黎小椿，吳鳳蓮，龐永豐，聶 輝，黃雙全，羅楊合

(賀州學(xué)院食品科學(xué)與工程技術(shù)研究院, 廣西賀州 542899)

啶蟲脒(Acetamiprid，AC)是一種氯化煙堿類新型高效廣譜殺蟲劑。其能作用于蔬菜、果樹、水稻及茶葉上的同翅目、鱗翅目及鞘翅目害蟲神經(jīng)系統(tǒng)突觸部位煙堿乙酰膽堿受體，干擾害蟲神經(jīng)系統(tǒng)的刺激傳導(dǎo)，引起神經(jīng)系統(tǒng)通路阻塞，導(dǎo)致害蟲麻痹，從而達(dá)到殺蟲的效果[1-2]。啶蟲脒在植物和環(huán)境中難以降解，頻繁和廣泛地施用啶蟲脒會(huì)導(dǎo)致環(huán)境污染，且殘留在蔬菜中的啶蟲脒還會(huì)對(duì)人類有輕微的急性和慢性毒性[3-4]，它通過(guò)干擾人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起如阿爾茨海默病、帕金森病、精神分裂癥和抑郁癥疾病。

目前，啶蟲脒的檢測(cè)方法包括色譜法[5-6]、電化學(xué)法[7-8]、熒光法[9-11]和Surface-enhanced Raman scattering(SERS)[12-13]法。這些方法中，色譜法成本高、操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)，不能滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的要求；電化學(xué)法和熒光法選擇性低、線性范圍窄，限制其在實(shí)際檢測(cè)中的應(yīng)用。而SERS法是一種選擇性好、敏感性高的檢測(cè)方法，在農(nóng)殘檢測(cè)應(yīng)用中具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高和對(duì)樣品無(wú)損等其它常規(guī)農(nóng)殘檢測(cè)方法無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)[14-15]。

核酸適配體(Aptamer，Apt)，又稱核酸適體或適體，是通過(guò)指數(shù)富集系統(tǒng)(SELEX)技術(shù)從體外隨機(jī)單鏈脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)序列庫(kù)中篩選出來(lái)的能與靶物質(zhì)產(chǎn)生類似于抗原-抗體高特異性結(jié)合的寡核苷酸鏈[16]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，核酸適配體基于高親和力及與目標(biāo)小分子(配體或靶分子)結(jié)合的特異性，被作為新型分子識(shí)別元件，在食品安全、環(huán)境分析、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中的應(yīng)用十分普遍。此外，適配體還具有體積小、易于人工合成和修飾等多種優(yōu)勢(shì)[17-18]，成為SERS分析和農(nóng)殘檢測(cè)中識(shí)別目標(biāo)分子的理想選擇。

碳點(diǎn)由于具有優(yōu)異的表面效應(yīng)、良好的電子傳導(dǎo)性能、特殊的尺寸效應(yīng)，使其在SERS分析中得以廣泛應(yīng)用。碳點(diǎn)和異原子摻雜碳點(diǎn)的催化反應(yīng)可用于制備高穩(wěn)定性高SERS活性基底，提高SERS分析重現(xiàn)性，大大拓寬了SERS分析應(yīng)用領(lǐng)域。Luo等[19]利用碳點(diǎn)(CD)還原HAuCl4制備平均粒徑8～44 nm的Au＠CD納米基底，并比較其與AuNP基底對(duì)羅丹明6G(rhodamine 6G，Rh6G)的吸附能力，結(jié)果顯示：Au＠CD納米基底對(duì)Rh6G表現(xiàn)出的SERS效應(yīng)高于相同納米尺寸的AuNP基底。Wang等[20]利用N摻雜碳量子點(diǎn)催化HAuCl4與H2O2反應(yīng)可制備高穩(wěn)定性納米金基底，建立重現(xiàn)性好的SERS檢測(cè)SO42-的新方法。Zhao等[21]將碳點(diǎn)(CD)與AgNP反應(yīng)制備高的AgNPs/CD作為SERS基底，該基底能檢測(cè)濃度低至10-8mol/L的PATP(paminothiophenol)。迄今為止，關(guān)于碳點(diǎn)運(yùn)用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)的研究大多局限于熒光探針的制備，啶蟲脒的檢測(cè)未見碳點(diǎn)和摻雜碳點(diǎn)結(jié)合SERS檢測(cè)啶蟲脒的報(bào)道[22-28]。碳點(diǎn)具有比表面積大、生物相容性等優(yōu)勢(shì)，將其SERS技術(shù)相結(jié)合，可以大大提高在農(nóng)殘檢測(cè)中的速度、靈敏度和選擇性。

