徐晗 閆晗 褚晉 繆建錕 楊皓 白元俊 董海

摘要 ：為明確采自遼寧省12個稻區(qū)稻曲病菌Ustilaginoidea virens的生物學特性、群體遺傳多樣性與地理區(qū)域的關系。本研究采用生物學方法測定稻曲病菌菌株的生長速率和產孢能力，并采用SPSS 20.0分析軟件對稻曲病菌菌株的菌絲生長速率和產孢能力進行相關性分析。提取稻曲病菌基因組DNA，采用特異性引物US、交配型引物MAT、遺傳多樣性引物ERIC對其進行PCR擴增，通過聚類分析進行群體遺傳多樣性研究。結果顯示：157個稻曲病菌菌株的菌絲生長速率與產孢能力相關系數為0.19。采用稻曲病菌特異性引物US進行擴增，157個菌株均為稻曲病菌株;采用交配型引物MAT進行擴增，53個菌株為MATⅠ型，104個菌株為MATⅡ型。采用ERIC引物可擴增出2～7條不等的條帶，157個稻曲病菌株被劃分為10個基因類群，其中第1類群為優(yōu)勢類型，有44個菌株，占總數的28.0%;第2類群有20個菌株，占總數的12.7%;第3類群1個菌株，占總數的0.6%;第4類群1個菌株，占總數的0.6%;第5類群有21個菌株，占總數的13.4%;第6類群有17個菌株，占總數的10.8%;第7類群有2個菌株，占總數的1.2%;第8類群有5個菌株，占總數的3.2%;第9類群有30個菌株，占總數的19.1%;第10類群有16個菌株，占總數的10.2%。來自遼寧省12個稻區(qū)的157個稻曲病菌株菌絲生長速率與菌株產孢量之間沒有相關性，產孢量與地域之間有相關性?；贓RIC-PCR擴增的稻曲病菌株基因組DNA指紋圖譜的多態(tài)性進行劃分的基因類群與地理區(qū)域之間有相關性，基因類群與生物學特性之間沒有相關性。

關鍵詞 ：稻曲病菌; 遼寧稻區(qū); 生物學特性; 群體遺傳多樣性

中圖分類號：

S 435.111

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020126

Biological characteristics and genetic diversity of Ustilaginoidea virens

from rice regions in Liaoning province

XU Han， YAN Han， CHU Jin， MIAO Jiankun， YANG Hao， BAI Yuanjun， DONG Hai*

（Liaoning Academy of Agricultural Sciences， Shenyang 110161， China）

Abstract

The object of this study is to reveal the relationship among geographical regions， biological characteristics and genetic diversity of Ustilaginoidea virens from 12 regions in Liaoning province. Sporulation and growth rate of these strains were determined， and relativity was analyzed by using the software SPSS 20.0. DNA was extracted from the strains， the genomic fingerprint profiles were generated by specific primers US， mating type primers MAT， genetic diversity primers ERIC， respectively. Their genetic diversities were further investigated by using clustering analysis. The correlation coefficient of growth rate of these strains and sporulation was 0.19. The genomic fingerprint profiles of 157 strains were generated by specific primers US， and all these strains were false smut rice strains. Genome-wide DNA amplification by mating type primers MAT showed that 53 strains were MATⅠtype and 104 strains were MATⅡtype. two to seven polymorphic bands of each examined isolate could be detected by ERIC-PCR analysis. Ten clusters were grouped based on cluster analysis. The predominant group was the first group， including 44 strains （28.0%）. The second group had 20 strains （12.7%）. Only one strains was found in the third group （0.6%） or the fourth group （0.6%）. The fifth to tenth group included 21 strains （13.4%）， 17 strains （10.8%）， 2 strains （1.2%）， 5 strains （3.2%）， 30 strains （19.1%） and 16 strains （10.2%）， respectively. As for 157 U.virens strains from 12 regions in Liaoning province， there were no relativity between the growth rate and sporulation， but significant relationship between sporulation and geographical regions. Analysis based on DNA fingerprinting of U.virens strains reveal that there was significant correlation between ERIC groups and geographical regions， and no correlation between ERIC group and biological characteristics.

