唐雅園，何雪梅，孫 健，游向榮，李昌寶，劉國(guó)明，盛金鳳，李 麗，周 葵，易 萍，韋 珍，零東寧，唐 杰

(廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣西果蔬貯藏與加工新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530007)

硒作為人體必需的15種微量元素之一。經(jīng)現(xiàn)代流行病學(xué)調(diào)查及病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，人類多種疾病(如癌癥、心血管病等)的發(fā)生、發(fā)展都與人體缺硒密切相關(guān)[1-2]。硒元素的抗氧化活性是其重要的生物功能活性之一，多以硒酶和硒蛋白(例如谷胱甘肽過氧化物酶、硒代半胱氨酸)形態(tài)發(fā)揮作用[3-4]。

大米是我國(guó)人民的傳統(tǒng)主食，其硒含量和形態(tài)與人體硒營(yíng)養(yǎng)狀況關(guān)系非常密切。大米對(duì)硒具有一定的生物富集作用，可將吸收的無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒。在富硒大米中，硒幾乎不存在脂質(zhì)中，少量以無機(jī)硒形式存在(約占總硒的2%)[5]；硒主要以有機(jī)硒形式存在，且超過總硒的50%結(jié)合于水溶性蛋白、鹽溶性蛋白、醇溶性蛋白及堿溶性蛋白，因此，硒蛋白是富硒大米中硒的主要儲(chǔ)存形態(tài)[6]。硒可顯著提高谷類作物蛋白(如硒化大米蛋白[7]、硒化糯米蛋白[8]、硒化高粱蛋白[9]等)的抗氧化活性。從富硒大米的堿溶性蛋白中酶解出一種硒多肽，具有體內(nèi)抗氧化活性[10]。從富硒大米的水溶性蛋白中分離出兩種硒多肽，也具有一定抗氧化和神經(jīng)保護(hù)能力[11]。目前，富硒大蒜、富硒花生、富硒靈芝等農(nóng)產(chǎn)品中不同溶解性的硒蛋白的理化特性及其抗氧化活性均有相關(guān)研究報(bào)道[12-14]；而富硒大米中不同溶解性的硒蛋白的理化特性及其抗氧化活性的研究鮮見報(bào)道。

本文以產(chǎn)于廣西高硒地區(qū)的富硒大米為原料，根據(jù)不同溶解性提取硒蛋白，對(duì)其理化特性進(jìn)行研究，并結(jié)合體外試驗(yàn)研究其抗氧化活性，以期為富硒大米中硒蛋白的進(jìn)一步研究和開發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)理論依據(jù)，對(duì)增加富硒大米附加值、開發(fā)天然有機(jī)硒補(bǔ)劑具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

富硒大米 廣西省貴港市港南區(qū)高硒大田；甲基硒代半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、硒代半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物科技有限公司；硒代甲硫氨酸標(biāo)準(zhǔn)品 上海麥克林生化科技有限公司；胃蛋白酶XIV(酶活力≥10000 U/g) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國(guó)Sigma公司；總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所。

