盧丁伊慧 張戰(zhàn)泓 張卓 張德詠 譚新球 鄭立敏 高陽 史曉斌 劉勇

摘要 ：研究煙粉虱傳播番茄褪綠病毒Tomato chlorosis virus （ToCV）的發(fā)生規(guī)律，建立其預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)模型，能夠指導(dǎo)田間早期有效防治。本研究于2014年-2018年每年采集山東壽光蔬菜基地大棚番茄和雜草的植株葉片，并收集植株上攜帶的所有煙粉虱，以健康番茄、雜草葉片和室內(nèi)飼養(yǎng)的健康煙粉虱為陰性對(duì)照;實(shí)驗(yàn)室ToCV侵染性克隆接種的感病葉片以及從感病葉片上獲毒的煙粉虱為陽性對(duì)照，將采集的樣品帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)和鑒定等試驗(yàn)。根據(jù)病情發(fā)生規(guī)律，建立了番茄褪綠病毒病的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)模型，模擬所得方程為：Y=2.570+0.089X4-7.548X7，其中Y為11月份番茄褪綠病毒病發(fā)生率，X4為采集的樣品上平均每株所攜帶的煙粉虱數(shù)量，X7為采集的田間雜草的帶毒率。預(yù)測(cè)模擬結(jié)果顯示，煙粉虱數(shù)量以及雜草的帶毒率與番茄褪綠病毒病的發(fā)生率極顯著正相關(guān)，回歸檢測(cè)結(jié)果歷史符合率為96.8%以上。明確了影響番茄褪綠病毒病發(fā)生的影響因子，基于煙粉虱數(shù)量以及雜草的帶毒率，構(gòu)建了病害預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)模型。研究結(jié)果有助于及時(shí)發(fā)現(xiàn)番茄褪綠病毒病并采取相應(yīng)預(yù)防措施。

關(guān)鍵詞 ：番茄褪綠病毒; 煙粉虱; 發(fā)展規(guī)律; 預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)模型

中圖分類號(hào)：

S 436.412.11

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020029

Establishment of the prediction model for tomato chlorosis virus disease

LU Dingyihui1，2， ZHANG Zhanhong3， ZHANG Zhuo2， ZHANG Deyong2， TAN Xinqiu2， ZHENG Limin2， GAO Yang2， SHI Xiaobin1，2*， LIU Yong2*

（1. Longping Branch， Graduate School of Hunan University， Changsha 410125， China; 2. Institute of Plant Protection， Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， China; 3. Vegetable Research Institute， Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， China）

Abstract

The occurrence and development of Tomato chlorosis virus （ToCV） transmitted by Bemisia tabaci were investigated by establishing disease prediction models to provide a reference for effective control of ToCV causing disease in the field. The plant leaves of greenhouse tomatoes and weeds were collected in the Shouguang Vegetable Base in Shandong province every year from 2014 to 2018， and all B.tabaci individuals feeding on the plants were collected. Healthy tomatoes， weed leaves and healthy B.tabaci raised indoors were used as negative controls. Leaves inoculated with ToCV in the laboratory and viruliferous B.tabaci on infected leaves were used as positive controls. The collected samples were taken back to the laboratory for ToCV testing and identification. According to the development of ToCV disease， we established the disease prediction model： Y=2.570+0.089X4-7.548X7， in which Y is the incidence of tomato chlorosis virus disease in November; X4is the average number of B.tabaci carried by each sample， and X7is the viruliferous rate of weeds collected in the field. The results revealed that the incidence of the disease showed significantly positive correlation with the population of B.tabaci and the infection rate of weeds. The compliance rate of this prediction model was above 96.8%， suggesting that it can provide an important basis for predicting diseases in time and take preventive measures.

