACNR-JEV/ZIKV(T120A)-5′酶切鑒定；C：pACNR-JEV/ZIKV(T120A)全長酶切鑒定；M1：DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)(1.5 kb)；1：引物F2和E120R配對擴(kuò)增產(chǎn)物(900 bp)；2：引物E120F和R3配對擴(kuò)增產(chǎn)物(1 300 bp)；3：引物F2和R3配對擴(kuò)增產(chǎn)物(2 200 bp)；4：pACNR-JEV/ZIKV(T120A)-5′重組質(zhì)粒(6 000 bp)；5：pACNR-JEV/ZIKV(T120A)-5′AscI、KasI雙酶切產(chǎn)物；6：pACNR-JEV(T120A)-5′ KasI、BglII雙酶切產(chǎn)物；7：pACNR-JEV/ZIKV(T120A)-5′BglII、BspEI雙酶切產(chǎn)物；M2：DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn) (2 kb)；8：pACNR-JEV/ZIKV(T120A) BamHI單酶切產(chǎn)物；9：pACNR-JEV/ZIKV(T120A) BspEI、XhoI雙酶切產(chǎn)物；10：pACNR-JEV/ZIKV(T120A)重組質(zhì)粒(13 600 bp)；11：pACNR-JEV/ZIKV(T120A) HindIII單酶切產(chǎn)物Construction and restriction endonuclease analysis of the infectious clone of JEV/ZIKV(T120A)containing full-length cDNA of mutant virus(A-C). A：Amplification products by overlapping PCR; B：Restriction endonuclease analysis of pACNR-JEV/ZIKV(T120A)-5′; C：Restriction endonuclease analysis of pACNR-JEV/ZIKV(T120A)；M1: DNA Marker (1.5 kb); 1: Amplification products of primer F2 and E120R(900 bp); 2: Amplification products of primer E120F and R3(1 300 bp); 3: Amplification products of primer F2 and R3(2 200 bp); 4: pACNR-JEV/ZIKV(T120A)-5′ recombinant plasmid(6 000 bp); 5: pACNR-JEV/ZIKV(T120A)-5′ AscI and KasI double digestion products; 6: pACNR-JEV/ZIKV(T120A)-5′ KasI and BglII double digestion products; 7: pACNR-JEV/ZIKV(T120A)-5′ BglII and BspEI double digestion products; M2: DNA Marker (2 kb); 8: pACNR-JEV/ZIKV(T120A) BamHI single digestion products; 9: pACNR-JEV/ZIKV(T120A) BspEI and XhoⅠ double digestion products; 10: pACNR-JEV/ZIKV(T120A) recombinant plasmid(13 600 bp); 11: pACNR-JEV/ZIKV(T120A) HindIII single digestion products

2.4 病毒測序鑒定

E蛋白編碼序列經(jīng)PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物測序后與GenBank發(fā)布的ZIKV(登錄號：AY632535.20)和SA14-14-2(登錄號：AF315119.1)比對，除在1 368位堿基處人為引入的突變A→G外，其余各處均無堿基突變或缺失。

2.5 病毒蝕斑比較

分別取病毒JEV/ZIKV(T120A)和JEV/ZIKV感染BHK21細(xì)胞進(jìn)行蝕斑試驗(yàn)，結(jié)果見圖4A。JEV/ZIKV(T120A)的蝕斑直徑與JEV/ZIKV相似(1～1.5 mm)。

2.6 病毒的生長曲線

用M.O.I=0.01感染BHK21細(xì)胞，繪制病毒增殖曲線。JEV/ZIKV (T120A)在4 d內(nèi)生長較快，病毒滴度于第5天達(dá)高峰(5.59 log10pfu/mL)，隨后緩慢下降；而病毒JEV/ZIKV在第6天達(dá)生長高峰，滴度為6.8 log10pfu/mL(見圖4B)。在整個實(shí)驗(yàn)的前7 d，突變病毒JEV/ZIKV(T120A)的滴度均明顯低于JEV/ZIKV。

圖4 拯救病毒生長特性Fig.4 Proliferation properties of the rescued virusesA、B：細(xì)胞檢測病毒的增殖特性。A：病毒蝕斑形成實(shí)驗(yàn)；B：拯救病毒生長曲線Cells to detect viral proliferation characteristics(A，B). A： Comparison to plaque sizes of the rescued viruses; B： Growth curves of the rescued viruses

2.7 病毒的腦內(nèi)神經(jīng)毒力

病毒毒力測定結(jié)果見表1。病毒JEV/ZIKV (T120A)的神經(jīng)毒力LD50為1.38 PFU(0.03 mL)；JEV/ZIKV神經(jīng)毒力LD50為2.21 PFU(0.03 mL)，小鼠生存曲線見圖5。

圖5 小鼠生存曲線Fig.5 Survival curves of the Kunming mice

表1 突變病毒對小鼠腦內(nèi)神經(jīng)毒力(LD50)