3-18ks型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；Genesys 10s型紫外-可見光分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Agilent 7700X型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀 美國(guó)Agilent Technologies公司；5200Multi型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng) 上海天能科技有限公司；DYCZ-25E型電泳儀 北京六一生物科技有限公司；Nicolet iS50型傅里葉紅外光譜儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Agilent 1290-6460型液相色譜儀質(zhì)譜儀 美國(guó)Agilent Technologies公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大米粉制備 富硒大米于烘箱中50 ℃干燥8 h，用實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的粉碎機(jī)磨粉后過80目篩，用塑料袋雙層密閉低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 硒蛋白制備 采用Osborne法[15]，對(duì)富硒大米蛋白進(jìn)行分級(jí)提取，制備富硒大米中的水溶性硒蛋白(WSP)、鹽溶性硒蛋白(SSP)、醇溶性硒蛋白(ESP)和堿溶性硒蛋白(ASP)。按照料液比1∶14(g/mL)向富硒大米中加入蒸餾水，45 ℃攪拌3 h；離心15 min后取上清液(沉淀①用于下一步分離)，用0.1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)到WSP等電點(diǎn)pH4.0；離心后取沉淀，經(jīng)清水洗滌、冷凍干燥后得到WSP。采用3%氯化鈉稀溶液為溶劑處理上一步剩余的沉淀①，料液比1∶10(g/mL)，45 ℃攪拌2 h；離心后取上清液(沉淀②用于下一步分離)，用0.1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)到SSP等電點(diǎn)pH4.3；離心后取沉淀，經(jīng)清水洗滌、冷凍干燥后得到SSP。采用75%乙醇為溶劑處理上一步的剩余沉淀②，料液比1∶10(g/mL)，45 ℃攪拌2 h；離心后取上清液(沉淀③用于下一步分離)，用0.1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)到ESP等電點(diǎn)pH 5.5；離心后取沉淀，經(jīng)清水洗滌、冷凍干燥得到ESP。采用稀氫氧化鈉溶液為溶劑處理上一步剩余的沉淀③，料液比1∶8(g/mL)，調(diào)節(jié)溶液pH=9，45 ℃攪拌1.5 h；離心后取上清液，用0.1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)到ASP等電點(diǎn)pH4.6；離心后取沉淀，經(jīng)清水洗滌、冷凍干燥后得到ASP。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量分析 采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[16]。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，在595 nm波長(zhǎng)下測(cè)定富硒大米中各類蛋白的吸光度。

1.2.4 總硒含量測(cè)定 采用電感耦合等離子質(zhì)譜(ICP-MS)法[17]測(cè)定富硒大米中各類蛋白的硒含量。稱取一定量的蛋白樣品放入石墨消解管中，按照料液比1∶6(g/mL)加入濃硝酸和30%過氧化氫(體積比8∶1，v/v)混合液。室溫下放置15 min后，將樣品消解管放置于石墨消解儀中加熱消解。石墨消解儀升溫時(shí)間為20 min，在160 ℃下密閉恒溫消解30 min。消解完畢后，冷卻至室溫。將樣品消解液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用超純水定容，混合均勻待測(cè)。同時(shí)，以超純水做空白對(duì)照。使用硒同位素82Se繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=417.5464x+112.6577，R2>0.99)，儀器參數(shù)如表1所示。

表1 ICP-MS儀器運(yùn)行參數(shù)Table 1 Operating parameters of ICP-MS

1.2.5 硒蛋白的亞基分子量分布測(cè)定 采用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法[18]。使用的濃縮膠和分離膠質(zhì)量濃度分別為4%和14%。將不同硒蛋白樣品(蛋白濃度約為5 mg/mL)與5X蛋白上樣緩沖液按4∶1比例混合，于沸水浴中加熱10 min后以10000 r/min離心10 min。分別將20 μL不同硒蛋白樣品和蛋白Marker注入樣孔中。電泳初始時(shí)設(shè)置電壓80 V，待硒蛋白樣品進(jìn)入分離膠時(shí)電壓增加到120 V，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑遷移到靠近凝膠板底部時(shí)，停止電泳。固定液固定30 min后，用0.05%考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色30 min，用脫色液脫色直至蛋白條帶清晰為止。最后將脫色后的凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行分析。蛋白Marker的分子量范圍是10～170 kDa。

1.2.6 紫外掃描光譜分析 參照程利增[19]的方法，將干燥后的不同硒蛋白樣品在緩沖液中溶解，配制成蛋白濃度為0.5 mg/mL。采用紫外-可見光分光光度計(jì)在190～900 nm范圍掃描樣品，得到紫外-可見掃描光譜。

1.2.7 傅里葉紅外光譜(FT-IR)分析 參照藍(lán)蔚青等[20]的方法，稱取干燥后的不同硒蛋白樣品與KBr粉末在瑪瑙研缽中充分研磨混勻，壓制成薄片，用傅立葉紅外光譜儀在4000～500 cm-1波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描，Omnic 8.2軟件繪制紅外光譜圖并進(jìn)行對(duì)比分析。