本文將高靈敏度簡(jiǎn)便快速的SERS分析方法與具有較高親和力的適配體和具有優(yōu)異催化活性的碳點(diǎn)有機(jī)結(jié)合，通過(guò)適配體和啶蟲脒農(nóng)藥靶標(biāo)分子調(diào)節(jié)碳點(diǎn)催化反應(yīng)，構(gòu)建重現(xiàn)性好、靈敏度高、簡(jiǎn)便快速的蔬菜中啶蟲脒、農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法，這既是提高SERS分析方法重現(xiàn)性和農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)方法靈敏度低的新探索，又是適配體化學(xué)、納米酶化學(xué)、催化反應(yīng)理論及應(yīng)用的新拓展，符合公眾對(duì)蔬菜質(zhì)量安全越來(lái)越高的要求，對(duì)保障人類健康和促進(jìn)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要意義，同時(shí)可為果蔬汁加工企業(yè)解決在生產(chǎn)過(guò)程中檢測(cè)痕量農(nóng)殘的難題提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

3500 Da透析袋；核酸適配體(Aptamer，Apt)序列[27]：5’-CTCTCTCTCTCTGACACCATATTATGAA GATCTCTCTCTC-3’ 上海生工生物有限公司；啶蟲脒、吡蟲啉(純度98.5%)，阿特拉津(98%)純度，多菌靈、毒死蜱(純度99%) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1 mol/L AgNO3分析純，廣東光華科技股份有限公司，使用時(shí)稀釋至所需濃度；0.1 mol/L檸檬酸三鈉 分析純，廣東汕頭西隴化工廠；1 mol/L NaCl 分析純，西隴化工股份有限公司；1.0×10-5mol/L維多利亞藍(lán)B(VBB)溶液 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；果糖純度99% 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；尿素 分析純，廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研發(fā)中心；小白菜500 g、黃瓜500 g、西紅柿500 g 購(gòu)置于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；啶蟲脒標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.0050 g啶蟲脒粉末，加2 mL丙酮超聲完全溶解后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，加水定容至刻度線，得到100 mg/L啶蟲脒標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋至100倍得到1 mg/L，稀釋兩倍得到0.5 mg/L，備用；實(shí)驗(yàn)用水 為亞沸水。

DXR smart拉曼光譜儀 美國(guó)Thermo公司；日立F-7000熒光分光光度計(jì) 日立高新技術(shù)公司；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HH-S2電熱恒溫水浴鍋 金壇市大地自動(dòng)化儀器廠；S-4800場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 日立高新技術(shù)公司英國(guó)牛津公司；SYZ-550型石英亞沸蒸餾水器 江蘇晶玻儀器廠；EG 823 LA6-NR3美的微波爐 廣東美的廚房電器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 摻氮及摻氮銀碳量子點(diǎn)(CDN、CDN/Ag)的制備將0.5 g果糖、0.8 g尿素和0、0.5、1、1.5 mL 0.01 mol/L AgNO3于燒杯中超聲溶解完全，用亞沸水定容至15 mL，用保鮮膜封口，在薄膜上扎幾個(gè)小孔后置于微波爐(700 W)中加熱5 min。加熱結(jié)束后，自然冷卻至室溫即得到棕黑色固體，用適量去離子水將其溶解并定容至15 mL，將溶液于10000 r/min離心5 min，取上清液，用截留分子量為3500 Da的透析袋透析12 h，用50 mmol/L NaOH調(diào)至中性，再用亞沸水定容至15 mL，得到CDN、CDN/Ag0.5、CDN/Ag1、CDN/Ag1.5碳量子點(diǎn)濃度為0.021 g/mL(以果糖計(jì))，使用時(shí)稀釋至所需濃度。