Key words

Ustilaginoidea virens; rice region in Liaoning province; biological property; genetic diversity

水稻稻曲病是由稻曲病菌Ustilaginoidea virens （Cooke） Tak.侵染引起的水稻真菌病害，在世界各水稻產區(qū)均有發(fā)生[14]。稻曲病的發(fā)生會造成稻穗空秕率增加，水稻產量下降;同時，稻曲球含有的稻曲菌毒素可以引起人畜中毒[57]。近年來，由于栽培制度的改變和高產感病品種的推廣，使稻曲病的發(fā)生逐年加重[89]。遼寧省地跨近5個緯度（38°43′N-43°26′N），由南向北550 km均有水稻種植。在水稻種植區(qū)域內，地形條件復雜，山地、丘陵、平原一應俱全，從而形成了復雜多樣的氣候條件。各稻區(qū)種植的水稻品種不盡相同，例如東港稻區(qū)種植的水稻品種生育期平均165 d，而岫巖稻區(qū)種植的水稻品種生育期僅為130 d左右。各稻區(qū)水稻種植品種的不同為稻曲病菌的研究提供了很好的基礎。

稻曲病在遼寧省各稻區(qū)均有發(fā)生，其病原菌種群的分布和變異可為該病害防治提供重要信息。潘雅姣等利用AFLP標記對北京昌平地區(qū)菌株進行多樣性分析，結果顯示同一田塊菌株的相似性達072，來自同一小區(qū)菌株能聚到同一亞類[10]。周永力等利用RAPD標記對不同省份稻曲病菌進行多樣性分析，結果顯示寄主對稻曲病菌群體的基因型無顯著影響，不同年份采集的菌株遺傳多樣性不存在顯著差異[11]。近年來，隨著新型分子標記的出現，稻曲病菌的群體遺傳多樣性及遺傳結構的研究取得了新的進展。李競生利用ERIC標記分析了四川省60個菌株的遺傳結構，發(fā)現稻曲病菌在一定的空間范圍內存在遺傳變異，但遺傳變異程度不大[12]。王文斌等對中國10個水稻生產省份111個稻曲病菌菌株分析顯示，稻曲病菌基因類群與地理區(qū)域之間有一定的相關性;并且來自遼寧省的菌株形成了本地區(qū)特有的生物學特性和群體遺傳多樣性，與其他省份菌株之間有較大差異[13]。

遼寧省各水稻產區(qū)生態(tài)環(huán)境和氣候條件有一定的差異，稻曲病菌生物學特性、遺傳結構是否各有特點，是否與所在的地理區(qū)域有相關性等的研究還鮮有報道。

本文對2017年-2018年在遼寧省12個稻區(qū)采集并分離純化的稻曲病菌菌株的生物學特性，以及各菌株基因組的ERIC遺傳多態(tài)性進行分析，探明了遼寧稻區(qū)稻曲病菌菌株的生物學特性、群體遺傳多樣性與所在地理區(qū)域的關系，為抗稻曲病品種的推廣和稻曲病的綜合防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 稻曲病標樣

2017年-2018年在遼寧省蘇家屯（SJT）、東港市（DG）、燈塔市（DT）、盤錦市（PS）、沈北新區(qū)（SB）、本溪市（HR）、撫順市（FS）、鞍山市（AS）、寬甸縣（KD）、鳳城市（FC）、大石橋市（DSQ）和開原市（KY）12個稻區(qū)采集當地自然發(fā)病的稻曲病標樣。

1.1.2 培養(yǎng)基成分

PSA：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂18 g，加水至1 L。

PS：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g，加水至1 L。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株分離