1.2.8 硒代氨基酸組成分析 采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)法[21]對(duì)富硒大米ASP的硒代氨基酸進(jìn)行定性和定量分析。稱取適量蛋白樣品，依次加入30 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液5 mL和20 mg胃蛋白酶XIV，渦旋混勻，放于37 ℃恒溫箱中孵育24 h[22]，酶解后以10000 r/min離心10 min，取上清液過0.45 μm濾膜上機(jī)測(cè)定。色譜柱為Waters T3(2.1 mm×100 mm，3 μm)；流動(dòng)相為(A)0.1%甲酸水溶液和(B)乙腈；流速為0.3 mL/min；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為5 μL；采集模式為ESI+。洗脫梯度為0 min，95%A；0.5 min，95%A；5 min，50%A；6 min，0%A；7 min，0%A；7.1 min，95%A；8.5 min，95%A。

1.2.9 硒蛋白的抗氧化活性分析

1.2.9.1 總抗氧能力(T-AOC)測(cè)定 體外總抗氧化能力采用Fe3+還原試劑盒測(cè)定，大米硒蛋白中的抗氧化成分能使Fe3+還原成Fe2+，而后者可與菲啉類物質(zhì)形成穩(wěn)固的絡(luò)合物[23-24]。大米硒蛋白總抗氧化能力參照試劑盒使用說明進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.9.2 1,1-二苯基苦酰基苯肼(DPPH)自由基清除能力測(cè)定 參考Tang等[25]的方法，移取2 mL不同濃度硒蛋白樣品或無水乙醇，加入2 mL的DPPH溶液，渦旋混勻，避光靜置于室溫30 min后，于517 nm處測(cè)定吸光度值。DPPH自由基清除率按公式(1)計(jì)算：

式中，Ao為DPPH溶液吸光度值；Ai為DPPH溶液和硒蛋白樣品溶液的混合溶液的吸光度值；Aj為硒蛋白樣品溶液的吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均測(cè)定3次，并以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。采用IBM SPSS Statistics 26軟件進(jìn)行方差分析、顯著性差異分析及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 富硒大米中不同硒蛋白的蛋白含量和硒含量比較

采用考馬斯亮藍(lán)法和ICP-MS法分別測(cè)定富硒大米中不同硒蛋白的蛋白含量和硒含量。由表2可知，ASP是富硒大米硒蛋白中最主要的蛋白質(zhì)。不同溶解性的大米蛋白的硒含量依次為ASP>WSP>ESP>SSP。其中，ASP硒含量約為WSP、ESP和SSP硒含量的1.5、6.0和7.1倍。張濤等[26]研究也表明堿溶性蛋白提取液的硒含量占總硒含量的48%，是富硒大米中主要的硒蛋白形式。由于ESP提取率過低，故后面的研究主要集中于WSP、SSP和ASP這3種蛋白。

表2 不同硒蛋白的蛋白含量、硒含量的比較Table 2 The comparsion of protein and selenium contents of different Se-proteins

2.2 富硒大米中不同硒蛋白的SDS-PAGE分子量及亞基組成比較

采用SDS-PAGE法研究富硒大米中不同硒蛋白分子量的分布及亞基組成，結(jié)果如圖1所示。分析比較WSP、SSP和ASP的SDS-PAGE電泳圖，由圖1可以看出，不同硒蛋白的亞基條帶不同，說明其亞基組成有一定差異，因此所包含的亞基結(jié)構(gòu)也不相同。根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的分布，WSP主要亞基分布在19.69 kDa；SSP分子量范圍是15.33～55.12 kDa，主要亞基分布在19.10和15.33 kDa；而ASP未見主要亞基條帶，說明ASP可能具有更小的亞基分子量。這可能是因?yàn)锳SP在提取過程中堿溶液對(duì)蛋白破壞較大，小分子蛋白增多。小分子蛋白在一定程度上更有利于人體的消化吸收[27]。

圖1 富硒大米中不同硒蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE analysis of different Se-proteins from selenium-enriched rice

2.3 富硒大米中不同硒蛋白的紫外-可見光光譜分析

富硒大米中3種硒蛋白(WSP、SSP和ASP)在190～900 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，其結(jié)果如圖2所示。WSP、SSP和ASP均在190～400 nm范圍內(nèi)有較強(qiáng)的吸收峰。根據(jù)紫外吸收峰的位置，可將大米硒蛋白的紫外-可見光光譜圖分成2個(gè)區(qū)域。3種硒蛋白在238 nm附近均有較大吸收峰，此吸收峰來源于大米硒蛋白中所含的肽鍵；在280 nm附近有一較弱的肩峰，此吸收峰來源于大米硒蛋白中所含的芳香族氨基酸(苯丙氨酸、絡(luò)氨酸、色氨酸)[28]。