1.2.2 SERS法測(cè)定啶蟲脒 在5 mL具塞試管中依次加入適量濃度的啶蟲脒、60 μL 0.60 μmol/L的啶蟲脒適配體溶液，混勻靜置反應(yīng)8 min；加入125 μL 2.13 mg/L CDN或CDN/Ag溶液，充分混勻后再靜置大約5 min；然后加入120 μL 0.01 mol/L AgNO3、80 μL 0.1 mol/L檸檬酸三鈉溶液，用亞沸水定容到1.5 mL，80 ℃水浴反應(yīng)20 min；冰水終止反應(yīng)，加20 μL 1 mol/L NaCl、50 μL 1.0×10-5mol/L VBB。測(cè)定1617 cm-1拉曼位移處的表面增強(qiáng)拉曼散射峰強(qiáng)度，不加啶蟲脒溶液做空白，測(cè)定其空白值，計(jì)算值。數(shù)據(jù)采集時(shí)，拉曼光譜儀的參數(shù)設(shè)置為：激光波長(zhǎng)633 nm，激光功率為3.5 mW, 狹縫為50 μm，采集時(shí) 間為5 s。

1.2.3 電鏡樣品的制備 取1.5 mL反應(yīng)液：AC+22.93 nmol/L Apt+169.35 μg/L CDN/Ag1+0.90 mmol/L AgNO3+6.45 mmol/L trisodium citrate+80 ℃+20 min(其中啶蟲脒濃度分別為0、286.04、429.05 nmol/L)放入2 mL離心管中于7000 r/min下離心10 min，取上清液，加水定容至1.5 mL，超聲15 min。重復(fù)上述離心步驟兩次，加水1.5 mL進(jìn)行掃描電鏡檢測(cè)。

1.2.4 碳點(diǎn)催化反應(yīng)的SERS光譜采集 分別在5 mL具塞試管中依次加入不同濃度的CDN或CDN/Ag溶液、0.90 mmol/L AgNO3溶液和6.45 mmol/L檸檬酸三鈉溶液，用亞沸水定容到1.5 mL，80 ℃水浴反應(yīng)20 min，冰水終止反應(yīng)，加12.90 mmol/L NaCl和0.33 μmol/L VBB，測(cè)定1617 cm-1拉曼位移處的表面 增強(qiáng)拉曼散射峰強(qiáng)度。

1.2.5 啶蟲脒-Apt-碳點(diǎn)(CDN/Ag1)催化反應(yīng)的猝滅與增強(qiáng)光譜采集

1.2.5.1 猝滅光譜采集 在5 mL具塞試管中依次加入適量濃度的啶蟲脒適配體溶液、169.35 μg/L CDN/Ag1溶液，充分混勻后靜置大約5 min；然后加入0.90 mmol/L AgNO3、6.45 mmol/L檸檬酸三鈉溶液，用亞沸水定容到1.5 mL，80 ℃水浴反應(yīng)20 min；冰水終止反應(yīng)，12.90 mmol/L NaCl和0.33 μmol/L VBB。測(cè)定1617 cm-1拉曼位移處的表面增強(qiáng)拉曼散 射峰強(qiáng)度。

1.2.5.2 增強(qiáng)光譜采集 在5 mL具塞試管中依次加入適量濃度的啶蟲脒溶液、22.93 nmol/L啶蟲脒適配體溶液，混勻靜置反應(yīng)8 min；加入169.35 μg/L CDN/Ag1溶液，充分混勻后再靜置大約5 min；然后加入0.90 mmol/L AgNO3、6.45 mmol/L檸檬酸三鈉溶液，用亞沸水定容到1.5 mL，80 ℃水浴反應(yīng)20 min；冰水終止反應(yīng)，加12.90 mmol/L NaCl和0.33 μmol/L VBB。測(cè)定1617 cm-1拉曼位移處的表面增強(qiáng)拉曼散 射峰強(qiáng)度。