參照新鮮稻曲病菌分離方法[14]，從12個稻區(qū)采集的稻曲球中分離純化獲得單孢菌株。

1.2.2 菌絲生長速率測定

用直徑為6 mm的打孔器從PSA培養(yǎng)基上生長的單孢菌落邊緣打取菌餅，將其放入PSA培養(yǎng)基平板（90 mm）中央，28℃下培養(yǎng)，3次重復。在第20天用十字交叉法測量菌落直徑，并記錄菌落背面的色澤。顏色分類標準參照李燕等[15]的方法。參考王文斌等[13]的分類標準，將菌株分為2種生長速率類型：生長速率慢（<2 mm/d）、生長速率快（≥2 mm/d）。

1.2.3 產孢能力測定

選取稻曲病菌2代菌株，在菌落邊緣用直徑6 mm的打孔器打取8個菌餅移至含有150 mL PS的三角瓶中，27℃、130 r/min振蕩培養(yǎng)6 d，充分搖勻后用血球計數板計數孢子數。將菌株分為2種產孢類型：產孢量少（<106個/mL）、產孢量多（≥106個/mL）。

1.2.4 菌株生物學特性數據處理

采用SPSS 20.0分析軟件，計算菌株產孢能力與生長速率的相關系數，并根據相關系數分析相關程度：R<0負相關，R=0無線性相關，|R|>0.95顯著相關;|R|>0.8高度相關;0.5≤|R|<0.8中度相關;0.3≤|R|<0.5低度相關;|R|<0.3關系極弱，認為不相關。

1.2.5 PCR擴增反應

試驗引物合成由上海生工生物工程有限公司完成，所用引物見表1。

采用天根生物公司的基因組DNA提取試劑盒提取供試菌株DNA。檢測DNA樣品純度，并保存于-20℃。PCR反應體系為25 μL，其中Mix 12.5 μL，每個引物1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。US及MAT引物的擴增程序：94℃ 10 min;94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，循環(huán)30次;72℃延伸10 min。ERIC引物的擴增程序：95℃ 7 min;90℃ 30 s，52℃ 1 min，65℃ 8 min，循環(huán)35次;65℃延伸10 min[1620]。

1.2.6 擴增產物檢測及數據處理

擴增結束后，取5 μL擴增產物用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。電泳圖譜中的每一條條帶均作為1個分子標記，擴增片段的出現與否分別賦值“1”和“0”，制成0-1表用于數據處理。利用ape程序包進行數據處理，以鄰接法（neighbor-joining method）得到聚類圖。

2 結果與分析

2.1 水稻稻曲病菌生物學特性及其相關分析

本研究共分離得到157株稻曲病菌菌株，其中來自遼寧省蘇家屯（SJT）10株、東港市（DG）51株、燈塔市（DT）10株、盤錦市（PS）22株、沈北新區(qū)（SB）9株、本溪市（HR）5株、撫順市（FS）12株、鞍山市（AS）10株、寬甸縣（KD）7株、鳳城市（FC）10株、大石橋市（DSQ）7株和開原市（KY）4株。各菌株生長速率及產孢量等生物學特性見表2。

供試菌株在PSA培養(yǎng)基上的菌落直徑、菌落形態(tài)和菌落背面的顏色有差異（圖1）。DG-25菌株的菌落生長速度為（2.15±0.18）mm/d，氣生菌絲較疏松，菌落邊緣規(guī)則，背面呈白色;DT-9菌株的菌落生長速度為（2.25±0.09） mm/d，菌絲較致密，邊緣規(guī)則，背面呈黃綠色;DSQ-2菌株的菌落生長速度為（2.11±0.04）mm/d，菌絲較疏松，邊緣規(guī)則，背面呈綠色;DT-2菌株的菌落生長速度為（183±012）mm/d，菌絲較致密，邊緣不規(guī)則，背面呈墨綠色。試驗結果表明，稻曲病菌的生長速率在相同的培養(yǎng)條件下穩(wěn)定，3次重復培養(yǎng)的菌落背面色澤一致。157個菌株中5個白色菌株，菌落平均生長速率為（2.21±0.12）mm/d;56個黃綠色菌株，菌落平均生長速率為（2.19±0.09）mm/d;80個綠色菌株，菌落平均生長速率為（2.08±0.12）mm/d;16個墨綠色菌株，菌落平均生長速率為（1.86±012）mm/d。所有菌株中以菌落背面顏色呈黃綠色和綠色的居多，一般而言，菌落背面呈白色的，菌落生長較快;菌落背面呈墨綠色的，菌落生長較慢。菌株具體信息見表2。