圖2 富硒大米中不同硒蛋白的紫外-可見光光譜圖Fig.2 UV-Vis spectra of different Se-proteins from selenium-enriched rice

2.4 富硒大米中不同硒蛋白的紅外光譜分析

傅立葉紅外光譜(FT-IR)是分析蛋白結(jié)構(gòu)的常用手段之一。富硒大米WSP、SSP和ASP在4000～500 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜分析掃描，其結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，3種富硒大米蛋白的紅外光譜圖線基本相似。在波數(shù)3300 cm-1附近出現(xiàn)較強(qiáng)的吸收峰，這是由于酰胺基團(tuán)中的N-H和分子間、分子內(nèi)的-OH的伸縮振動(dòng)所引起的。在波數(shù)2920 cm-1附近出現(xiàn)的吸收峰是飽和碳C-H伸縮振動(dòng)而產(chǎn)生的。在波數(shù)1650 cm-1左右出現(xiàn)窄而尖的吸收峰屬于酰胺I帶，是由C=O的伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的，是蛋白質(zhì)的特征譜帶；在波數(shù)1530 cm-1附近有相對(duì)較弱的吸收峰，此為酰胺II帶，由硒蛋白分子中的N-H伸縮振動(dòng)引起，也是蛋白質(zhì)的特征譜帶[29]。在波數(shù)1035 cm-1附近出現(xiàn)的吸收峰屬于S-O的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰。此外，在680～770 cm-1間有特征峰為對(duì)稱環(huán)伸縮振動(dòng)引起的，可能有Se=O或C-Se結(jié)構(gòu)[30]。

圖3 富硒大米中不同硒蛋白的紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectra of different Se-proteins from selenium-enriched rice

2.5 富硒大米中堿溶性硒蛋白的硒代氨基酸組成分析

通過對(duì)富硒大米及其副產(chǎn)物的研究發(fā)現(xiàn)，水稻從外環(huán)境中吸收的無機(jī)硒(Se(VI)和Se(IV))通常先轉(zhuǎn)化為硒代半胱氨酸(Selenocysteine，SeCys)，再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為硒代甲硫氨酸(Selenomethionine，SeMet)、甲基硒代半胱氨酸(Methylselenocysteine，MeSeCys)等其他有機(jī)硒的形態(tài)[31]，其中SeCys是第21種編碼氨基酸，而SeMet能夠非特異性替代甲硫氨酸殘基存在于蛋白分子中[32]。因此，SeMet、SeCys和MeSeCys這三種氨基酸是富硒大米中主要的硒代氨基酸類型，而目前市面上硒代氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品較少，SeMet、SeCys和MeSeCys標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性較高。另外，通過對(duì)WSP、SSP和ASP的理化特性和功能活性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)相較于其他硒蛋白，ASP是富硒大米中主要的蛋白成分，且含硒量最高，抗氧化能力也最強(qiáng)。因此，本研究主要針對(duì)大米ASP中的這3種硒代氨基酸進(jìn)行定性和定量分析。

本研究采用1種非特異性蛋白水解酶斷開ASP蛋白鏈中的肽鍵[22]，使之盡可能完全水解，用色譜與質(zhì)譜在線聯(lián)用分析其中的硒代氨基酸，確定大米ASP中與蛋白結(jié)合的硒形態(tài)，結(jié)果見圖4。通過MRM模式進(jìn)行檢測(cè)，選擇質(zhì)核比m/z 56.1、181.0、198.0，m/z 88.1、247.7、337.1和m/z 94.9、166.9、184.2分別作為SeMet、SeCys和MeSeCys的特征離子對(duì)。同時(shí)，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖可知SeMet、SeCys和MeSeCys的保留時(shí)間分別是1.968、1.045和1.427 min。結(jié)果表明，ASP中存在3種硒代氨基酸，其中SeCys含量為(300.22±6.88)ng/g，MeSeCys含量為(170.19±2.87) ng/g，而SeMet含量低于50 ng/g。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)可知植物中的硒主要是和甲硫氨酸結(jié)合[33-34]，但在ASP酶解液中僅發(fā)現(xiàn)少量SeMet，可能是由于它在酶解過程中被氧化。