1.2.6 檢測(cè)條件的優(yōu)化

1.2.6.1 CDN/Ag1濃度的優(yōu)化 在5 mL具塞試管中依次加入457.67 nmol/L的啶蟲脒溶液、22.93 nmol/L啶蟲脒適配體溶液，混勻靜置反應(yīng)8 min；加入不同濃度的CDN/Ag1溶液，充分混勻后再靜置約5 min；然后加入0.90 mmol/L AgNO3、6.45 mmol/L檸檬酸三鈉溶液，用亞沸水定容到1.5 mL，80 ℃水浴反應(yīng)20 min；冰水終止反應(yīng)，加12.90 mmol/L NaCl和0.33 μmol/L VBB。測(cè)定1617 cm-1拉曼位移處的表面增強(qiáng)拉曼散射峰強(qiáng)度。不加啶蟲脒溶液做空白，測(cè)定其空白值，計(jì)算值。

1.2.6.2 檸檬酸三鈉濃度的優(yōu)化 在5 mL具塞試管中依次加入457.67 nmol/L的啶蟲脒溶液、22.93 nmol/L啶蟲脒適配體溶液，混勻靜置反應(yīng)8 min；加入169.35 μg/L CDN/Ag1溶液，充分混勻后再靜置大約5 min；然后加入0.90 mmol/L AgNO3、不同濃度的檸檬酸三鈉溶液，用亞沸水定容到1.5 mL，80 ℃水浴反應(yīng)20 min；冰水終止反應(yīng)，加12.90 mmol/L NaCl和0.33 μmol/L VBB。測(cè)定1617 cm-1拉曼位移處的表面增強(qiáng)拉曼散射峰強(qiáng)度。不加啶蟲脒溶液做空白，測(cè)定其空白值，計(jì)算值。

1.2.6.3 AgNO3濃度的優(yōu)化 在5 mL具塞試管中依次加入457.67 nmol/L的啶蟲脒溶液、22.93 nmol/L啶蟲脒適配體溶液，混勻靜置反應(yīng)8 min；加入169.35 μg/L CDN/Ag1溶液，充分混勻后再靜置約5 min；然后加入不同濃度的AgNO3溶液、6.45 mmol/L的檸檬酸三鈉溶液，用亞沸水定容到1.5 mL，80 ℃水浴反應(yīng)20 min；冰水終止反應(yīng)，加12.90 mmol/L NaCl和0.33 μmol/L VBB。測(cè)定1617 cm-1拉曼位移處的表面增強(qiáng)拉曼散射峰強(qiáng)度。不加啶蟲脒溶液做空白，測(cè)定其空白值，計(jì)算值。

1.2.6.4 Apt濃度的優(yōu)化 在5 mL具塞試管中依次加入457.67 nmol/L的啶蟲脒溶液、不同濃度的啶蟲脒適配體溶液，混勻靜置反應(yīng)8 min；加入169.35 μg/L CDN/Ag1溶液，充分混勻后再靜置約5 min；然后加入0.90 mmol/L AgNO3、6.45 mmol/L的檸檬酸三鈉溶液，用亞沸水定容到1.5 mL，80 ℃水浴反應(yīng)20 min；冰水終止反應(yīng)，加12.90 mmol/L NaCl和0.33 μmol/L VBB。測(cè)定1617 cm-1拉曼位移處的表面增強(qiáng)拉曼散射峰強(qiáng)度。不加啶蟲脒溶液做空白，測(cè)定其空白值，計(jì)算值。

1.2.6.5 NaCl濃度的優(yōu)化 在5 mL具塞試管中依次加入457.67 nmol/L的啶蟲脒溶液、22.93 nmol/L啶蟲脒適配體溶液，混勻靜置反應(yīng)8 min；加入169.35 μg/L CDN/Ag1溶液，充分混勻后再靜置大約5 min；然后加入0.90 mmol/L AgNO3、6.45 mmol/L的檸檬酸三鈉溶液，用亞沸水定容到1.5 mL，80 ℃水浴反應(yīng)20 min；冰水終止反應(yīng)，加不同濃度的NaCl和0.33 μmol/L VBB。測(cè)定1617 cm-1拉曼位移處的表面增強(qiáng)拉曼散射峰強(qiáng)度。不加啶蟲脒溶液做空白，測(cè)定其空白值，計(jì)算值。

