余 蕾，閻光宇

(廈門海洋職業(yè)技術(shù)學(xué)院海洋生物學(xué)院,福建 廈門 361012)

引言

靈芝是一種樹生菌類，是中國(guó)著名的藥用真菌之一，在中國(guó)作為治療性藥草具有超過(guò)兩千年的使用歷史.在中醫(yī)領(lǐng)域內(nèi)，靈芝具有補(bǔ)氣安神、止咳平喘等保養(yǎng)功效.不僅如此，靈芝對(duì)于多種理化以及生物因素引起的肝損傷、心血管疾病都起到很好的治療和保護(hù)作用，也可以減輕非胰島素依賴型糖尿病的發(fā)病程度.為了提升靈芝的醫(yī)用價(jià)值，改善藥用口感，通常使用生物工程技術(shù)，在酶的催化作用下，對(duì)靈芝進(jìn)行酶解發(fā)酵處理，并將其制成發(fā)酵靈芝菌粉，方便加工食用[1].靈芝經(jīng)過(guò)發(fā)酵與研磨處理，可以使靈芝孢子外殼變得柔軟，孢子不易滲出、不易氧化.在應(yīng)用過(guò)程中，為了達(dá)到更好的治療效果會(huì)使用提取工藝，生成發(fā)酵靈芝菌粉的提取物，相比正常的發(fā)酵靈芝菌粉其純度更高、治療效果更好，發(fā)酵靈芝菌粉提取物可以制成中成藥.在保證病人靈芝攝入量的情況下，簡(jiǎn)化加工過(guò)程.現(xiàn)階段市面上使用與售賣的發(fā)酵靈芝菌粉提取物都是使用冷提取方法得到的，使用這種方法得到的提取物可以保證各個(gè)成分含量均衡，符合大多數(shù)人的需求[2].除了冷提取法以外，還存在熱提取、堿法提取等多種方法，使用不同的提取方法得到的提取物中的成分側(cè)重點(diǎn)不同，含量也不相同.然而針對(duì)不同的需求，需要用到不同的提取方法，對(duì)于一些有特殊要求的用戶，需要為其定制其他的提取方法.因此，需要研究不同的發(fā)酵靈芝菌粉提取方法對(duì)提取物產(chǎn)生什么樣的影響.

現(xiàn)如今普遍的含量差異分析方法有基于主成分分析的含量差異分析方法、基于FTIR的含量分析方法和基于柱前衍生化HPLC的含量分析方法[3].經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的研究發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有的含量差異分析方法用于發(fā)酵靈芝菌粉提取物含量分析時(shí)，會(huì)出現(xiàn)分析不準(zhǔn)確、分析結(jié)果可信度低的問(wèn)題，因此，需要對(duì)傳統(tǒng)的含量差異分析方法進(jìn)行改進(jìn)設(shè)計(jì)，主要針對(duì)發(fā)酵靈芝菌粉提取物含量，從而得到具有科學(xué)權(quán)威性的分析結(jié)果.

1 發(fā)酵靈芝菌粉提取物含量差異分析方法設(shè)計(jì)

對(duì)不同提取方法下發(fā)酵靈芝粉提取物進(jìn)行含量差異分析，首先需要選用靈芝原料，安裝提取儀器，并使用靈芝原料在不同的提取方法下，得到提取結(jié)果[4].對(duì)得到的提取物進(jìn)行預(yù)處理，測(cè)定提取物中的含量類型.在統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的分析下，得到提取物含量的差異對(duì)比結(jié)果.

1.1 獲取靈芝菌粉提取原料

靈芝菌粉提取物主要是在靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)基中提取的，首先需要制作靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)基作為靈芝菌粉提取的原料.靈芝菌粉的發(fā)酵過(guò)程在氣升式發(fā)酵器中進(jìn)行，氣升式發(fā)酵器的結(jié)構(gòu)如圖1所示.

圖1 氣升式發(fā)酵器結(jié)構(gòu)圖

將活化的靈芝分割成多個(gè)菌絲塊，進(jìn)行30 min以上的滅菌處理.處理完成后將其放入氣升式發(fā)酵器當(dāng)中，在靈芝發(fā)酵過(guò)程中多間歇或者連續(xù)加料，基質(zhì)和溶氧盡可能均勻分散，以此來(lái)保證靈芝在其中各個(gè)位置的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較為均勻[5].氣升式發(fā)酵器中有較高的氣含率和比氣液接觸界面，保證靈芝在其中具有較高的傳質(zhì)速率和溶氧效率.在氣升式發(fā)酵器中連續(xù)發(fā)酵6 h后，再以10%的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中.設(shè)定機(jī)械搖床的轉(zhuǎn)速為150 r/min，將培養(yǎng)基放置在恒定溫度為288 ℃的環(huán)境當(dāng)中，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，得到靈芝菌粉發(fā)酵液.