各稻區(qū)菌株的生物學特性見表3?？梢钥闯?，全部12個稻區(qū)均包含生長速率慢或快的菌株和產孢量少或多的菌株。將各個稻區(qū)菌株的生長速率以及產孢量計算出平均值并作圖（圖2）。由圖2可以看出，各地菌株生長速率相差不大，但是產孢量相差較大。由此可見，稻曲病菌菌株生長速率與地域相關性較小，產孢量與地域有相關性。用SPSS 20.0分析軟件，對157個菌株的生長速率與產孢量進行分析，二者之間的相關系數R=0.19，表明所分析的數據不具有統(tǒng)計學意義，說明稻曲病菌菌株生長速率與菌株產孢量之間沒有相關性。

2.2 稻曲病菌分子指紋圖譜及其分析

采用稻曲病菌特異性引物對供試157株菌株進行檢測，所有菌株有且僅有一條目標擴增片段，無任何雜帶產生，其擴增出的特異性片段長度為380 bp（圖3），所有菌株均為稻曲病菌。

采用MAT兩對引物對供試菌株進行PCR擴增，試驗結果見表2，MATⅠ擴增片段長度為233 bp， MATⅡ擴增片段長度為371 bp。一個菌株若能用MATⅠ擴增出條帶，則不能用MATⅡ擴增出條帶;同理，若不能用MATⅠ擴增出條帶，則能用MATⅡ擴增出條帶。由此可見，稻曲病菌每個菌株僅為一種交配型（圖4）。157個菌株中有53個菌株為MATⅠ型，104個菌株為MATⅡ型，MATⅠ型與MATⅡ型出現比例約為1∶2。

根據ERIC-PCR擴增的DNA指紋圖譜的多態(tài)性（圖5），對157個菌株進行聚類（圖6）。依據聚類分析圖，157個稻曲病菌菌株被分為10個基因類群（表4）。第1類群包含來自10個稻區(qū)的44個菌株，占被測菌株總數的28.0%;第2類群來自6個稻區(qū)，共有20個菌株，占被測菌株總數的12.7%;第3類群

只有東港1個菌株，占被測菌株總數的0.6%;第4類群只有沈北新區(qū)1個菌株，占被測菌株總數的0.6%;第5類群來自7個稻區(qū)，共有21個菌株，占被測菌株總數的13.4%;第6類群來自2個稻區(qū)，共有17個菌株，占被測菌株總數的10.8%;第7類群來自鞍山2個菌株，占被測菌株總數的1.2%;第8類群來自3個稻區(qū)，共有菌株5株，占被測菌株總數的3.2%;第9類群來自2個稻區(qū)，共有菌株30個，占被測菌株總數的19.1%;第10類群來自5個稻區(qū)，共有菌株16個，占被測菌株總數的10.2%。聚類分析結果表明，基于ERIC-PCR擴增的稻曲病菌基因組DNA指紋圖譜多態(tài)性劃分的基因類群與菌株采集稻區(qū)區(qū)域有一定的相關性。來自蘇家屯（SJT）、燈塔（DT）、本溪（HR）、撫順（FS）、鳳城（FC）、大石橋（DSQ）和開原（KY）的菌株都聚在兩個類群中，說明這些地區(qū)的稻曲病菌菌株遺傳物質有較高的同源性，基因結構相似性大;來自東港（DG）和盤錦（PS）的稻曲病菌菌株分別分在7個和6個類群中，說明這些稻區(qū)的稻曲病菌菌株遺傳物質有較大的差異。

比較稻曲病菌菌株的基因類群和生長速率、產孢量、交配型之間的關系，由表5可以看出，在7個基因類群里都包含生長速率慢或快、產孢量少或多、交配型Ⅰ或Ⅱ菌株;由此可見，稻曲病菌菌株的基因類群與生物學特性之間沒有相關性。