Key words

Tomato chlorosis virus; Bemisia tabaci; occurrence and development trend; prediction model

番茄褪綠病毒Tomato chlorosis virus （ToCV）屬于長(zhǎng)線性病毒科Closteroviridae，毛形病毒屬Crinivirus，是我國(guó)新報(bào)道的對(duì)番茄、辣椒等茄科蔬菜造成毀滅性危害的RNA病毒[1]。植株感染ToCV后下部老葉首先出現(xiàn)癥狀，葉脈保持綠色，但葉片脈間褪綠黃化，葉片變厚卷曲容易折斷;隨后植株病變部位由下向上蔓延，葉片由葉緣向內(nèi)逐漸干枯壞死;最終整個(gè)植株變黃，迅速衰老，果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育也受到限制，從而使果實(shí)的銷售價(jià)值受到嚴(yán)重影響[2]。為了預(yù)防番茄褪綠病毒的傳播，減少病毒病造成的損失，找到影響發(fā)病的關(guān)鍵因素，構(gòu)建其預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)模型迫在眉睫。

番茄褪綠病毒不能通過汁液摩擦傳播[3]，只能依靠介體昆蟲傳播，主要媒介昆蟲是煙粉虱Bemisia tabaci、溫室白粉虱Trialeurodes vaporariorum和紋翅粉虱T.abutilonea[4]，我國(guó)ToCV的介體昆蟲主要是煙粉虱。番茄褪綠病毒病最早在我國(guó)臺(tái)灣報(bào)道后，相繼在山東、山西、江蘇和北京等多地發(fā)現(xiàn)[4]。Wintermantel等報(bào)道了番茄褪綠病毒的發(fā)生特點(diǎn)及其危害[1];鄭慧新等調(diào)查發(fā)現(xiàn)番茄褪綠病毒病已在我國(guó)很多地區(qū)快速擴(kuò)散[4];代惠潔等研究了山東壽光地區(qū)Q型煙粉虱傳播番茄褪綠病毒的特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)二者的發(fā)生存在緊密聯(lián)系[5];Shi等比較了Q型與B型煙粉虱獲取、保留和傳播ToCV的能力，發(fā)現(xiàn)在我國(guó)ToCV的發(fā)生與Q型煙粉虱較強(qiáng)的傳毒能力密切相關(guān)[6];魏可可等報(bào)道了番茄褪綠病毒常用的鑒別方法[7]。目前研究多集中在發(fā)生規(guī)律以及流行原因的調(diào)查，缺乏田間預(yù)測(cè)該病毒病發(fā)生的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)模型。

2014年我們?cè)谏綎|壽光調(diào)查發(fā)現(xiàn)，蔬菜基地的許多大棚番茄以及田間雜草表現(xiàn)出葉脈間褪綠、葉片黃化等癥狀，同時(shí)眾多葉片背面聚集了大量煙粉虱，因而開展了煙粉虱傳播番茄褪綠病毒病的發(fā)生規(guī)律的研究。通過總結(jié)2014年-2018年山東壽光地區(qū)番茄褪綠病毒病的發(fā)生情況，并結(jié)合當(dāng)?shù)貧庀筚Y料、煙粉虱的種類和帶毒情況以及雜草種類和帶毒情況，對(duì)煙粉虱傳播番茄褪綠病毒病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律進(jìn)行了分析并建立了預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)模型。根據(jù)建立的預(yù)測(cè)模型，可以明確影響番茄褪綠病毒病發(fā)生的

主要因素，從而采取有效措施及時(shí)進(jìn)行預(yù)防和控制，有效降低番茄褪綠病毒病的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2014年-2018年，每年的11月份在壽光的大棚中調(diào)查番茄褪綠病毒病的發(fā)生率，并且用小型氣象記錄儀自動(dòng)記錄11月份每天的光照時(shí)間、溫度和濕度。在調(diào)查的大棚中隨機(jī)選取20行，每行采集1株番茄，共采集20株，采集時(shí)先用吸蟲管吸取番茄上所有的煙粉虱，將每株番茄上收集的煙粉虱裝到一個(gè)離心管中，同時(shí)統(tǒng)計(jì)所有雜草種類數(shù)，并從每行番茄附近的雜草中隨機(jī)選擇1株，共20株，采集其地上部分葉片，將采集的樣品置于液氮中速凍后單株保存于-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫糜诤罄m(xù)提取其基因組（DNA或RNA）等試驗(yàn)，以健康番茄和田邊地間雜草葉片為陰性對(duì)照;實(shí)驗(yàn)室ToCV侵染性克隆接種的感病葉片為陽性對(duì)照[8]。

1.2 植物總RNA的提取

采用北京華越洋生物公司多酚多糖植物RNA提取試劑盒提取大棚番茄和雜草樣品的總RNA[910]，具體步驟按照RNA提取試劑盒說明書。

1.3 煙粉虱總RNA的提取

采用TRIzol法來提取煙粉虱樣品總RNA[1113]。

1.4 cDNA的合成

以提取的總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的體系及步驟參照Vazyme生物公司Hiscript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit產(chǎn)品說明書。