1.2.6.6 水浴溫度的優(yōu)化 在5 mL具塞試管中依次加入457.67 nmol/L的啶蟲脒溶液、22.93 nmol/L啶蟲脒適配體溶液，混勻靜置反應(yīng)8 min；加入169.35 μg/L CDN/Ag1溶液，充分混勻后再靜置約5 min；然后加入0.90 mmol/L AgNO3、6.45 mmol/L的檸檬酸三鈉溶液，用亞沸水定容到1.5 mL，置于不同溫度下水浴反應(yīng)20 min；冰水終止反應(yīng)，加12.90 mmol/L NaCl和0.33 μmol/L VBB。測(cè)定1617 cm-1拉曼位移處的表面增強(qiáng)拉曼散射峰強(qiáng)度。不加啶蟲脒溶液做空白，測(cè)定其空白值，計(jì)算值。

1.2.6.7 水浴時(shí)間的優(yōu)化 在5 mL具塞試管中依次加入457.67 nmol/L的啶蟲脒溶液、22.93 nmol/L啶蟲脒適配體溶液，混勻靜置反應(yīng)8 min；加入169.35 μg/L CDN/Ag1溶液，充分混勻后再靜置大約5 min；然后加入0.90 mmol/L AgNO3、6.45 mmol/L的檸檬酸三鈉溶液，用亞沸水定容到1.5 mL，設(shè)置不同的水浴時(shí)間于80 ℃下進(jìn)行反應(yīng)；冰水終止反應(yīng)，加12.90 mmol/L NaCl和0.33 μmol/L VBB。測(cè)定1617 cm-1拉曼位移處的表面增強(qiáng)拉曼散射峰強(qiáng)度。不加啶蟲脒溶液做空白，測(cè)定其空白值，計(jì)算值。

1.2.6.8 VBB濃度的優(yōu)化 在5 mL具塞試管中依次加入457.67 nmol/L的啶蟲脒溶液、22.93 nmol/L啶蟲脒適配體溶液，混勻靜置反應(yīng)8 min；加入169.35 μg/L CDN/Ag1溶液，充分混勻后再靜置大約5 min；然后加入0.90 mmol/L AgNO3、6.45 mmol/L的檸檬酸三鈉溶液，用亞沸水定容到1.5 mL，80 ℃水浴反應(yīng)20 min；冰水終止反應(yīng)，加12.90 mmol/L NaCl和不同濃度的VBB。測(cè)定1617 cm-1拉曼位移處的表面增強(qiáng)拉曼散射峰強(qiáng)度。不加啶蟲脒溶液做空白，測(cè)定其空白值，計(jì)算值。

1.2.7 蔬菜樣品檢測(cè)及加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱量白菜、黃瓜、西紅柿各50 g，充分研磨后加1 mL 99.5%丙酮靜置5 min，取濾液1000 r/min離心5 min，取無(wú)色上清液，用亞沸水定容至15 mL存放于4 ℃冰箱中。采用啶蟲脒-適配體-CDN/Ag1-檸檬酸三鈉-AgNO3-NaCl-VBB體系SERS法，分別平行5次對(duì)3種蔬菜樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法原理

在80 ℃的條件下，CDN、CDN/Ag對(duì)AgNO3-檸檬酸三鈉生成銀納米粒子的反應(yīng)具有很強(qiáng)的催化作用。在一定濃度范圍內(nèi)，隨著CDN、CDN/Ag濃度的增大，其催化作用增強(qiáng)，生成高穩(wěn)定性高SERS活性的銀納米粒子增多，加入VBB后體系的SERS強(qiáng)度隨之增強(qiáng)。當(dāng)體系中存在一定濃度啶蟲脒核酸適配體時(shí)，CDN、CDN/Ag與適配體由于靜電作用相結(jié)合，其催化活性被抑制，體系的SERS強(qiáng)度減弱。加入靶分子啶蟲脒后，它與適配體發(fā)生特異性結(jié)合，形成啶蟲脒-適配體復(fù)合物而脫離CDN、CDN/Ag的表面，此時(shí)CDN、CDN/Ag得到釋放，催化作用活化，體系的SERS強(qiáng)度增強(qiáng)。隨著啶蟲脒濃度的增加，體系中游離的啶蟲脒-適配體減少，CDN、CDN/Ag濃度相對(duì)增大，催化作用增強(qiáng)，體系的SERS信號(hào)線性增強(qiáng)(圖1)。據(jù)此建立了一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏高、選擇性和重現(xiàn)性好的測(cè)定啶蟲脒的SERS新方法。