3 結論與討論

本研究對2017年-2018年遼寧省12個稻區(qū)的157個稻曲病菌菌株進行了生物學特性測定。試驗結果表明，各地采集分離的稻曲病菌菌絲生長速率相差不大，產孢量與地區(qū)有一定相關性，菌絲生長速率與產孢量沒有相關性。菌絲生長速率與菌株產生色素有一定關系，試驗發(fā)現白色菌絲菌株普遍生長速率較快，深綠色菌絲菌株生長速率最慢。通過前期試驗發(fā)現，隨著繼代培養(yǎng)代數的增加，菌株生長速率會加快，產孢能力降低，這與賈切[21]的報道是一致的。因此本研究采用相同繼代培養(yǎng)代數的菌株，排除了不同繼代培養(yǎng)代數對生長速率、產孢量的影響。

ERIC-PCR是Rep-PCR技術中的一種，目前廣泛應用于植物病原菌分類、檢測及病原物群體遺傳多樣性分析。Rep-PCR是基于基因組重復序列的一類分析DNA指紋圖譜的技術，操作簡便，重復性好[22]。本試驗結果表明，基于ERIC-PCR擴增的稻曲病菌基因組DNA指紋圖譜多態(tài)性劃分的基因類群與菌株采集稻區(qū)區(qū)域有一定的相關性。來自蘇家屯（SJT）、燈塔（DT）、本溪（HR）、撫順（FS）、鳳城（FC）、大石橋（DSQ）和開原（KY）的菌株都聚在兩個類群中，說明這些地區(qū)的稻曲病菌菌株有較高的同源性，基因結構相似性大;來自東港（DG）和盤錦（PS）的稻曲病菌菌株分別分在7個和6個類群中，說明這些稻區(qū)的稻曲病菌菌株有較大的差異。因此，在水稻抗稻曲病品種布局和稻曲病綜合防控時，需考慮各個稻區(qū)稻曲病菌菌株之間的群體遺傳多樣性等方面的差異，采取合適的方法，以達到稻曲病防控的最佳效果。本試驗用ERIC-PCR技術劃分的稻曲病基因類群與菌絲生長速率和產孢量之間不存在相關性，與李燕等[23]研究結果相似。

稻曲病有性世代產生的子囊孢子是稻曲病菌的主要侵染來源之一，真菌有性繁殖過程中交配型基因對其性別控制起著決定性作用[24]。真菌的交配型是控制其交配親和性和有性繁殖的遺傳基礎，已知的真菌交配型系統(tǒng)分為同宗配合和異宗配合[25]。已有研究報道MATⅠ和MATⅡ共同存在才能形成有受精能力的子座;只有其中一個不能形成成熟的子座[26]。本研究采用兩對引物對157個菌株測定了交配型，都有且只有一條條帶出現，沒有菌株出現兩條條帶，也就是說菌株只屬于MATⅠ型或MATⅡ型。于俊杰等[27]將不同交配型基因的稻曲病菌株配對接種獲得菌核，觀察子座和子囊孢子形成情況，初步推斷稻曲病菌為異宗配合真菌。筆者參照王疏的方法[28]利用大米粒培養(yǎng)基對稻曲病菌進行培養(yǎng)，嘗試將具有不同交配型基因的稻曲病菌菌株進行配對，但用MATⅠ型單個菌株、MATⅡ型單個菌株、多個MATⅠ型菌株混合、多個MATⅡ型菌株混合或MATⅠ型與MATⅡ型菌株混合培養(yǎng)，均沒有形成子座。通常，異宗配合真菌可親和的不同交配型的細胞間經過細胞識別、質配、核配和減數分裂等過程產生有性后代[29]，由于樣本數量的局限性，在自然條件下是否存在同時具有兩個交配型的稻曲病菌菌株，還有待收集和檢測更多的菌株，這些不同交配型細胞所處狀態(tài)及子實體形成機制有待進一步的研究。

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（責任編輯：楊明麗）