3 討 論

寨卡病毒(ZIKV)感染以往多為自限性，但最近幾年報道的死亡病例數(shù)逐漸增多，且病毒可通過垂直傳播對胎兒造成嚴(yán)重影響[10]，同時傳播途徑也由最初的蚊媒傳播擴(kuò)展到血液、胎盤、性傳播等方式[11]，這給疾病的預(yù)防和控制帶來重大挑戰(zhàn)。疫苗接種是預(yù)防病毒性傳染病的有效途徑，E蛋白是ZIKV主要的黏附蛋白，也是重要的保護(hù)性抗原，因此是病毒致病機(jī)制以及疫苗研究的重要靶點(diǎn)[12-13]。本課題組以JEV SA14-14-2為骨架，分別用兩株寨卡病毒(非洲株MR766和亞洲株P(guān)RVABC59)的前膜(prM)/E蛋白序列替換其相應(yīng)區(qū)域，構(gòu)建得到兩株嵌合病毒。前期研究證實(shí)，JEV/ZIKV(MR766)對小鼠有較強(qiáng)的腦內(nèi)神經(jīng)

毒力[14]，而JEV/ZIKV(PRVABC59)對小鼠、3日齡乳鼠皆無明顯腦內(nèi)神經(jīng)毒力。Li等[7]同樣以JEV SA14-14-2為骨架，用ZIKV FSS13025株的prM/E替換乙腦prM/E基因序列，得到的嵌合病毒也對乳鼠和小鼠基本無腦內(nèi)神經(jīng)毒力。疫苗的安全性是減毒活疫苗首要考慮的因素，三株嵌合病毒對小鼠腦內(nèi)神經(jīng)毒力的巨大差異促使做進(jìn)一步探索。通過對比分析寨卡病毒非洲株和亞洲株序列發(fā)現(xiàn)，在E蛋白區(qū)存在有多個氨基酸改變[8]，但在EDII區(qū)僅有E120位點(diǎn)的突變，又因EDII在控制病毒蛋白的復(fù)制和穩(wěn)定方面起著重要作用[9]，由此推測T120A的突變極有可能影響病毒的毒力。

本研究運(yùn)用重疊延伸PCR技術(shù)擴(kuò)增得到含T120A突變的ZIKV PrM/E DNA片段，采用雙質(zhì)粒系統(tǒng)獲得病毒JEV/ZIKV (T120A)全長cDNA，經(jīng)酶切鑒定表明突變株基因全長克隆成功構(gòu)建，且通過病毒拯救獲得突變病毒?；謴?fù)病毒經(jīng)測序表明，除引入了T120A突變位點(diǎn)外，E蛋白其他區(qū)域未發(fā)現(xiàn)有意外突變，與先前的報道[15]相結(jié)合，證明該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)為實(shí)現(xiàn)病毒定點(diǎn)突變、研究寨卡毒力機(jī)制搭建了可行的技術(shù)平臺。

生長曲線結(jié)果顯示突變病毒峰值滴度(5.59 log10pfu/mL)低于JEV/ZIKV(6.8 log10pfu/mL)，說明突變株病毒復(fù)制能力減弱。但分析蝕斑試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變病毒與JEV/ZIKV有大小相似的蝕斑直徑。一般情況下，蝕斑大小主要由病毒的增殖能力和病毒對抗宿主細(xì)胞干擾素應(yīng)答能力來決定，即病毒增殖能力減弱，蝕斑會變小，病毒對抗干擾素能力低，也會呈現(xiàn)小蝕斑[16]。通過進(jìn)一步探索突變病毒小鼠腦內(nèi)神經(jīng)毒力，發(fā)現(xiàn)突變體的神經(jīng)毒力LD50(1.38 PFU)略小于JEV/ZIKV(2.21 PFU)，說明突變病毒神經(jīng)毒力略微增強(qiáng)。結(jié)合病毒增殖能力、蝕斑大小以及小鼠腦內(nèi)神經(jīng)毒力推測，突變病毒可能具有較強(qiáng)的對抗干擾素的能力。因此，即使增殖能力降低，病毒仍表現(xiàn)出較強(qiáng)的小鼠腦內(nèi)神經(jīng)毒力，但還需實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。最近，Carbaugh等[3]研究發(fā)現(xiàn)，ZIKV中E154位點(diǎn)發(fā)生糖基化，可使病毒在小鼠腦內(nèi)的神經(jīng)毒力增強(qiáng)，同樣，Li等[17]研究發(fā)現(xiàn)，prM中一些位點(diǎn)氨基酸突變也會顯著改變病毒的毒力。Xie等[2]研究發(fā)現(xiàn)，突變株T351V的神經(jīng)侵襲力減弱。上述結(jié)果說明，無論是ZIKV還是乙腦/寨卡嵌合病毒，ZIKV的E蛋白區(qū)氨基酸位點(diǎn)對病毒的毒力有著較大影響，值得進(jìn)一步深入研究，從而為減毒活疫苗的研發(fā)以及質(zhì)量鑒定提供參考。同時，也提示在構(gòu)建嵌合病毒時，減毒株保護(hù)性抗原編碼序列應(yīng)是首要考慮的嵌入序列。