圖1 SERS測(cè)定啶蟲脒的分析原理圖Fig.1 The principle of determination of acetamiprid by SERS

2.2 掃描電鏡結(jié)果

用掃描電鏡對(duì)生成的銀納米顆粒的粒度和表面形態(tài)進(jìn)行觀察。在啶蟲脒-Apt-CDN/Ag1-檸檬酸三鈉-AgNO3體系中，當(dāng)溶液中沒(méi)有啶蟲脒時(shí)，Apt包裹碳點(diǎn)，抑制了CDN/Ag1催化檸檬酸三鈉-AgNO3反應(yīng)，反應(yīng)生成的銀納米粒子較少(平均粒徑約為30 nm，圖2A)且較分散。加入啶蟲脒后，CDN/Ag1被釋放，體系的催化作用恢復(fù)，生成了更多粒徑較大(平均粒徑約為60 nm，圖2B)且有一定聚集度的納米銀，導(dǎo)致體系SERS強(qiáng)度增強(qiáng)。隨著啶蟲脒濃度的增加，被釋放的CDN/Ag1增多，體系的催化作用增強(qiáng)，生成了更多粒徑更大(平均粒徑約為150 nm，圖2C)聚集度更強(qiáng)的納米銀。

圖2 AC-Apt-CDN/Ag1-檸檬酸三鈉-AgNO3體系SEM圖Fig.2 SEM of AC-Apt-CDN/Ag1-trisodium citrate-AgNO3 system

2.3 表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）光譜

2.3.1 碳點(diǎn)催化反應(yīng)的SERS光譜 在80 ℃水浴條件下，AgNO3-檸檬酸三鈉體系很難發(fā)生反應(yīng)。當(dāng)CDN、CDN/Ag催化劑存在的情況下，能很快催化檸檬酸三鈉還原AgNO3生成有SERS活性的黃色納米銀，加入VBB后，體系在1617 cm-1處出現(xiàn)較強(qiáng)的特征拉曼峰，并隨著CDN、CDN/Ag濃度的增加，CDN、CDN/Ag催化性能增強(qiáng)，體系的SERS信號(hào)增強(qiáng)(圖3)。其中，CDN/Ag1的催化作用最強(qiáng)(圖4，當(dāng)CDN、CDN/Ag0.5、CDN/Ag1、CDN/Ag1.5的 濃 度 均 為270.96 μg/L時(shí)，其在1617 cm-1處的SERS強(qiáng)度分別為2748、1980、4273、3330 cps，因此以CDN/Ag1作為催化劑。

圖3 CDN/CDN/Ag-AgNO3-檸檬酸三鈉-NaCl-VBB SERS光譜Fig.3 SERS spectra of CDN/CDN/Ag-AgNO3-trisodium citrate- NaCl-VBB

圖4 CDN/CDN/Ag-AgNO3-檸檬酸三鈉-NaCl-VBB SERS光譜Fig.4 SERS spectra of CDN/CDN/Ag-AgNO3-trisodium citrate-NaCl-VBB

2.3.2 啶蟲脒-Apt-碳點(diǎn)(CDN/Ag1)催化反應(yīng)的猝滅與增強(qiáng)機(jī)制 由圖5可知，隨著適配體濃度的增加，體系的SERS強(qiáng)度降低。這是由于CDN/Ag1具有良好的生物相容性，在CDN/Ag1-AgNO3-檸檬酸三鈉-NaCl-VBB催化體系中加入啶蟲脒適配體，CDN/Ag1表面很快被適配體包裹，使其與AgNO3-檸檬酸三鈉的接觸面積大大減小，致使其催化活性受到抑制，反應(yīng)生成的納米銀減少，SERS強(qiáng)度降低。其中，在3.82～45.86 nmol/L濃度范圍內(nèi)，啶蟲脒適配體對(duì)CDN/Ag1催化活性的抑制作用逐漸增強(qiáng)。當(dāng)體系中加入啶蟲脒時(shí)，啶蟲脒與適配體發(fā)生特異性結(jié)合，逐漸釋放出CDN/Ag1，體系催化作用恢復(fù)，體系的SERS強(qiáng)度增強(qiáng)(圖6)。啶蟲脒在14.30～457.67 nmol/L濃度范圍內(nèi)，CDN/Ag1催化的SERS強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。