1.2 安裝發(fā)酵靈芝菌粉提取儀器

在靈芝菌粉發(fā)酵的過(guò)程中安裝提取儀器，根據(jù)不同提取方法的使用要求，安裝相對(duì)應(yīng)的提取儀器.發(fā)酵靈芝菌粉的提取儀器包括：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、HPD-25固相萃取儀、SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵、GZX-9076MBE 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱、2004 型數(shù)顯恒溫水浴鍋、超聲波發(fā)射儀、JA5003 電子天平以及津滕 CG-17 抽濾機(jī)等儀器裝置[6].其中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、HPD-25固相萃取儀、2004 型數(shù)顯恒溫水浴鍋、超聲波發(fā)射儀分別為不同提取方法對(duì)應(yīng)的提取設(shè)備.而SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵是為靈芝菌粉的提取提供一個(gè)真空的環(huán)境，避免空氣中的其他微生物混入到提取物當(dāng)中.同理津滕 CG-17 抽濾機(jī)是對(duì)初步提取的提取物進(jìn)行過(guò)濾處理，保證提取物達(dá)到相同的提取精度，而JA5003 電子天平用來(lái)測(cè)量提取物的質(zhì)量，在提取物含量差異分析過(guò)程中，需要保證不同方法下提取物質(zhì)量相同，使得提取物含量之間具有可比性.

1.3 不同靈芝菌粉提取方法

在準(zhǔn)備好提取設(shè)備與提取原料的條件下，分別使用冷提、熱提、堿法提取、超聲提取以及有機(jī)溶劑回流提取五種不同的提取方法，得到不同的發(fā)酵靈芝菌粉提取物.

1.3.1 冷提

冷提是在常溫情況下，對(duì)提取物進(jìn)行萃取的方法.將準(zhǔn)備完成的發(fā)酵靈芝菌粉培養(yǎng)液經(jīng)過(guò)95%乙醇浸泡和抽濾，把得到的培養(yǎng)濾液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀當(dāng)中，得到浸膏后加入適量的蒸餾水，接著在HPD-25固相萃取儀中加入石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，所得石油醚和三氯甲烷部分多為色素且提取物含量較少故舍去，其余部分冷凍干燥后得到粉末狀的發(fā)酵靈芝菌粉冷提取物[7].

1.3.2 熱提

使用2004 型數(shù)顯恒溫水浴鍋為熱提取方法提供恒定的溫度環(huán)境，將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀放入恒溫水浴鍋當(dāng)中，并按照冷提取方法將培養(yǎng)基放入其中，將得到的提取物經(jīng)過(guò)GZX-9076MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱得到提取物.

1.3.3 堿法提取

使用電子天平稱相同質(zhì)量的發(fā)酵靈芝菌粉培養(yǎng)液，在提取儀器中添加pH值為10的氫氧化鈉堿液50 mL，在常溫水域環(huán)境下，浸泡2 h，在浸泡過(guò)程中伴隨勻速攪拌，在提取與浸泡過(guò)程中保持提取環(huán)境的pH值為10，將浸泡結(jié)果輸出得到粗提取液[8].經(jīng)過(guò)固相萃取柱純化，得到提取樣品液，并取 1 mL 樣品液用甲醇稀釋.

1.3.4 超聲波提取

超聲波提取需要利用超聲波發(fā)射儀，在普通燒瓶中添加乙酸乙酯 40 mL，在恒溫60 ℃的環(huán)境下啟動(dòng)超聲波發(fā)射儀，連續(xù)發(fā)射30 min，得到提取粗液，取 1 mL 樣品液用甲醇稀釋至 100 mL輸出超聲波提取結(jié)果.

1.3.5 有機(jī)溶劑回流提取

在燒瓶中放入發(fā)酵靈芝菌粉培養(yǎng)液，添加乙酸乙酯40 mL，連接上回流裝置，利用漏斗過(guò)濾，濾液濃縮得到粗提液[9].選取提取物液中的5 mL樣品，通過(guò) 0.2 μm 微孔濾膜，輸出的液體進(jìn)行干燥處理，得到的粉末狀固體即為發(fā)酵靈芝菌粉提取物.

對(duì)不同提取方法下的提取率進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算方法如式(1)所示.

(1)

式中m表示的是發(fā)酵靈芝菌粉提取物的質(zhì)量，c為提取液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，單位為ug/mL，v為提取液的總體積.通過(guò)計(jì)算保證不同提取方法的提取率在95%以上，使用天平分別稱取不同提取方法下的提取物各15 g進(jìn)行預(yù)處理.

1.4 提取物預(yù)處理

稱取相同質(zhì)量的發(fā)酵靈芝菌粉提取物，加入正己烷10 mL，經(jīng)過(guò)5 min的充分振蕩，放置30 min等待分層.去除分層后的上層清液，使用氮?dú)獯蹈?，?shí)現(xiàn)發(fā)酵靈芝菌粉甲酯化處理，得到固體預(yù)處理結(jié)果.