1.5 RT-PCR和電泳檢測(cè)

采用ToCV特異性引物ToCV-3F/ToCV-3R（表1）對(duì)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增[1415]。PCR擴(kuò)增體系為： RNase-free ddH2O 7 μL、2×Taq Master Mix 10 μL、10 μmol/L ToCV-3F/ToCV-3R 各1 μL、cDNA模板1 μL。PCR程序?yàn)椋?5℃ 5 min;95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min，4℃保存。電泳檢測(cè)后，產(chǎn)物純化回收送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序分析。

1.6 煙粉虱數(shù)量及帶毒率檢測(cè)

以株為單位統(tǒng)計(jì)1.1采集的20株番茄植株上所有煙粉虱數(shù)量，并計(jì)算平均每株番茄上煙粉虱數(shù)量。從每株番茄植株上采集到的煙粉虱中隨機(jī)選取20頭，番茄植株上不足20頭的按照實(shí)際數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和計(jì)算。采用ToCV特異性引物ToCV-3F/ToCV-3R對(duì)每頭煙粉虱進(jìn)行ToCV檢測(cè)，其中每株上采集20頭煙粉虱的帶毒率作為1個(gè)重復(fù)，共進(jìn)行20次重復(fù)，統(tǒng)計(jì)20株番茄上所攜帶的煙粉虱的帶毒率，取平均值得到最終煙粉虱帶毒率。

每株番茄上的煙粉虱帶毒率=攜帶ToCV的煙粉虱數(shù)/檢測(cè)煙粉虱數(shù)×100%。

1.7 煙粉虱種群的鑒定

從每株番茄植株上采集的煙粉虱樣品中隨機(jī)取1頭，20株番茄植株共取20頭對(duì)其mt COⅠ基因進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)3次[18]。取3 μL蛋白酶K于封口膜上，每頭煙粉虱置于膜上研磨成勻漿后移至PCR管，加入10 mg/mL的樹脂溶液20 μL混勻，然后置于37℃孵育1 h，96℃ 10 min。PCR體系為20 μL，即RNase-free ddH2O 7 μL、2×Taq Master Mix 10 μL、10 μmol/L上、下游引物WT-F/WT-R（表1）各1 μL，cDNA模板1 μL。PCR程序：95℃ 5 min;95℃ 15 s，53℃ 45 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物取5 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

隨后取PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切。酶切體系：10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，0.5 μL AseⅠ、2 μL 3.1×Buffer、7.5 μL RNase-free ddH2O，混勻后置于37℃ 3～4 h。取5 μL酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。mt COⅠ PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后， Q型煙粉虱電泳顯示約500 bp和100 bp兩條帶， 而B型煙粉虱在500～750 bp間僅有1條帶[17]。

1.8 田間雜草種類及其帶毒率

首先統(tǒng)計(jì)番茄附近所有雜草的種類，然后利用ToCV特異性引物ToCV-3F/ToCV-3R對(duì)隨機(jī)選取的20株雜草進(jìn)行鑒定。每株雜草取上、中、下部位的3片葉分別進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)大約60片葉，若上、中、下部位中有1處被檢測(cè)出帶毒，即為該雜草帶毒，最后統(tǒng)計(jì)雜草的帶毒率。計(jì)算公式：雜草帶毒率=攜帶ToCV的雜草數(shù)/檢測(cè)雜草數(shù)×100%。

1.9 回歸方程的建立

相關(guān)性分析：利用2014年-2018年山東壽光11月份番茄褪綠病毒病發(fā)生率與各自變量因子在SPSS 21.0中進(jìn)行相關(guān)顯著性分析[19]。

逐步回歸分析：利用相關(guān)性分析結(jié)果在SPSS 21.0中進(jìn)行回歸分析[1921]。

1.10 方程的擬合性分析

利用SPSS 21.0分析軟件輸出的回歸方程對(duì)2014年-2018年與番茄褪綠病毒病發(fā)病率相關(guān)的因素：11月份平均每日光照時(shí)間，11月份平均溫度，11月份平均相對(duì)濕度，每株采集的樣品上所攜帶的平均煙粉虱數(shù)量，采集的樣品上所攜帶的煙粉虱的帶毒率，采集的田間雜草的種類，采集的田間雜草的帶毒率進(jìn)行擬合性檢驗(yàn)，并對(duì)歷史符合率進(jìn)行分析[2223]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大棚番茄ToCV的發(fā)病率