圖5 Apt- CDN/Ag1- AgNO3-檸檬酸三鈉-NaCl-VBB體系SERS光譜Fig.5 SERS spectra of Apt- CDN/Ag1-AgNO3-trisodium citrate-NaCl-VBB system

圖6 AC-Apt- CDN/Ag1- AgNO3-檸檬酸三鈉-NaCl-VBB體系SERS光譜Fig.6 SERS spectra of AC-Apt- CDN/Ag1- AgNO3- trisodium citrate-NaCl-VBB system

2.4 檢測(cè)條件的優(yōu)化

在水浴溫度為80 ℃，反應(yīng)時(shí)間為20 min條件下對(duì)AC-Apt-碳點(diǎn)-AgNO3-檸檬酸三鈉-NaCl-VBB體系中CDN/Ag1、檸檬酸三鈉、AgNO3、Apt、NaCl濃度進(jìn)行優(yōu)化。當(dāng)其濃度分別為169.35 μg/L、6.45 mmol/L、0.90 mmol/L、22.93 nmol/L、12.9 mmol/L時(shí)，體系達(dá)到最大值(圖7、圖8、圖9、圖10、圖11的分別為2228、2096、2588、1671、1129 cps)。故實(shí)驗(yàn)最后選取CDN/Ag1濃度為169.35 μg/L，AgNO3濃度為0.90 mmol/L，檸檬酸三鈉濃度為6.45 mmol/L，Apt濃度為22.93 nmol/L，NaCl濃度為12.9 mmol/L。在優(yōu)化完以上條件的情況下，對(duì)水浴溫度和時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。當(dāng)水浴溫度為80 ℃、反應(yīng)時(shí)間為20 min時(shí)，體系達(dá)到最大值(圖12、圖13的分別為1960、1775 cps)，故選反應(yīng)溫度為80 ℃，反應(yīng)時(shí)間為20 min。最后對(duì)探針?lè)肿舆M(jìn)行優(yōu)化。當(dāng)VBB濃度在0.323 μmol/L時(shí)，體系達(dá)到最大值(圖14的為1682 cps)，故選取VBB濃度為0.323 μmol/L。

圖7 CDN/Ag1濃度對(duì)AC-Apt- CDN/Ag1-AgNO3-檸檬酸三鈉-NaCl-VBB體系的影響Fig.7 Effect of CDN/Ag1 concentration on AC- Apt-CDN/Ag1-AgNO3-trisodium citrate-NaCl-VBB system

圖8 檸檬酸三鈉濃度對(duì)AC-Apt-CDN/Ag1-AgNO3-檸檬酸三鈉-NaCl-VBB體系的影響Fig.8 Effect of trisodium citrate concentration on AC-Apt-CDN/Ag1-AgNO3-trisodium citrate-NaCl-VBB system

圖9 AgNO3濃度對(duì)AC-Apt-CDN/Ag1-AgNO3-檸檬酸三鈉-NaCl-VBB體系的影響Fig.9 Effect of AgNO3 concentration on AC-Apt-CDN/Ag1-AgNO3-trisodium citrate-NaCl-VBB system

圖10 Apt濃度對(duì)AC-Apt-CDN/Ag1-AgNO3-檸檬酸三鈉-NaCl-VBB體系的影響Fig.10 Effect of Apt concentration on AC-Apt-CDN/Ag1-AgNO3-trisodium citrate-NaCl-VBB system

圖11 NaCl濃度對(duì)AC-Apt-CDN/Ag1-AgNO3-檸檬酸三鈉-NaCl-VBB體系的影響Fig.11 Effect of NaCl concentration on AC-Apt-CDN/Ag1-AgNO3-trisodium citrate-NaCl-VBB system

圖12 溫度對(duì)AC-Apt-CDN/Ag1-AgNO3-檸檬酸三鈉-NaCl-VBB體系的影響Fig.12 Effect of temperature on AC-Apt-CDN/Ag1-AgNO3-trisodium citrate-NaCl-VBB system