1.5 測(cè)定發(fā)酵靈芝菌粉提取物成分

使用色譜、紫外光譜和質(zhì)譜檢測(cè)方法測(cè)定發(fā)酵靈芝菌粉提取物成分，采用高效液相色譜-紫外分光光度法測(cè)定，選用的波長(zhǎng)多為254 nm和260 nm[10].得到提取物的成分測(cè)定結(jié)果如圖2、圖3所示.

圖2 HPLC色譜圖

圖3 質(zhì)譜正負(fù)離子的紫外光譜圖

通過(guò)成分測(cè)定可以看出，發(fā)酵靈芝菌粉提取物中主要含有氨基酸、多肽、一般化學(xué)成分、蛋白質(zhì)、真菌溶菌酶，以及糖類(還原糖和多糖)、麥角甾醇、三萜類、香豆精甙、揮發(fā)油、硬脂酸、苯甲酸、生物堿、維生素B2及維生素C等；孢子還含甘露醇、海藻糖和天然活性成分：靈芝多糖、靈芝酸等成分[11].

1.6 提取物含量統(tǒng)計(jì)與差異對(duì)比

1.6.1 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

通過(guò)式(2)計(jì)算發(fā)酵靈芝菌粉提取物中各個(gè)成本低額含量.

(2)

式中y為發(fā)酵靈芝菌粉提取物中某成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，m0為發(fā)酵培養(yǎng)物質(zhì)量，mt為該成分的物質(zhì)的量[12].采用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析，多組比較用單因素方差分析，兩兩比較用Dunnett-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

1.6.2 含量差異對(duì)比結(jié)果分析

經(jīng)過(guò)成分含量的計(jì)算得出五種提取方法的含量差異對(duì)比結(jié)果，如表1所示.

表1 提取物成分含量差異對(duì)比結(jié)果表 g·100-1·g-1

從表1中可以看出，冷提取方法提取物中各個(gè)成分含量比較均衡，熱提取方法中氨基酸含量較高，而多糖和蛋白質(zhì)等成分由于高溫降解的影響含量較低.堿法提取方法中氨基酸的成分含量較低，蛋白質(zhì)和多糖的成分含量較低.超聲波提取方法和有機(jī)溶劑回流提取方法得到的提取物各個(gè)成分含量都較高，相比之下有機(jī)溶劑回流方法下的提取物靈芝酸含量最高.

2 性能測(cè)試實(shí)驗(yàn)分析

為了驗(yàn)證差異分析方法的有效性進(jìn)行了性能測(cè)試實(shí)驗(yàn)，選用相同的靈芝提取物作為性能測(cè)試實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)對(duì)象.為了更加鮮明的體現(xiàn)設(shè)計(jì)出的發(fā)酵靈芝菌粉提取物含量差異分析方法的性能，設(shè)置傳統(tǒng)的提取物含量差異分析方法作為實(shí)驗(yàn)的對(duì)比方法.在性能測(cè)試實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，分別使用兩種差異分析方法對(duì)相同情況下的提取物含量差異對(duì)比參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì).在性能測(cè)試實(shí)驗(yàn)當(dāng)中設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)差異參數(shù)，并計(jì)算兩種分析方法得出的差異結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置結(jié)果之間的誤差，誤差結(jié)果如圖4所示.

圖4 性能測(cè)試實(shí)驗(yàn)對(duì)比曲線

從圖4中可以看出，針對(duì)不同的測(cè)試組別，得出的誤差結(jié)果不同，然而傳統(tǒng)差異分析方法得出的誤差值始終高于設(shè)計(jì)出的發(fā)酵靈芝菌粉提取物含量差異分析方法.經(jīng)過(guò)計(jì)算，傳統(tǒng)的差異分析方法的平均誤差值為3.24，而設(shè)計(jì)優(yōu)化的含量差異分析方法的平均誤差為1.97，相比之下誤差降低了1.27，因此設(shè)計(jì)出的發(fā)酵靈芝菌粉提取物含量差異優(yōu)化分析方法具有較高的有效性.

3 結(jié)論

通過(guò)所設(shè)計(jì)發(fā)酵靈芝菌粉提取物含量差異分析方法，得出準(zhǔn)確的發(fā)酵靈芝菌粉提取物含量統(tǒng)計(jì)與差異對(duì)比結(jié)果，將設(shè)計(jì)方法用于發(fā)酵靈芝菌粉提取物含量分析當(dāng)中，可以用不同的提取方法提取出不同含量需求的發(fā)酵靈芝菌粉提取物，這對(duì)于生物醫(yī)療事業(yè)具有輔助作用.