通過觀察發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)大棚番茄在苗期、花期、結(jié)果期均可被ToCV感染（圖1）。不同年份番茄均存在較高的發(fā)病率（表2）。對(duì)田間采摘的大棚番茄樣品進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，驗(yàn)證了ToCV的侵染。

2.2 煙粉虱數(shù)量及帶毒率檢測(cè)

統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，2014年-2018年大棚番茄所攜帶的煙粉虱平均每株數(shù)量在18～59頭（表3）。每年從采集的樣品中隨機(jī)選取20頭進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)煙粉虱均存在較高的帶毒率（65%～95%）（表3）?？梢钥闯觯S著煙粉虱數(shù)量的增加，煙粉虱帶毒率也隨之升高。

2.3 煙粉虱種類鑒定

對(duì)大棚番茄上采集的煙粉虱進(jìn)行種類鑒定，提取單頭煙粉虱總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)AseⅠ酶切后，進(jìn)行電泳檢測(cè)，得到500 bp和100 bp的兩條帶，結(jié)果表明該地區(qū)的煙粉虱均為Q型煙粉虱（圖2）。

2.4 田間雜草種類及其帶毒率

2014年-2018年每年采集的雜草種類及其帶毒率各有不同?？梢钥闯?，隨著雜草種類的增加，雜草帶毒率呈上升趨勢(shì)（表4）。

2.5 番茄褪綠病毒病預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)模型的建立

通過總結(jié)番茄褪綠病毒病發(fā)病率相關(guān)資料發(fā)現(xiàn)，2014年-2018年，與番茄褪綠病毒病發(fā)病率相關(guān)的因素可能有：11月份平均每日光照時(shí)間、11月份平均溫度、11月份平均相對(duì)濕度、每株番茄平均煙粉虱數(shù)量及其帶毒率、田間雜草種類以及帶毒率（表5）。

利用2014年-2018年山東壽光11月份番茄褪綠病毒病發(fā)生率與各自變量因子在SPSS 21.0中進(jìn)行相關(guān)顯著性分析，獲得了2個(gè)與11月份番茄褪綠病毒病發(fā)生率在0.01水平上極顯著因子，X4：平均每株煙粉虱數(shù)量（頭）;X7：田間雜草的帶毒率（%）。獲取了2個(gè)與11月份番茄褪綠病毒病發(fā)生率在0.05水平上顯著因子，X5：煙粉虱的帶毒率;X6：田間雜草的種類數(shù)。

利用相關(guān)性分析結(jié)果進(jìn)行回歸分析，將Y（ToCV發(fā)生率）添加到因變量列表，將X4（平均每株煙粉虱數(shù)量）、X5（煙粉虱帶毒率）、X6（雜草種類數(shù)）和X7（雜草帶毒率）添加到自變量列表，輸出模型匯總表、方差分析表和回歸系數(shù)表。

由回歸系數(shù)表可得到回歸方程：Y=2.570+0.089X4-7.548X7（R2=0.998）。

2.6 番茄褪綠病毒病預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)模型的準(zhǔn)確度

對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)回歸檢測(cè)結(jié)果歷史符合率均在96.8%以上，因而可以作為番茄褪綠病毒病發(fā)生程度的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)模型（表6）。

1） Y： 11月份番茄褪綠病毒病發(fā)生率; X1： 11月份平均每日光照時(shí)間; X2： 11月份平均溫度; X3： 11月份平均相對(duì)濕度; X4： 平均每株番茄上攜帶的煙粉虱數(shù)量; X5： 采集樣品上煙粉虱的帶毒率; X6： 采集的田間雜草的種類數(shù); X7： 采集的田間雜草的帶毒率。

Y： The incidence of tomato chlorosis virus disease in November; X1： The average daily light time in November; X2： Mean temperature in November; X3： The average relative humidity in November; X4： The average number of Bemisia tabaci carried by each sample; X5： The virus-carrying rate of B.tabaci on the collected samples; X6： The species of weeds collected in the field; X7： The viruliferous rates of weeds collected in the field.