圖13 時(shí)間對(duì)AC-Apt- CDN/Ag1-AgNO3-檸檬酸三鈉-NaCl-VBB體系的影響Fig.13 Effect of time on AC- Apt-CDN/Ag1-AgNO3-trisodium citrate-NaCl-VBB system

圖14 VBB濃度對(duì)AC-Apt-CDN/Ag1-AgNO3-檸檬酸三鈉-NaCl-VBB體系的影響Fig.14 Effect of VBB concentration on AC- Apt-CDN/Ag1-AgNO3-trisodium citrate-NaCl-VBB system

2.5 工作曲線

根據(jù)試驗(yàn)方法，對(duì)適配體-CDN/Ag1-檸檬酸三鈉-AgNO3-NaCl-VBB體系，以啶蟲脒(nmol/L)對(duì)繪制工作曲線。結(jié)果表明，啶蟲脒在14.30～457.67 nmol/L范圍內(nèi)與呈線性關(guān)系，其回歸線性方程為6.9714x+21.094，決定系數(shù)R2=0.9967，檢出限為10.03 nmol/L。

2.6 干擾離子的影響

按實(shí)驗(yàn)方法考察了常見離子、啶蟲脒共施農(nóng)藥和結(jié)構(gòu)相似農(nóng)藥對(duì)啶蟲脒-適配體-CDN/Ag1-檸檬酸三鈉-AgNO3-NaCl-VBB體系SERS法測(cè)定85.80 nmol/L啶蟲脒的干擾情況。從表1中可以看出，8.580 μmol/L Mg2+、Na+、Cu2+、Zn2+、Al3+、Ba2+、Fe3+、K+、NH4+、CO32-、NO3-、SO42-、Cl-、HCO32-不干擾測(cè)定，6.864 μmol/L Ca2+不干擾測(cè)定，8.580 μmol/L多菌靈、吡蟲啉、特拉津、毒死蜱不干擾測(cè)定；丙酮作為啶蟲脒的溶劑，在濃度為8.580 μmol/L時(shí)也不干擾測(cè)定。以上說(shuō)明，該方法具有較好的選擇性。

表1 常見干擾物質(zhì)的影響Table 1 Effect of common interfering substances

2.7 樣品分析

蔬菜樣品檢測(cè)及加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，小白菜、西紅柿、黃瓜不同樣品回收為98.27%～101.78%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.31%、0.83%和1.69%，說(shuō)明建立的方法檢測(cè)結(jié)果精密度高，重復(fù)性好。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果Table 2 Results of sample determination

2.8 啶蟲脒檢測(cè)方法的比較

啶蟲脒檢測(cè)方法的比較結(jié)果如表3所示。相比其他方法，本方法具有操作方便、靈敏度較高、選擇性好的優(yōu)點(diǎn)，線性范圍為14.30～457.67 nmol/L，檢出限低至10.03 nmol/L。

表3 啶蟲脒檢測(cè)方法的比較Table 3 The comparison of detection methods of acetamiprid

3 結(jié)論

在80 ℃水浴條件下，AgNO3-檸檬酸三鈉很難發(fā)生反應(yīng)。該體系在CDN/Ag1納米酶的催化作用下，反應(yīng)迅速發(fā)生，生成了高穩(wěn)定性、高SERS活性的黃色銀納米粒子(AgNP)。在體系中加入VBB探針?lè)肿雍?，有較強(qiáng)的SERS峰。適配體通過(guò)物理靜電等作用吸附在CDN/Ag1納米酶表面，阻斷了其與反應(yīng)物的結(jié)合，抑制了其催化作用。當(dāng)加入啶蟲脒之后，啶蟲脒可與適配體特異性結(jié)合，形成非常穩(wěn)定的啶蟲脒-適配體復(fù)合物而脫離CDN/Ag1表面，CDN/Ag1催化作用恢復(fù)，導(dǎo)致體系的SERS強(qiáng)度線性增強(qiáng)。據(jù)此，建立了適配體調(diào)控CDN/Ag1催化檸檬酸三鈉-AgNO3反應(yīng)檢測(cè)范圍為14.30～457.67 nmol/L啶蟲脒的SERS新方法。該方法用于檢測(cè)小白菜、黃瓜和西紅柿中的痕量啶蟲脒，回收率在98.27%～101.78%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.31%、0.83%和1.69%。