圖4 富硒大米ASP中3種硒代氨基酸的色譜圖和質(zhì)譜圖Fig.4 LC-MS chromatograms of three seleno-amino acids in ASP from selenium-enriched rice

2.6 富硒大米中不同硒蛋白的抗氧化活性比較

2.6.1 總抗氧化能力(T-AOC) 由圖5可知，富硒大米中WSP、SSP、ASP和VC(對(duì)照)對(duì)Fe3+均有一定的還原力，且隨著濃度的增加而呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。不同硒蛋白的T-AOC強(qiáng)弱順序?yàn)锳SP>WSP>SSP，而VC的T-AOC總體高于硒蛋白。

2.6.2 DPPH自由基清除能力 如圖6所示，富硒大米中WSP、SSP、ASP與VC(對(duì)照)均具有一定的DPPH自由基清除能力。不同硒蛋白的清除能力與其濃度均呈正相關(guān)性，而VC對(duì)DPPH自由基的清除率隨著濃度的增加基本保持不變。相同濃度下，ASP對(duì)DPPH自由基的清除率明顯高于其他2種蛋白。當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?0 mg/mL時(shí)，WSP、SSP、ASP及VC對(duì)DPPH自由基的清除率分別為30.73%、24.77%、65.20%、97.11%。

圖6 富硒大米中不同硒蛋白的DPPH自由基清除能力Fig.6 DPPH free radical scavenging capacity of different Se-proteins from selenium-enriched rice

2.6.3 富硒大米中硒蛋白抗氧化活性與其硒含量的相關(guān)性分析 為確定WSP、SSP和ASP的抗氧化活性與其硒含量之間的相關(guān)性，分析了二者之間的皮爾遜(Pearson)相關(guān)系數(shù)。從表3可以看出，3種硒蛋白抗氧化活性和其硒含量之間的相關(guān)性均表現(xiàn)為極顯著的正相關(guān)性(P<0.01)，表明硒蛋白中的硒對(duì)其抗氧化作用具有顯著增強(qiáng)作用。由此可見，富硒大米硒蛋白具有的抗氧化活性源于其含有具有抗氧化能力的硒元素或含有較高含量具有抗氧化活性的硒代氨基酸。此結(jié)果與Zeng等[35]的研究一致。

表3 富硒大米中硒蛋白抗氧化活性與其硒含量的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of antioxidant activities and selenium contents in Se-proteins from selenium-enriched rice

3 結(jié)論

以富硒大米為原料，對(duì)3種不同溶解性的大米硒蛋白的理化特性及其抗氧化活性進(jìn)行了研究。硒蛋白是富硒大米中最重要的含硒成分，其中堿溶性蛋白中硒含量最高。3種大米硒蛋白的蛋白分子量和亞基條帶不同，表明其亞基組成和結(jié)構(gòu)均有一定差異，其中堿溶性硒蛋白以小分子蛋白為主。3種硒蛋白的紫外及紅光光譜圖線基本相似，并未觀察到特殊的特征峰。分析大米堿溶性硒蛋白酶解產(chǎn)物中的硒代氨基酸發(fā)現(xiàn)，除硒代半胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸外還含有少量硒代甲硫氨酸。此外，3種大米硒蛋白的總抗氧化能力、DPPH自由基清除能力與樣品濃度之間呈良好的量效關(guān)系，其抗氧化活性從強(qiáng)到弱為堿溶性硒蛋白>水溶性硒蛋白>鹽溶性硒蛋白。這3種大米硒蛋白抗氧化活性與其硒含量之間的相關(guān)性分析表明，二者之間存在極顯著正相關(guān)性(P<0.01)。綜上，大米中堿溶性硒蛋白是進(jìn)一步純化和研究較為理想的提取物，對(duì)天然有機(jī)硒補(bǔ)劑的開發(fā)有潛在的應(yīng)用價(jià)值。