3 討論

3.1 田間發(fā)病規(guī)律

關(guān)于番茄褪綠病毒病的田間發(fā)病規(guī)律已有較多的研究[2428]。李嬌嬌等發(fā)現(xiàn)Q型煙粉虱及ToCV的多發(fā)季節(jié)在秋季，并指出11月上旬之后，日光溫室平均溫度一般低于20℃，已不利于煙粉虱的繁育與傳播，因而病害發(fā)生相對(duì)較輕[26]。本研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)基地的大棚番茄于7月底或者8月初種植，這段時(shí)間溫度高，空氣相對(duì)濕度低，有利于番茄幼苗的生長(zhǎng)，但同時(shí)容易滋生煙粉虱。而在溫室中極易存在攜帶ToCV的煙粉虱，溫室外存在攜帶ToCV的雜草，進(jìn)而造成了番茄褪綠病毒的傳播。ToCV的侵染存在潛伏期，病毒侵染初期植株并沒有表現(xiàn)癥狀，而到11月份，大棚番茄進(jìn)入發(fā)病的高峰期。

3.2 番茄褪綠病毒病發(fā)生率與煙粉虱數(shù)量的關(guān)系

運(yùn)用SPSS 21.0對(duì)各因素進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，ToCV的發(fā)生率與煙粉虱數(shù)量呈極顯著正相關(guān)。此外，調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大棚中的煙粉虱均為Q型，且每株番茄上的煙粉虱均攜帶病毒。預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)模型也表明番茄褪綠病毒病的發(fā)生率與采集的每株植株上所攜帶的平均煙粉虱數(shù)量在0.01的水平上極顯著相關(guān)。此結(jié)論與李嬌嬌等[28]的結(jié)論有出入，而與代惠潔等[25]報(bào)道的結(jié)論相似，這可能與地域等自然環(huán)境引起的差異有關(guān)。因此應(yīng)在種植早期重視對(duì)煙粉虱的防治，從而減輕ToCV的發(fā)生。

3.3 番茄褪綠病毒病發(fā)生率與雜草帶毒率的關(guān)系

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，ToCV的發(fā)生率除了與煙粉虱數(shù)量極顯著正相關(guān)外，還與田間雜草的帶毒率在0.01的水平上極顯著正相關(guān)。代惠潔等指出番茄定植前需徹底清除棚內(nèi)及周邊雜草，切斷可能的毒源有利于番茄褪綠病毒的防控[27]。這與本研究所得結(jié)論一致，同時(shí)也驗(yàn)證了預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)模型的準(zhǔn)確性。結(jié)合預(yù)測(cè)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，田間雜草能夠攜帶并保存ToCV，在溫室大棚中，在上一季番茄收獲之后，病毒都在雜草中保存，隨著煙粉虱的發(fā)生，再次侵染新一季的番茄，從而造成病害的循環(huán)發(fā)生。我們還發(fā)現(xiàn)雜草種類越多，ToCV的發(fā)生率越高，因此今后有必要調(diào)查清楚ToCV的雜草寄主，從而更有針對(duì)性地清除雜草，以降低ToCV的發(fā)生。

3.4 構(gòu)建模型的意義

利用SPSS 21.0建立預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)模型，模擬所得方程為：Y=2.570+0.089X4-7.548X7，其中Y為11月份番茄褪綠病毒病發(fā)生率，X4為采集的

番茄上平均每株攜帶的煙粉虱數(shù)量，X7為采集的田間雜草的帶毒率，回歸檢測(cè)結(jié)果歷史符合率為96.8%以上。通過構(gòu)建煙粉虱傳播番茄褪綠病毒病的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)模型，明確了番茄褪綠病毒發(fā)生過程中的重要影響因子，為預(yù)防番茄褪綠病毒病的發(fā)生提供了重要依據(jù)，有助于及時(shí)發(fā)現(xiàn)番茄褪綠病毒病并采取相應(yīng)的預(yù)防措施，從而減少其造成的經(jīng)濟(jì)損失，實(shí)現(xiàn)番茄的高產(chǎn)提質(zhì)優(yōu)化。

煙粉虱傳播的番茄褪綠病毒病的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)模型是在特定的時(shí)間、空間條件下采用一定的資料構(gòu)建出來的模型，可能不具有普遍適用性。不同地區(qū)，不同氣象因素和不同的生長(zhǎng)條件也可能會(huì)影響ToCV的發(fā)生，還需要進(jìn)行不斷地探索。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）